劉丹,陳杰,羅惠波,3,韓保林,3,李子健,謝軍,3,黃丹,3*

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院,四川 自貢,643000) 2(宜賓六尺巷酒業(yè)有限公司,四川 宜賓,644100) 3(釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 自貢,643000)

大曲作為白酒發(fā)酵生產(chǎn)的動(dòng)力,有豐富的微生物群落,其中枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)作為大曲主要功能菌之一,能在白酒釀造過(guò)程中增加吡嗪類(lèi)物質(zhì)含量[1],并降低酒體中高級(jí)醇含量[2]；能產(chǎn)生蛋白酶與淀粉酶,有利于風(fēng)味物質(zhì)的生成[3]；還能抑制鏈霉菌生長(zhǎng),進(jìn)而減少土臭素以控制白酒的土臭味[4],因而對(duì)白酒的風(fēng)味和品質(zhì)有重要影響。

近年來(lái),對(duì)枯草芽孢桿菌的研究主要在產(chǎn)酶、產(chǎn)香的功能性[5],包括對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶等多種酶的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化[6-7]。此外,通過(guò)枯草芽孢桿菌與不同酵母菌種在小麥基質(zhì)上共發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)乙醇和氨基酸的合成代謝存在差異[8]；通過(guò)在高粱基質(zhì)上發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)不同的發(fā)酵階段有不同的特征風(fēng)味[9]；通過(guò)對(duì)枯草芽孢桿菌所產(chǎn)醬香的研究,發(fā)現(xiàn)其不僅與多種香味物質(zhì)相關(guān),蛋白酶也起重要作用[10-11]。目前,對(duì)枯草芽孢桿菌的研究大多在純菌或熟料基質(zhì)條件下進(jìn)行[9,12],在混菌生料發(fā)酵體系中進(jìn)行發(fā)酵時(shí)枯草芽孢桿菌的影響卻鮮有報(bào)道。

本研究將濃香型大曲中分離的枯草芽孢桿菌接種到小麥基質(zhì)中,并進(jìn)行不同培養(yǎng)條件下的生料發(fā)酵,了解枯草芽孢桿菌在不同培養(yǎng)條件下的擾動(dòng)作用,以此為枯草芽孢桿菌應(yīng)用于大曲強(qiáng)化提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：濃香型大曲中分離鑒定的1株枯草芽孢桿菌BacillussubtilisA1;軟質(zhì)小麥。

試劑：乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，Na2EDTA)、Na2HPO4、NaH2PO4、蝸牛酶、溶菌酶、十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)，生工生物工程(上海)股份有限公司；Tris-平衡酚(pH>7.8)、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(生化試劑)，上海博威生物醫(yī)藥有限公司；三氯甲烷(分析純)、無(wú)水乙醇(分析純)，成都市科隆化學(xué)品有限公司；異戊醇(分析純)，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；異丙醇(分析純)，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

QL-861漩渦振蕩器，江蘇海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠；LYNX6000高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Bio-rad公司；POWERPAC電泳儀、ChemiDocXRS+凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Bio-rad公司；Illumina MiSeq 高通量測(cè)序平臺(tái)，美國(guó)Illumina公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌對(duì)混菌固態(tài)發(fā)酵體系的擾動(dòng)實(shí)驗(yàn)

種子液的制備：將枯草芽孢桿菌接種至斜面,37 ℃培養(yǎng)2 d后用去離子水洗脫,稀釋至OD600=1的菌懸液待用。

小麥固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：稱(chēng)取1 000 g小麥(水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為10%)于干凈容器中,加入50 mL 80 ℃水,潤(rùn)料4 h；粉碎至小麥爛心不爛皮,且細(xì)粉率約為20%。分別稱(chēng)取粉碎后的小麥240 g于4個(gè)白瓷盤(pán)中,對(duì)照組加水量為發(fā)酵體系的20%(即60 mL)；實(shí)驗(yàn)組中種子液的添加量為發(fā)酵體系的10%(即30 mL),再加水30 mL,調(diào)整發(fā)酵體系中的水分含量約為40%?；旌暇鶆蚝笠?層紗布封口。

