馬銀鳳,申培立,王彩喆,牛丹丹,田康明,王正祥*

1(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院,天津,300457) 2(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300457)

解淀粉芽胞桿菌α-淀粉酶(Bacillusamyloliquefaciensα-amylase,BAA)可以隨機(jī)水解直鏈淀粉或支鏈淀粉分子中的α-1,4糖苷鍵,生成麥芽糊精和少量葡萄糖,是一種內(nèi)切型液化酶,最適作用溫度為55 ℃、最適作用pH為6～7,是一種典型的鈣離子依賴型淀粉液化酶[1-2]。BAA在淀粉液化、織物退漿和食品加工等工業(yè)中具有重要應(yīng)用價(jià)值,是工業(yè)上產(chǎn)量最大、應(yīng)用領(lǐng)域最廣的中溫型α-淀粉酶[3-4]。

BAA作為我國(guó)開(kāi)發(fā)應(yīng)用較早的工業(yè)酶制劑之一,早在19世紀(jì)60年代就開(kāi)始了工業(yè)化生產(chǎn),但發(fā)酵水平一直停滯在300～500 U/mL,且酶制劑產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、貨架期太短(3個(gè)月左右)。2009年前后,經(jīng)過(guò)分子育種技術(shù),在改善BAA酶制劑質(zhì)量和貨架期的同時(shí),BAA發(fā)酵生產(chǎn)水平提高至1 500 U/mL以上,由此確立了BAA生產(chǎn)的世界領(lǐng)先地位[5]。但是,針對(duì)BAA工業(yè)應(yīng)用屬性的研究,一直以來(lái)未有很大的突破。現(xiàn)有針對(duì)BAA的分子進(jìn)化研究,主要包括：LEE等[6]對(duì)BAA編碼基因進(jìn)行隨機(jī)突變,發(fā)現(xiàn)233位的氨基酸殘基與BAA的酶學(xué)性能有關(guān)；CORNELIUS等[7]通過(guò)易錯(cuò)PCR與DNA體外隨機(jī)重排技術(shù)(DNA shuffling)對(duì)BAA編碼基因進(jìn)行改造,得到水解活力提高8倍的突變體BAA29,比酶活性由15 U/mg提高至140 U/mg；WU等[8]通過(guò)易錯(cuò)PCR對(duì)BAA編碼基因進(jìn)行隨機(jī)突變,得到Ca2+依賴性降低的突變體Q264S；林碧瑜[9]發(fā)現(xiàn)BAA第28位氨基酸由天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼峥梢蕴岣弑让富钚?與野生型BAA相比突變體的比酶活性提高了約30%。

BAA工業(yè)應(yīng)用屬性有待改善的主要方面:1)酶活性的鈣離子依賴型,即如何降低其在實(shí)際工業(yè)應(yīng)用中氯化鈣或碳酸鈣等鈣鹽的補(bǔ)加；2)如何適度提高其最適作用溫度,有利于淀粉液化和加工工藝的實(shí)施。為此,本文在前期研究積累[9]的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)其特定氨基酸殘基進(jìn)行突變并解析酶學(xué)性質(zhì),研究結(jié)果對(duì)后續(xù)進(jìn)一步提升BAA的應(yīng)用具有顯著價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

含有BAA突變體2M6表達(dá)質(zhì)粒的Bacillussubtilis2M6-A1為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建與保藏；B.subtilis1A717為本實(shí)驗(yàn)室保藏,用于質(zhì)粒構(gòu)建；載體pHY-WZX為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建[10],用于BAA及其突變體的表達(dá)；BacilluslicheniformisZ902(Δamy)[11]為酶高效表達(dá)宿主細(xì)胞,由本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)分子改造B.licheniformisCBBD302[12]獲得。

1.1.2 酶與試劑

中溫α-淀粉酶工業(yè)產(chǎn)品,江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司;Pyrobest DNA聚合酶,Takara公司;限制性內(nèi)切酶XbaI、SmaI、T4DNA連接酶和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),上海生工生物工程股份有限公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和小量DNA產(chǎn)物純化試劑盒,北京莊盟生物科技有限公司,其他試劑除特殊要求外均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸出物5,蛋白胨10,氯化鈉10；固體培養(yǎng)基添加20 g/L瓊脂。必要時(shí)在培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量濃度為20 μg/mL的硫酸卡那霉素。

產(chǎn)酶鑒定培養(yǎng)基：在固體LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,加入1%可溶性淀粉[13]。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：CaCl20.3,(NH4)2SO43,棉籽粉20,α-乳糖20,KH2PO410,K2HPO420,pH 7.2[13]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 常規(guī)分子克隆操作

