趙昱,李靜媛,解萬翠,趙宏偉*

1(青島科技大學(xué) 海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院,山東 青島,266045) 2(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島,266109)

葡萄酒自然發(fā)酵過程中微生物因葡萄園管理、土壤類型、光照、降水量等自然因素的影響而存在顯著差異[1-3],導(dǎo)致不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒口感、風(fēng)味不同。國內(nèi)對釀酒葡萄表皮微生物的研究日益增多[2,4-6]。高通量測序技術(shù)又稱下一代測序(next-generation sequencing,NGS)技術(shù),是目前應(yīng)用最普遍的測序技術(shù),對微生物的群落結(jié)構(gòu)分析具有獨特的優(yōu)勢[7],一次可以對十幾萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定,克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)及分子鑒定方法的缺陷,可為微生物群落組成提供更準確和詳細的分析,并在改善微生物資源開發(fā)和食品安全方面作出了巨大的貢獻。

目前,相較于國際上著名葡萄酒產(chǎn)地微生物的研究而言,我國雖然葡萄栽培區(qū)域廣闊,但對于不同產(chǎn)區(qū)葡萄表面微生物群落的分析研究一直處于空白。隨著中國葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,探究不同產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄表皮微生物的多樣性,對選育產(chǎn)區(qū)特色發(fā)酵菌株,提升中國葡萄酒的品質(zhì)及國際影響力具有深遠意義。本研究利用NGS技術(shù)對比研究了寧夏賀蘭山、河北懷來、山東蓬萊、山東青島4個產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄表皮微生物的組成和多樣性,以期為我國著名產(chǎn)區(qū)釀酒微生物資源庫的建設(shè)以及提高葡萄酒品質(zhì)等方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄：寧夏賀蘭山(nxcs)、山東蓬萊(plcs)、山東青島(qdcs)、河北懷來(hbcs) 產(chǎn)區(qū)葡萄園中的赤霞珠(Cabernet Sauvignon) 釀酒葡萄品種,樣品分別于2019年9月采樣。從1株葡萄樹的上、中、下3個部位采樣。

聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸 (ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、氯化鈉及其他試劑均為分析純。

TENP緩沖液：50 mmol/L的Tris,20 mmol/L的EDTA,100 mmol/L的氯化鈉,0.01 g/mL的PVP(pH 10),調(diào)pH至10。

磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS,pH7.4)：在800 mL蒸餾水中溶解8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4,用HCl溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4,加水定容至1 L,在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。保存于室溫,待用。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理[8]

(1)樣品由于自然環(huán)境,葡萄表面復(fù)雜成分的影響,在微生物總DNA提取前需要對樣品進行預(yù)處理,分離多糖、色素、多酚類等雜質(zhì)。取適量葡萄原料,在無菌條件下將葡萄果皮取下,準確稱取不同產(chǎn)區(qū)的釀酒葡萄果皮8 g,分別加入到50 mL無菌離心管中并標記A,加入12 mL TENP緩沖液,渦旋振蕩5 min后3 000×g離心5 min,轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中并標記B。(2)吸取12 mL TENP緩沖液到離心管A,渦旋振蕩5 min,3 000×g離心5 min后轉(zhuǎn)移上清液至離心管B中。(3)在離心管A中加入6 mL PBS溶液,渦旋振蕩5 min,3 000×g離心5 min,轉(zhuǎn)移上清液至離心管B中,將離心管B以9 000×g離心10 min,棄去上清液,沉淀物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA的提取

釀酒葡萄表皮微生物DNA采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒進行提取。

1.2.3 樣品PCR

第一輪擴增前利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量,以確定PCR反應(yīng)體系中應(yīng)加入的 DNA量。真菌DNA進行PCR所用引物是已經(jīng)融合了測序平臺的通用引物ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)；細菌DNA 進行PCR所用的引物為測序通用引物Nobar_341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和Nobar_805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。

取2×Hieff?Robust PCR 預(yù)混液15 μL、正向測序引物和反向測序引物各1 μL、10～20 ng模板DNA、9～12 μL H2O,配制總體積為30 μL的 PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s,45 ℃退火20 s,65 ℃延伸30 s,反應(yīng)5個循環(huán)；94 ℃變性20 s,55 ℃ 退火20 s,72 ℃延伸30 s,反應(yīng)20個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