實(shí)驗(yàn)所取的溫度/濕度條件是根據(jù)濃香型大曲在生產(chǎn)過(guò)程中各階段的發(fā)酵條件及枯草芽孢桿菌的耐熱性所設(shè)定的。實(shí)驗(yàn)的枯草芽孢桿菌所生長(zhǎng)的原始環(huán)境為濃香型大曲,大曲的最初發(fā)酵溫度/濕度約為 25 ℃/95%,再結(jié)合大曲生產(chǎn)過(guò)程中各階段的發(fā)酵條件選取5個(gè)發(fā)酵條件,即發(fā)酵溫度/濕度為25 ℃/95%、35 ℃/85%、43 ℃/70%、50 ℃/60%和58 ℃/40%,分別進(jìn)行5組生料發(fā)酵,分別記為YA、YB、YC、YD和YE。每個(gè)條件下設(shè) 2 個(gè)空白組、2 個(gè)實(shí)驗(yàn)組,生料發(fā)酵48 h。

1.3.2 總DNA提取和測(cè)序

DNA的提取采用改良的CTAB法,借助酶,反復(fù)凍融,用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1,體積比)抽提等操作提取大曲中微生物的總DNA[14-15]。真菌用引物SSU0817F(5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′)和1196R(5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′)對(duì)V5-V7區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。細(xì)菌用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增16S rRNA V4區(qū)?；驇?kù)測(cè)序由深圳微生太科技有限公司提供,采用Illumina MiSeq平臺(tái)對(duì)測(cè)序樣本進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

與NCBI的GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì),確定細(xì)菌、真菌序列的分類(lèi)信息,獲得門(mén)和屬水平下的種類(lèi)及相對(duì)豐度[16]。α多樣性用Chaol和Shannon指數(shù)來(lái)計(jì)算,以評(píng)價(jià)樣品微生物群落的生物多樣性和豐富度[17]。相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析采用SPSS 20.0計(jì)算所選OTU之間的Spearman相關(guān)系數(shù)(ρ),選擇|ρ|>0.6的相關(guān)微生物利用Cytoscape 3.5.1構(gòu)建相關(guān)網(wǎng)絡(luò)。以高質(zhì)量序列為基礎(chǔ),利用PICRUSt預(yù)測(cè)微生物功能[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌對(duì)混菌發(fā)酵體系微生物菌群α多樣性的影響

α多樣性反映了單個(gè)樣品內(nèi)部物種的多樣性[19],以Chao1和Shannon來(lái)描述各組微生物群落的α多樣性[20]。Chao1 指數(shù)反映樣品中群落的豐富度,即簡(jiǎn)單指群落中物種的數(shù)量,而不考慮群落中每個(gè)物種的豐度情況,Shannon 指數(shù)反映群落的多樣性,受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響[21]。整體來(lái)看,枯草芽孢桿菌擾動(dòng)后,細(xì)菌群落在溫度/濕度為50 ℃/60%和58 ℃/40%時(shí)豐富度增加,58 ℃/40%時(shí)多樣性增加。真菌群落的豐富度和多樣性略有降低。將得到的α多樣性指數(shù)結(jié)合分組信息,使用Wilcox Test去精確比較了各個(gè)組間的顯著差異,如圖1所示。枯草芽孢桿菌擾動(dòng)前后在不同發(fā)酵條件下,細(xì)菌和真菌群落的α多樣性沒(méi)有顯著差異,表明枯草芽孢桿菌生物擾動(dòng)造成的真菌和細(xì)菌群落豐富度和多樣性的變化不顯著。

a-自然發(fā)酵時(shí)各培養(yǎng)條件下細(xì)菌的α多樣性；b-枯草芽孢桿菌擾動(dòng)后各培養(yǎng)條件下細(xì)菌的α多樣性；c-自然發(fā)酵時(shí)各培養(yǎng)條件下真菌的α多樣性；d-枯草芽孢桿菌擾動(dòng)后各培養(yǎng)條件下真菌的α多樣性圖1 枯草芽孢桿菌擾動(dòng)對(duì)α多樣性的影響Fig.1 Effects of B.subtilis disturbance on α diversity注：α多樣性主要以Chao1(如a1、b1、c1、d1所示)和Shannon(如a2、b2、c2、d2所示)指數(shù)來(lái)表征