質(zhì)粒DNA的提取、酶切、轉(zhuǎn)化子篩選等均按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行[14]；枯草桿菌與地衣芽胞桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化按照文獻(xiàn)進(jìn)行[15-16]；DNA純化按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 定點(diǎn)突變

以突變體2M6編碼基因?yàn)槟０?按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行定點(diǎn)突變[5]。具體步驟為：以baa-28a(5′-CGATAAATGTTCCGCATCATTCTG-3′)和baa-28b(5′-CAGAATGATGCGGAACATTTATCG-3′)為突變引物,引入突變位點(diǎn)D28E,與兩端引物BAA-1(5′-TACTCTAGAGTAAATGGCACGCTGATGCAGTAT-3′)和BAA-2(5′-TTTCTGAACATAAATGGAGCAGG-3′)組合,通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得上下游兩段DNA片段；再以此兩段DNA片段為模板,以BAA-1和BAA-2為引物,將上下游兩段DNA片段融合為突變體E2M6全長(zhǎng)基因。采用Sanger核苷酸序列測(cè)定法確認(rèn)突變基因序列。

1.2.3 突變體的表達(dá)、制備與純化

將突變體全長(zhǎng)編碼DNA片段純化后經(jīng)XbaI酶切,并克隆入表達(dá)載體pHY-WZX的XbaI/SmaI位點(diǎn),轉(zhuǎn)化入枯草桿菌1A717構(gòu)建重組質(zhì)粒pHY-E2M6,正確構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入地衣芽胞桿菌Z902中,獲得產(chǎn)酶重組菌地衣芽胞桿菌Z-E2M6。

將Z-E2M6接種入盛有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶,37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)120 h；發(fā)酵結(jié)束后離心收集上清液,即為突變體粗酶液。酶液經(jīng)飽和度為30%～40%的硫酸銨沉淀,再經(jīng)凝膠層析柱Superdex-G75進(jìn)一步純化。純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析[17],蛋白質(zhì)濃度用Bradford法測(cè)定[18]。

1.2.4 酶活測(cè)定

中溫α-淀粉酶酶活力按照GB 1886.174—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 食品工業(yè)用酶制劑》進(jìn)行測(cè)定[19]。酶活性定義為：1 mL液體酶在60 ℃、pH 6.0條件下,1 h液化1 g可溶性淀粉即為1個(gè)酶活力單位,以U/mL表示。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.2.5.1 最適作用溫度及熱穩(wěn)定性

將酶樣在不同溫度(30～90 ℃)下測(cè)定酶活力,最高酶活力值以100%計(jì),計(jì)算其不同溫度下的相對(duì)酶活力,確定最適作用溫度。將酶樣用pH 6.0緩沖液進(jìn)行適當(dāng)稀釋,在不同溫度(50、55、60、65 ℃)下保溫1 h,間隔10 min取樣,測(cè)定殘余酶活力,未經(jīng)熱處理的酶活力值以100%計(jì),計(jì)算處理后酶樣的相對(duì)酶活力。

1.2.5.2 最適作用pH及pH穩(wěn)定性

將酶樣用不同pH(4～8)緩沖液進(jìn)行稀釋,并用對(duì)應(yīng)pH緩沖液測(cè)定酶活力,最高酶活力值以100%計(jì),計(jì)算其不同pH條件下的相對(duì)酶活力,確定最適作用pH。將酶樣與不同pH值緩沖液以1∶10(體積比)混合,37 ℃靜置1 h,測(cè)定酶樣的殘余酶活力值。未經(jīng)處理的酶活力值以100%計(jì),計(jì)算處理后酶樣的相對(duì)酶活力。

1.2.5.3 金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)酶活的力影響

在反應(yīng)體系中加入不同金屬離子和化學(xué)試劑,終濃度為1 mmol/L或5 mmol/L,在酶的最適反應(yīng)條件下測(cè)定樣品酶活力,未經(jīng)處理的酶活力值以100%計(jì)。

1.2.5.4 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

將酶樣用最適作用pH緩沖液適當(dāng)稀釋后,以不同質(zhì)量濃度(0.4、1、2、4,10和20 mg/mL)可溶性淀粉溶液為底物,在最適反應(yīng)條件下按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法[9]進(jìn)行測(cè)定,并以雙倒數(shù)法(Lineweaver-Burk法)作圖,計(jì)算酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 突變體的構(gòu)建與制備

以突變體2M6編碼基因?yàn)槟０?特異性引物序列介導(dǎo)BAA編碼基因的定點(diǎn)突變,獲得突變體E2M6全長(zhǎng)編碼基因。將此基因酶切后克隆入表達(dá)載體pHY-WZX中,獲得了重組表達(dá)載體pHY-E2M6。進(jìn)一步將此表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入地衣芽胞桿菌Z902中,獲得產(chǎn)酶重組菌地衣芽胞桿菌Z-E2M6。