對第一輪PCR擴增質(zhì)檢合格的產(chǎn)物進行第二輪Illumina橋式PCR,用于測序文庫的構(gòu)建,反應(yīng)體系為：15 μL 2×Hieff?Robust PCR預(yù)混液、1 μL Index-PCR Primer F、1 μL Index-PCR Primer R、20～30 ng PCR 擴增產(chǎn)物、9～12 μL H2O,總體積為30 μL。

擴增樣品振蕩混勻后短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。將PCR管置于PCR儀中進行擴增,PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性20 s,55 ℃ 退火20 s,72 ℃延伸30 s,反應(yīng)5個循環(huán)；72 ℃延伸 5 min,得到的產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 高通量測序[9]

PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行真菌ITS序列的ITS1-ITS2區(qū)間、細菌16S rRNA基因 V3-V4區(qū)域文庫的構(gòu)建,之后應(yīng)用Illumina Misq測序平臺進行分析。

1.3 數(shù)據(jù)預(yù)處理

將測序得到的原始數(shù)據(jù)進行預(yù)處理,過濾去除引物和接頭序列、非特異性擴增序列及嵌合體,以保證最終用于操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)分析的數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 OTU聚類分析

采用Usearch軟件,將所有樣本序列按照序列間的距離進行聚類,后根據(jù)序列之間的相似性將序列分成不同的OTU。通常在低于97%的相似水平的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析。

在OTU聚類結(jié)果的基礎(chǔ)上,獲取每1個OTU聚類中的代表性序列。選擇豐富度最高的序列作為代表性序列,使用R軟件的VennDiagram package數(shù)據(jù)包繪制韋恩圖。

1.4.2 Alpha多樣性分析

通過對樣品的多樣性分析能夠反映微生物群落的豐度和多樣性,主要包括Chao1、Shannon和Simpson；并通過計算Coverage指標檢測各樣品文庫的覆蓋率,其數(shù)值越高,則樣本中序列沒有測出結(jié)果的概率越低,反映本次測序結(jié)果具有代表性。

1.4.3 微生物分類及差異性分析

對OTU數(shù)據(jù)進行整理,在門、屬的水平上對各個樣本中的真菌、細菌進行物種豐度柱形圖統(tǒng)計,分析每一個樣本物種占比并對優(yōu)勢菌屬進行分析,通0.01 g/mL過主坐標分析圖及聚類圖分析樣本間相似度。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀疏曲線

稀疏曲線用于比較不同測序數(shù)據(jù)量的樣本中物種的豐富度,同時可以說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理。當(dāng)曲線趨向平坦時,說明測序數(shù)據(jù)量合理,增大數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU,反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。如圖1顯示,細菌樣品的OTU稀疏曲線在小于12 000個序列、真菌樣品的OTU稀疏曲線在小于60 000個序列的條件下均沒有進入平臺期,繼續(xù)增加測序量,其OTU數(shù)量也會隨著增加。但隨著測序量的增加,細菌、真菌的Shannon指數(shù)稀疏曲線在測序量到達一定數(shù)值之后趨于平穩(wěn)進入平臺期。由此可知,隨著測序量的增加有可能會發(fā)現(xiàn)新的微生物種類,但微生物多樣性已經(jīng)不再隨測序量的增加而發(fā)生變化,說明測序數(shù)量足夠充分合理。因此,本研究中細菌、真菌的測序量滿足后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

a-細菌群落OTU稀疏曲線；b-細菌群落Shannon指數(shù)稀疏曲線；c-真菌群落OTU稀疏曲線；d-S真菌群落hannon指數(shù)稀疏曲線圖1 OTU稀疏曲線和Shannon指數(shù)稀疏曲線Fig.1 OTU sparse curve and Shannon exponential sparse curve