2.2 枯草芽孢桿菌對(duì)混菌發(fā)酵體系微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響

枯草芽孢桿菌對(duì)微生物屬級(jí)群落組成及相對(duì)豐度的生物擾動(dòng)效應(yīng)如圖2所示。不同培養(yǎng)條件下樣品中的細(xì)菌和真菌群落對(duì)枯草芽孢桿菌擾動(dòng)反應(yīng)不同。其中優(yōu)勢(shì)菌屬(相對(duì)豐度組成以50%以上為優(yōu)勢(shì)屬[22])變化主要如下。

a-各培養(yǎng)條件下細(xì)菌的物種組成；b-各培養(yǎng)條件下真菌的物種組成圖2 枯草芽孢桿菌擾動(dòng)前后屬水平的物種組成Fig.2 Species composition of genus level before and after B.subtilis disturbance注：a1和b1是自然發(fā)酵的,a2和b2是枯草芽孢桿菌擾動(dòng)后的

枯草芽孢桿菌擾動(dòng)后總體表現(xiàn)為：在溫度/濕度為25 ℃/95%培養(yǎng)下相對(duì)豐度增加的有未知曲霉屬(unspecified-Aspergillus)、橫梗霉屬(Lichtheimia)和腸桿菌屬(Enterobacter),依次增加36.6%、1.3%和44.8%；在溫度/濕度為35 ℃/85%培養(yǎng)下相對(duì)豐度增加的有(unspecified-Aspergillus)、畢赤酵母屬(Pichia)、未知酵母菌屬(unspecified-Saccharomycetales)、Lichtheimia和芽孢桿菌屬(Bacillus),依次增加4.9%、71.1%、0.2%、19.8%和35.5%；在溫度/濕度為43 ℃/70%培養(yǎng)下有所增加的有Pichia、unspecified-Saccharomycetales和Bacillus,依次增加23.6%、30.3%和35.5%；在溫度/濕度為50 ℃/60%培養(yǎng)下相對(duì)豐度增加的有unspecified-Aspergillus、unspecified-Saccharo-mycetales和Enterobacter,依次增加12.8%、10.9%和5.0%；在溫度/濕度為58 ℃/40%培養(yǎng)下相對(duì)豐度增加的有unspecified-Saccharomycetales、Lichtheimia和Enterobacter,依次增加20.8%、4.7%和0.2%。在枯草芽孢桿菌擾動(dòng)后才成為優(yōu)勢(shì)菌屬的有：在溫度/濕度為25 ℃/95%培養(yǎng)下的Enterobacter,在溫度/濕度為43 ℃/70%培養(yǎng)下的Bacillus和在溫度/濕度為58 ℃/40%培養(yǎng)下的unspecified-Saccharomycetales。