經(jīng)搖瓶發(fā)酵制備酶液,并經(jīng)硫酸銨沉淀和凝膠過(guò)濾色譜進(jìn)行純化,獲得了純化的BAA突變體E2M6,經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定,呈現(xiàn)單一純蛋白條帶(圖1),分子質(zhì)量為58 kDa,與理論大小相符。

M-蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-B.licheniformis Z902發(fā)酵酶液；2-E2M6粗酶液；3-純化后的E2M6圖1 純化突變體E2M6的SDS-PAGE圖譜Fig.1 The SDS-PAGE profile of mutant E2M6

2.2 突變體的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 最適作用溫度與最適作用pH

由圖2-a可知，突變體E2M6的最適作用溫度為60 ℃,60～70 ℃之間維持較高活性,突變體的最適酶活較野生型BAA提高了至少5 ℃；在30～60 ℃溫度范圍內(nèi),突變體E2M6與BAA的變化趨勢(shì)大致相同；當(dāng)溫度升至80 ℃時(shí),野生型BAA的酶活力明顯下降(小于40%),突變體E2M6仍保留70%以上的酶活力；當(dāng)反應(yīng)溫度升至90 ℃時(shí),突變體E2M6仍保留20%以上的酶活力,而B(niǎo)AA僅殘余約10%的酶活力?？梢?jiàn),對(duì)BAA的突變拓寬了BAA的作用溫度范圍。

a-溫度；b-pH圖2 突變體E2M6的最適作用溫度與最適作用pHFig.2 Optimum temperature and pH optimal of mutant E2M6

在60 ℃條件下,測(cè)定不同pH(4.0～8.0)條件下的酶活力,結(jié)果如圖2-b所示。突變體E2M6與BAA的最適作用pH相同,都為pH 6.0,且兩者在不同pH條件下的酶活力大致相同,在pH 5.0～7.0范圍內(nèi)皆具有較高活性。

2.2.2 熱穩(wěn)定性與pH穩(wěn)定性

BAA突變體的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性如圖3所示。突變體在50 ℃下保溫1 h后,E2M6與BAA分別保留80%、60%以上的酶活力；55 ℃保溫1 h后E2M6與BAA分別保留60%、40%以上酶活力；60 ℃保溫1 h后E2M6與BAA分別保留50%、30%以上的酶活力；65 ℃保溫1 h后E2M6與BAA分別保留40%、15%以上的酶活力(圖3-a)。綜上,E2M6熱穩(wěn)定性較BAA有所提升。

突變體E2M6與BAA的pH穩(wěn)定性趨勢(shì)大致相同。當(dāng)pH在6.0～9.0范圍內(nèi),pH的升高對(duì)BAA及E2M6酶活力影響較小,相對(duì)酶活力保持在80%以上(圖3-b)。

a-熱穩(wěn)定性；b-pH穩(wěn)定性圖3 突變體E2M6的熱穩(wěn)定性與pH穩(wěn)定性Fig.3 The thermostability and pH stability of the mutant E2M6

2.2.3 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活性的影響

不同金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)突變體酶活性的影響結(jié)果如表1。與BAA相比,突變體E2M6酶活力對(duì)Ca2+、Mg2+、Na+等金屬離子的依賴性降低；SDS對(duì)BAA及突變體E2M6酶活均有抑制作用,但與BAA相比E2M6對(duì)SDS更敏感。

表1 不同金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)突變體E2M6的影響Table 1 Effect of different metal ions and chemicals on E2M6

2.2.4 突變體E2M6動(dòng)力學(xué)特征

測(cè)定突變體E2M6的比酶活力數(shù)據(jù)與動(dòng)力學(xué)常數(shù),結(jié)果匯總于表2。突變體E2M6比酶活力為185 U/mg,較BAA提高了約66%；突變體E2M6的底物親和力較BAA顯著提高,最大反應(yīng)速度雖有所降低,但突變體E2M6的淀粉水解效率(κcat/Km)有所提升,較BAA提高了1.75倍。

表2 突變體E2M6的酶促學(xué)動(dòng)力學(xué)特征Table 2 The kinetic parameters of the mutant E2M6

3 結(jié)論

通過(guò)研究,本文獲得了BAA工業(yè)應(yīng)用性能顯著提升的突變體,其活力的鈣離子依賴性顯著降低,最適作用溫度有所提高,更適合淀粉加工工業(yè)應(yīng)用需求。