2.2 樣品中所含OTU數(shù)目分析

由圖2可知,共檢測到2 364個細菌OTU,其中,寧夏賀蘭山、山東蓬萊、河北懷來和山東青島產(chǎn)區(qū)的赤霞珠表皮細菌種類分別為531、666、626、541種；上述4個產(chǎn)區(qū)中特有的細菌種類分別為422、523、481、463種,共有的細菌種類有38種。由此可知,4個產(chǎn)區(qū)中葡萄樣品中細菌菌群結(jié)構(gòu)差異明顯,其中山東蓬萊赤霞珠葡萄表皮細菌菌種最為豐富。另外,山東蓬萊和河北懷來產(chǎn)區(qū)的赤霞珠果實表面共有的OTU數(shù)目有117個,遠高于其他產(chǎn)區(qū)間的共有細菌菌種數(shù),說明山東蓬萊與河北懷來赤霞珠表皮細菌種類相似度較大。

由圖3所示,共檢測到2 007個真菌OTU,其中,寧夏賀蘭山、山東蓬萊、河北懷來和山東青島產(chǎn)區(qū)的赤霞珠表皮真菌種類分別為460、567、504、476個；上述4個產(chǎn)區(qū)特有真菌種類分別為403、505、446、424個,共有的真菌種類有12個。由此可知,4個產(chǎn)區(qū)赤霞珠表皮真菌種類總數(shù)相差不大,但真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。

圖3 真菌群落韋恩圖Fig.3 Venn diagram of fungal community

2.3 細菌和真菌群落多樣性分析

由表1可知,經(jīng)測序后4個產(chǎn)區(qū)有效序列數(shù)分別為hbcs 10 698條、nxcs 7 846條、plcs 9 828條和qdcs 10 747條,并且所有樣品Coverage指數(shù)覆蓋率達到95%～97%,說明所測的OTU數(shù)基本能反映樣品的真實情況。Shannon值越大,說明微生物的多樣性越高,其中河北懷來赤霞珠表皮微生物的Shannon指數(shù)最大(4.18),青島樣品的Shannon指數(shù)最小(3.15),證實河北懷來赤霞珠葡萄表皮的細菌微生物多樣性最高,而青島產(chǎn)區(qū)的多樣性最小。Chao1用來估計物種總數(shù),由數(shù)據(jù)可知,hbcs、nxcs、plcs、qdcs的數(shù)值分別為4 934、5 460、7 979和9 902,表明河北懷來赤霞珠表皮細菌包含的物種總數(shù)最少,青島赤霞珠表皮細菌總數(shù)最多。Simpson指數(shù)也是表征樣品微生物多樣性的指標,數(shù)值越大,反而多樣性越低,表1數(shù)據(jù)顯示河北懷來葡萄樣品的Simpson指數(shù)最小,其余3個產(chǎn)區(qū)的樣品Simpson指數(shù)沒有顯著差異(P<0.05),再次驗證河北懷來葡萄表面微生物多樣性顯著高于其他3個產(chǎn)區(qū)。

表1 細菌群落Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity index of bacterial community

真菌菌群Alpha多樣性分析結(jié)果如表2所示,測序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控、過濾后,各產(chǎn)區(qū)樣品得到的有效序列數(shù)分別為38 019(nxcs)、55 957(plcs)、53 676(qdcs)、47 464(hbcs),且4個產(chǎn)區(qū)Coverage指數(shù)的覆蓋率都高達99%以上,說明所測的OTU數(shù)基本能反映樣品的真實情況。其中,河北懷來產(chǎn)區(qū)樣品的Shannon指數(shù)值最大(3.40),Simpson指數(shù)最小(0.07),且Chao1指數(shù)值亦最大(6 596),說明河北懷來赤霞珠表皮真菌微生物豐富度最大且微生物物種總數(shù)最多；而青島地區(qū)赤霞珠葡萄表皮微生物菌群的Shannon指數(shù)數(shù)值最小(2.17)且Simpson 指數(shù)為0.30,說明山東青島赤霞珠表皮真菌微生物豐富度最?。粚幭馁R蘭山產(chǎn)區(qū)樣品的Shannon指數(shù)為2.64,但Chao1僅為4 744,說明該地區(qū)的赤霞珠葡萄真菌多樣性較為豐富,但所含微生物總數(shù)較其他產(chǎn)區(qū)要少。

表2 真菌群落Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity index of fungal community