2.3 枯草芽孢桿菌對(duì)混菌發(fā)酵體系微生物菌種間相互作用的影響

微生物相互作用被認(rèn)為是支撐微生物結(jié)構(gòu)的重要因素[23],也可能是決定目前屬相對(duì)豐度變化的主要因素[22],利用樣品中的所有微生物OTU進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。如圖3所示,自然發(fā)酵時(shí),細(xì)菌中有37個(gè)屬鑒定了193對(duì)相關(guān)性,其中170對(duì)正相關(guān)。真菌中有20個(gè)屬鑒定出22對(duì)相關(guān)性,其中17對(duì)正相關(guān)?？莶菅挎邨U菌擾動(dòng)后,物種間相互作用發(fā)生了改變。細(xì)菌有35個(gè)屬鑒定出186對(duì)相關(guān)性,其中有152對(duì)正相關(guān)。真菌中有16個(gè)屬鑒定出11對(duì)相關(guān)性,包括8對(duì)正相關(guān)。具體表現(xiàn)為：自然發(fā)酵時(shí),與Bacillus呈負(fù)相關(guān)的細(xì)菌屬有Enterobacter、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、梭菌屬(Clostridium)、泛菌屬(Pantoea)、坂崎腸桿菌屬(Cronobacter)、片球菌屬(Pediococcus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、歐文氏菌屬(Erwinia)、特拉布斯氏菌屬(Trabulsiella)、魏斯氏菌屬(Weissella)和乳球菌屬(Lactococcus),共計(jì)12個(gè)；與之呈正相關(guān)的是芽孢桿菌屬(Brevibacillus)?？莶菅挎邨U菌擾動(dòng)后,與Bacillus呈負(fù)相關(guān)的細(xì)菌屬多了5個(gè),依次是拉恩氏菌屬(Rahnella)、糖桿菌屬(Saccharibacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingobacterium)和產(chǎn)吲哚金黃桿菌屬(Chryseobacterium)；比之少了Cronobacter。自然發(fā)酵時(shí)Pichia僅與Clavispora_Candida_clade呈正相關(guān),枯草芽孢桿菌擾動(dòng)使其多了與Aspergillus,假絲酵母(Candida_Lodderomyces_clade)的正相關(guān),及與根霉(Rhizopus),鐮刀菌(Fusarium)的負(fù)相關(guān)。

a1-自然發(fā)酵時(shí)細(xì)菌的相互作用；a2-枯草芽孢桿菌擾動(dòng)后細(xì)菌的相互作用；b1-自然發(fā)酵時(shí)真菌的相互作用；b2-枯草芽孢桿菌擾動(dòng)后真菌的相互作用圖3 枯草芽孢桿菌擾動(dòng)前后屬分類(lèi)水平物種相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 The network diagram of species interaction of genera before and after B.subtilis disturbance

2.4 枯草芽孢桿菌對(duì)微生物菌群功能的影響

基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù),采用PICRUSt預(yù)測(cè)微生物功能[18]。同時(shí),對(duì)不同培養(yǎng)條件下的樣品的KEGG通路組成進(jìn)行了分析,結(jié)果如圖4所示。

a1-自然發(fā)酵時(shí)的代謝功能組成；a2-枯草芽孢桿菌擾動(dòng)后的代謝功能組成；b1-自然發(fā)酵時(shí)不同培養(yǎng)條件下差異顯著的代謝功能；b2-枯草芽孢桿菌擾動(dòng)后不同培養(yǎng)條件下差異顯著的代謝功能圖4 枯草芽孢桿菌擾動(dòng)在不同培養(yǎng)條件下的代謝功能及代謝通路差異Fig.4 The metabolic function and metabolic pathway of B.subtilis disturbance under different culture conditions

不同培養(yǎng)條件下,微生物菌群的代謝功能存在差異,尤其是在枯草芽孢桿菌擾動(dòng)后,其差異代謝功能增多。自然發(fā)酵時(shí),溫度/濕度為35 ℃/85%培養(yǎng)下微生物群落中分泌系統(tǒng)(secretion system)和未知功能(function unknown)高度表達(dá)?？莶菅挎邨U菌擾動(dòng)后,分泌系統(tǒng)(secretion system)和未知功能(function unknown)在溫度/濕度為25 ℃/95%和35 ℃/85%下高度表達(dá),其他離子-耦合轉(zhuǎn)運(yùn)體(other ion-coupled transporters),兩個(gè)-組件系統(tǒng)(two-component system)在25 ℃/95%和35 ℃/85%以及43 ℃/70%中表達(dá)更高。