綜上所述,由Alpha多樣性指數(shù)分析可知,河北懷來赤霞珠表皮微生物多樣性最為豐富且所含真菌微生物數(shù)量最多；山東青島赤霞珠表皮的細菌總數(shù)最多但微生物多樣性卻最低；寧夏賀蘭山地區(qū)的赤霞珠葡萄真菌多樣性較為豐富,但葡萄表面所含的微生物總數(shù)較少。

2.4 微生物豐度分析

2.4.1 細菌豐度

由于從樣品中檢測出的細菌種類高達200多種。為了便于統(tǒng)計,本研究將物種的豐度大于1%作為劃分依據(jù),在屬水平上選擇了排名前20的優(yōu)勢細菌。由圖4-a可知,除去未分類的菌屬,苯基桿菌屬(Phenylobacterium)為河北懷來、山東青島、寧夏賀蘭山產(chǎn)區(qū)赤霞珠表皮菌群中含量最高的優(yōu)勢細菌屬,相對豐度分別為6%、15%、11%。苯基桿菌屬細菌屬于典型的土壤微生物,其特征為營養(yǎng)譜單一,不能利用大多數(shù)糖、醇,可降解除草劑Pyramin?中的成效成分氯吡嗪(Chloridazon)[10]。上述3個產(chǎn)區(qū)的葡萄園中有機農(nóng)藥的使用可能較為頻繁,經(jīng)過長期的自然選擇造就了苯基桿菌屬這一優(yōu)勢細菌屬。而從蓬萊地區(qū)樣品檢測到的優(yōu)勢的菌屬為勞爾氏菌屬(Ralstonia),相對豐度為8%。該菌能夠?qū)е路?、煙草、桑樹等植物枯萎死?俗稱“青枯病”[11]。噬幾丁質(zhì)菌屬(Chitinophaga)在4個產(chǎn)區(qū)的葡萄表面細菌群中大量存在,該菌屬為一種土壤微生物,有利于植物固氮[12]。不動桿菌屬(Acinetobacter)是一類異養(yǎng)硝化細菌,具有較強的脫氮能力,其只在河北懷來的葡萄樣品中大量存在,其他3個產(chǎn)區(qū)幾乎檢測不到。這是由于河北懷來近幾年為促進葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展,推廣了一系列促早優(yōu)質(zhì)栽培技術(shù),使用含氮磷鉀肥料較多,從而促進了該菌屬的生長[13]?？傮w而言,4個產(chǎn)區(qū)的葡萄樣品中細菌微生物菌群結(jié)構(gòu)相差不大,但特定菌屬的相對豐度差異較大,這與氣候、田間管理有直接關(guān)系[3]。

在“門”水平上,將物種的豐度大于1%作為劃分依據(jù),選擇排名前7的優(yōu)勢細菌進行分析。由圖4-b可知,變形菌門(Proteobacteria)在4個產(chǎn)區(qū)的赤霞珠葡萄表皮上均檢測到,且豐度在各樣品中均最高(約50%～70%)。此外,擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)在4個產(chǎn)區(qū)也均可檢出。由此可見,4個產(chǎn)區(qū)優(yōu)勢菌種在門水平上依舊相差不大,而相對豐度有一定差異,與前面細菌屬水平的結(jié)果保持一致。張世偉[14]研究表明,釀酒葡萄表面的優(yōu)勢菌門有變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes),本實驗結(jié)果與其大致相同。相關(guān)研究表明,厚壁菌門中大部分細菌屬于發(fā)酵型細菌,擬桿菌門是一類具有碳水化合物發(fā)酵等諸多功能的菌群[15]。綠彎菌門是一類利用CO2,通過光合作用產(chǎn)生能量的細菌,這種菌在有機質(zhì)含量較低的土壤中很有優(yōu)勢[16]。本實驗中河北懷來赤霞珠表皮中綠彎菌門相比于其他產(chǎn)區(qū)含量較高,可能是因為河北多沙質(zhì)土壤,有機質(zhì)含量低。

a-屬水平;b-門水平圖4 細菌群落屬水平和門水平相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacteria community at genus and phylum level

2.4.2 真菌豐度

從樣品中檢測出的真菌種類繁多,為了便于統(tǒng)計,本研究將物種的豐度大于1%作為劃分依據(jù),選擇排名前18的優(yōu)勢真菌屬進行分析。由圖5-a可知,在屬水平4個產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄表皮的真菌菌群結(jié)構(gòu)存在一定的差異。寧夏賀蘭山產(chǎn)區(qū)含量較高的優(yōu)勢菌屬為短梗霉屬(Aureobasidium),相對豐度為44%。山東青島和蓬萊產(chǎn)區(qū)含量較高的短梗霉屬(Aureobasidium)和紅酵母屬(Rhodotorula),相對豐度之和達到60%。河北懷來產(chǎn)區(qū)葡萄表皮真菌菌群結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜,且各真菌微生物的豐度分布較平均。魏玉潔等[2]利用高通量測序的方法發(fā)現(xiàn)葡萄果實和葉片中最豐富的真菌屬為短梗霉屬,這與本文的研究結(jié)果一致。目前,已報到與葡萄酒相關(guān)的酵母菌中紅酵母屬(Rhodotorula)容易在未成熟的漿果表面產(chǎn)生[17]。釀酒酵母屬(Saccharomyces)的微生物在4個產(chǎn)區(qū)的樣品中均出現(xiàn),但相對豐度并不高,說明葡萄果皮并非釀酒酵母屬菌株良好的生活環(huán)境。

a-屬水平;b-門水平圖5 真菌群落屬水平和門水平相對豐度Fig.5 Relative abundance of fungal community at genus and phylum level

圖5-b顯示,將物種豐度大于1%作為劃分依據(jù),4個產(chǎn)區(qū)最具有優(yōu)勢的菌門為子囊菌門(Ascomycota),寧夏賀蘭山、山東青島、蓬萊和河北懷來的相對含量分別為59%、68%、88%、70%。其次,擔(dān)子菌門(Basidiomycota)在4個產(chǎn)區(qū)的菌群中含量亦較高。研究表明,子囊菌門和擔(dān)子菌門中的微生物均為土壤中的優(yōu)勢菌種,能夠分解大多數(shù)有機物質(zhì)和植物殘骸[18],這與本文的研究結(jié)果一致。另外,本研究發(fā)現(xiàn)部分真菌菌門獨立存在于特定產(chǎn)區(qū),如在青島樣品中檢測出特有的絲竹蟲門(Cercozoa)；河北懷來產(chǎn)區(qū)樣品中檢測到特有的球囊菌門(Glomeromycota),這可能與河北產(chǎn)區(qū)的砂質(zhì)土壤有關(guān)。被孢霉門(Mortierellomycota)未在蓬萊產(chǎn)區(qū)樣品檢出,其他3個產(chǎn)區(qū)的葡萄表皮樣品上均檢測到。由此說明在以上4個產(chǎn)區(qū)中的葡萄果實上優(yōu)勢真菌群落結(jié)構(gòu)在菌門水平差異不大但相對豐度有明顯差異。

2.5 微生物群落結(jié)構(gòu)相似性分析

對4個產(chǎn)區(qū)的釀酒葡萄果皮上細菌群落進行基于OTU的主成分分析(principal component analysis,PCA),樣本間相似度越高則在圖中表現(xiàn)出越聚集。如圖6-a顯示,當(dāng)PCA1為97%,PCA2為2%時,4個樣品點沒有重疊,說明4個產(chǎn)區(qū)葡萄皮細菌菌群結(jié)構(gòu)具有一定的差異性。其中,通過各產(chǎn)區(qū)樣品在PCA1上的分布來看,蓬萊、青島2個產(chǎn)區(qū)的樣本距離更為接近,均與寧夏、河北產(chǎn)區(qū)的樣本相距較遠,尤其是與河北產(chǎn)區(qū)的樣品之間的距離差異最為明顯,這說明4個產(chǎn)區(qū)中山東青島、蓬萊的菌群結(jié)構(gòu)較為相似,均與寧夏賀蘭山、河北產(chǎn)區(qū)的葡萄在細菌群落結(jié)構(gòu)上差異較明顯。

a-主成分分析圖；b-聚類分析圖圖6 基于OTU的細菌群落主成分分析圖和聚類分析圖Fig.6 OTU-based principal component analysisand cluster analysis of bacterial community