將KEGG功能注釋和分組信息相結(jié)合,利用ANOVA+Duncan和Dunn test分析了微生物群落預(yù)測(cè)功能在組間是否有顯著性差異。如圖4-b1所示,自然發(fā)酵下,僅有卟啉和葉綠素代謝(porphyrin and chlorophyll metabolism)通路在不同培養(yǎng)條件下存在顯著差異?？莶菅挎邨U菌擾動(dòng)后,有更多代謝通路在不同培養(yǎng)條件下的樣品中存在差異,在溫度/濕度為43 ℃/70%和50 ℃/60%以及58 ℃/40%的培養(yǎng)條件下,豐度較高的代謝通路主要有氨基酸相關(guān)酶(amino acid related enzymes)、精氨酸和脯氨酸代謝(arginine and proline metabolism)、孢子形成(sporulation)、轉(zhuǎn)錄機(jī)制(transcription machinery)。在該培養(yǎng)條件下,豐度更低的代謝通路主要有分泌系統(tǒng)(secretion system)、核糖體合成(ribosome biogenesis)、未知功能(function unknown)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC transporters)。

在代謝通路顯著差異圖可知,在較高溫度下,脂多糖生物合成(lipopolysaccharide biosynthesis)和脂多糖生物合成蛋白(lipopolysaccharide biosynthesis proteins)表達(dá)減少,會(huì)影響革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞膜[24]；孢子代表芽孢桿菌屬細(xì)胞內(nèi)休眠,以響應(yīng)環(huán)境脅迫,這是桿菌孢子逃避損傷的策略[25-26],因此在溫度較高時(shí),芽孢桿菌屬豐度增加,孢子形成(sporulation)功能高度表達(dá)；較高的溫度能誘導(dǎo)精氨酸代謝,導(dǎo)致多胺和脯氨酸的積累[27],而脯氨酸可以作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)維持細(xì)胞的形狀、代謝功能,穩(wěn)定蛋白的結(jié)構(gòu)、酶的活性,保持膜的通透性[28]。

3 結(jié)論與討論

本研究在發(fā)酵溫度/濕度為25 ℃/95%、35 ℃/85%、43 ℃/70%、50 ℃/60%和58 ℃/40%的條件下,基于混菌固態(tài)發(fā)酵體系,研究了濃香型大曲中分離獲得的枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)代謝特性。通過(guò)分析枯草芽孢桿菌擾動(dòng)前后微生物群落多樣性、微生物群落結(jié)構(gòu)、微生物間的相互作用及PI CRUST預(yù)測(cè)的代謝功能和通路的差異,解析了枯草芽孢桿菌菌株對(duì)多菌共酵體系的擾動(dòng)作用。結(jié)果表明,接種枯草芽孢桿菌會(huì)顯著的影響固態(tài)混菌發(fā)酵體系，使得各微生物菌屬的相對(duì)豐度改變,但僅在枯草芽孢桿菌擾動(dòng)后才成為優(yōu)勢(shì)菌屬的有：在溫度/濕度為25 ℃/95%培養(yǎng)下的腸桿菌屬(Enterobacter)，在溫度/濕度為43 ℃/70%培養(yǎng)下的芽孢桿菌屬(Bacillus)和在溫度/濕度為58 ℃/40%培養(yǎng)下的未知酵屬(Unspecified-Saccharomycetales)?？莶菅挎邨U菌擾動(dòng)后,在6種優(yōu)勢(shì)菌屬中除橫梗霉屬(Lichtheimia)外的優(yōu)勢(shì)菌屬互作增多。枯草芽孢桿菌擾動(dòng)后,微生物群落的分泌系統(tǒng)和未知功能在溫度/濕度為25 ℃/95%和35 ℃/85%下高度表達(dá),其他離子一耦合轉(zhuǎn)運(yùn)體,兩個(gè)一組件系統(tǒng)在25 ℃/95%和35 ℃/85%以及43 ℃/70%中表達(dá)更高。這些數(shù)據(jù)表明枯草芽孢桿菌在固態(tài)混菌發(fā)酵體系中起到了至關(guān)重要的作用,也為深入研究枯草芽孢桿菌在濃香型大曲中的應(yīng)用提供了重要的數(shù)據(jù)。