樣本聚類樹圖可以通過樹枝結(jié)構(gòu)反映出多個樣品間的相似性和差異關(guān)系。對4個產(chǎn)區(qū)細菌群落進行了基于OTU的聚類分析,如圖6-b所示。聚類樹圖樹枝的長度代表樣本間的距離,越相似的樣本會越靠近,圖中同一顏色的樹枝代表來源于同一組。結(jié)果顯示,4個樣品共聚為三大支,山東青島和蓬萊產(chǎn)區(qū)2個樣本歸為一類,河北懷來、寧夏賀蘭山產(chǎn)區(qū)的樣品各另聚為一類。說明4個產(chǎn)區(qū)赤霞珠表皮微生物除部分差異微生物群落外,山東青島赤霞珠和山東蓬萊赤霞珠表皮在微生物群落上更為相似,差異較小。寧夏賀蘭山產(chǎn)區(qū)葡萄表皮微生物群落組成與山東產(chǎn)區(qū)樣品差異較大,這與PCA結(jié)果基本一致。

真菌群落PCA結(jié)果如圖7-a所示,當(dāng)PCA1為76%,PCA2為18%時,4個樣品點沒有重疊,有明顯差距,說明4個產(chǎn)區(qū)葡萄皮真菌菌群結(jié)構(gòu)存在一定的差異性；從PCA1上各樣品點的分布來看,4個產(chǎn)區(qū)距離分別都較為接近,說明山東青島與蓬萊產(chǎn)區(qū)、河北懷來與寧夏賀蘭山產(chǎn)區(qū)的葡萄果皮上大部分真菌微生物相似性較高。同細菌聚類分析的結(jié)果類似,如圖7-b所示,山東蓬萊、青島產(chǎn)區(qū)的樣本中真菌菌群結(jié)構(gòu)聚為一類,說明山東青島和蓬萊2個地區(qū)的葡萄果實上的微生物群落結(jié)構(gòu)差異不明顯,這可能與空間距離、氣候特征有直接關(guān)系。

a-主成分分析圖；b-聚類分析圖圖7 基于OTU的真菌群落主成分分析圖和聚類分析圖Fig.7 OTU-based principal component analysis and cluster analysis of fungal community

綜上,山東蓬萊、山東青島的赤霞珠果實表皮微生物的菌群結(jié)構(gòu)較為相似；河北懷來和寧夏賀蘭山產(chǎn)區(qū)的葡萄樣品菌群結(jié)構(gòu)與山東兩地的有一定差異,分別各聚為一類。研究表明,釀酒葡萄表皮細菌群落多樣性受葡萄園土壤微生物群落的影響[14]。山東蓬萊和山東青島產(chǎn)區(qū)大多為棕壤土,河北懷來土壤為褐土,質(zhì)地偏砂,寧夏賀蘭山土壤以灰鈣土為主,疏松多孔。因此,4個產(chǎn)區(qū)葡萄表皮微生物菌群結(jié)構(gòu)的不同與各產(chǎn)區(qū)不同的土壤條件密切相關(guān)。

3 討論

LEVEAU等[19]發(fā)現(xiàn)，霞多麗葡萄上53.5% 的細菌為變形菌門,其他主要有厚壁菌門(15.1%)、擬桿菌門(10.1%)和放線菌門(Actinobacteria,8.0%);MARTINS等[20]發(fā)現(xiàn)美樂葡萄上的優(yōu)勢細菌也主要歸屬于變形菌門。而本研究通過高通量測序分析寧夏賀蘭山、河北懷來、山東蓬萊、山東青島產(chǎn)區(qū)的赤霞珠表皮微生物的群落結(jié)構(gòu)及多樣性,檢測到優(yōu)勢細菌門有變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和綠彎菌門(Chloroflexi)。通過文獻對比發(fā)現(xiàn),雖然葡萄品種、所屬地區(qū)不同,但葡萄果實表面的優(yōu)勢菌種在門水平的分布基本一致。在屬水平,苯基桿菌屬(Phenylobacterium)為河北懷來、山東青島、寧夏賀蘭山產(chǎn)區(qū)赤霞珠表皮上的優(yōu)勢細菌菌種。而蓬萊地區(qū)樣品檢測到的最優(yōu)勢菌屬為勞爾氏菌屬(Ralstonia)。

葡萄酒釀造相關(guān)細菌主要為乳酸菌,起到將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸的作用,如檢測到的明串珠菌屬(Leuconostoc)[21]。另外,本研究檢測到的厚壁菌門的微生物,發(fā)生蘋果酸-乳酸發(fā)酵后可以有效地降低葡萄酒酸度,避免葡萄酒在裝瓶、貯存期間發(fā)生二次發(fā)酵,增加葡萄酒的微生物學(xué)穩(wěn)定性,從而影響葡萄酒的感官品質(zhì)。除此之外,大多數(shù)細菌微生物對于葡萄酒來說都屬于有害菌,會在不同程度上對葡萄酒的品質(zhì)造成影響,例如檢測到的變形菌門(Proteobacteria),是葡萄酒釀造中典型的有害菌[22],導(dǎo)致葡萄酒變質(zhì)。

4個產(chǎn)區(qū)的葡萄表皮微生物共檢測到11種真菌菌門,其中優(yōu)勢菌門為子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)。在屬水平4個產(chǎn)區(qū)的真菌菌群結(jié)構(gòu)有一定的差異。寧夏賀蘭山產(chǎn)區(qū)優(yōu)勢菌屬為短梗霉屬(Aureobasidium)；山東青島和蓬萊產(chǎn)區(qū)含量較高的2個真菌屬為短梗霉屬(Aureobasidium)和紅酵母屬(Rhodotorula)。BOKULICH等[23]研究發(fā)現(xiàn)增芳德葡萄表面上的優(yōu)勢真菌屬為假絲酵母(Candidazemplinina),與本文的研究結(jié)果相差較大,可能由于葡萄的栽培方式不同造成。

本研究4個產(chǎn)區(qū)的樣品中均檢測到霉菌,霉菌是一種絲狀真菌,通過侵染葡萄的莖、葉、花、果實等影響果實品質(zhì)。發(fā)酵過程若霉菌侵染會產(chǎn)生霉味,造成葡萄酒病害。有研究指出由曲霉屬(Aspergillus)產(chǎn)生的赭曲霉素是全球葡萄酒都存在的問題[24],但其存在于葡萄酒中的可能性風(fēng)險不高,在本研究中僅在河北懷來產(chǎn)區(qū)的葡萄表面檢出該菌屬。酵母菌是葡萄酒釀造的主體,決定葡萄酒的品質(zhì),本研究檢測到Saccharomyces、Pichia、Candida、Hanseniaspora、Dekkera、Rhodotorula這6個菌屬的菌株,其中,Saccharomyces是酒精發(fā)酵的主要完成者,將葡萄中的糖轉(zhuǎn)化成乙醇、CO2及其他代謝產(chǎn)物[25]。

4 結(jié)論

本試驗通過對我國中、東部地區(qū)4個產(chǎn)地赤霞珠葡萄表面微生物多樣性進行研究,發(fā)現(xiàn)在門水平,4個區(qū)域葡萄果皮上的優(yōu)勢細菌均屬于變形菌門(Proteobacteria),優(yōu)勢真菌為子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)。在屬水平上,河北懷來、山東青島和寧夏賀蘭山產(chǎn)區(qū)的葡萄樣品上的優(yōu)勢細菌為苯基桿菌屬(Phenylobacterium)；山東蓬萊產(chǎn)區(qū)優(yōu)勢菌屬為勞爾氏菌屬(Ralstonia),寧夏賀蘭山地區(qū)葡萄的優(yōu)勢真菌為短梗霉屬(Aureobasidium),而山東青島和蓬萊地區(qū)豐度較高的真菌屬于短梗霉屬和紅酵母屬(Rhodotorula)。結(jié)果證實產(chǎn)區(qū)是影響葡萄表皮微生物菌群結(jié)構(gòu)的重要因素之一,這可能與氣候條件、土壤類型等因素有關(guān)。