陳霓 劉秋洪 吳丹
(1.成都市第三人民醫(yī)院腎內(nèi)科,四川 成都 610031;2.四川省革命傷殘軍人醫(yī)院老年病科,四川 成都 610502)
尿毒癥是指慢性腎功能衰竭進展至終末期出現(xiàn)的一系列綜合征,其病死率較高,且近年來發(fā)病率呈上升趨勢,極大危害患者生命健康。腎小球疾病是引起尿毒癥主要原因,約占54.2%,當腎小球濾過率降低≤50 mL/min時,受高磷血癥、維生素D受體缺乏、低鈣血癥等因素影響,血清甲狀旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH)水平明顯升高[1-2]。血清PTH過度增高不僅可導致腎性骨病,亦可造成紅細胞生成系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)的負性影響,成為一種新型的尿毒癥毒素[3]。而腎小球系膜細胞(Glomerular mesangial cells,GMC)是腎小球中重要固有細胞,其過度增殖是腎臟纖維化、尿毒癥主要病因[4-5]。目前關于PTH及其對GMC體外增殖、磷脂酰肌醇-3/蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信號通路的影響尚缺乏可靠循證支持。本研究從該角度出發(fā),探討尿毒癥患者血清對大鼠GMC體外增殖、PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響,旨在為尿毒癥防治提供參考,現(xiàn)報告如下。
1.1 一般資料 選取2015年1月~2018年9月成都市第三人民醫(yī)院腎內(nèi)科收治的72例尿毒癥患者,尿常規(guī)檢查提示尿比重固定或下降,尿蛋白陽性,有不同程度血尿和管型尿,可伴有紅細胞壓積、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白、網(wǎng)織紅細胞減少。生化檢查腎小球濾過率50~90 mL/min,血肌酐、血尿素氮正常為腎功能不全代償期;腎小球濾過率20~50 mL/min,血肌酐186~442μmol/L、血尿素氮>7.1 mmol/L為腎功能不全代償期;腎小球濾過率10~20 mL/min,血肌酐451~707μmol/L、血尿素17.9~28.6 mmol/L為腎功能衰竭期;腎小球濾過率<10 mL/min,血肌酐>707μmol/L、血尿素>28.6 mmol/L為腎功能衰竭終末期?;颊呔唇邮芑钚跃S生素D治療,無糖尿病及明顯感染,并簽署知情同意書,根據(jù)血清PTH水平分為正常組16例、輕中度增高組33例、重度增高組23例,本研究經(jīng)我院倫理委員會審核通過。
1.2 方法
1.2.1 主要材料、試劑與儀器 大鼠GMC細胞株;DMEM細胞培養(yǎng)基;胎牛血清;碘化丙啶;兔抗大鼠mTOR抗體;RNA酶;二甲基亞砜;丙酮;胰蛋白酶;兔抗人Caspase-3單抗;FITC標記山羊抗兔IgG;碳酸氫鈉干粉;10%山羊血清封閉液;顯微鏡(日本Olympus公司);流式細胞儀(德國Partec公司);激光共聚焦顯微鏡(德國CRALZEISS);酶標儀(美國BIOTEK公司)。以上材料、試劑均購于武漢博士德生物工程有限公司。
1.2.2 尿毒癥患者血清標本采集 常規(guī)消毒肘部皮膚,采集尿毒癥患者空腹靜脈血5 mL,實施離心處理,以免疫化學熒光法檢測血清PTH水平,并根據(jù)檢測結(jié)果分為正常組16例(PTH 1~10 pmol/L)、輕中度增高組33例(PTH 11~30 pmol/L)、重度增高組23例(PTH>30 pmol/L)。
1.2.3 大鼠GMC細胞培養(yǎng) 大鼠GMC細胞常規(guī)培養(yǎng)于含5%~8%胎牛血清和抗生素DMEM細胞培養(yǎng)基,放置于二氧化碳培養(yǎng)箱(5%、37℃)中,當細胞生長至70%~80%融合密度時,應用胰蛋白酶(0.25%)消化傳代繼續(xù)培養(yǎng),每周傳代1~2次,細胞傳代培養(yǎng)至第3~8代用于實驗。
1.2.4 血清PTH對大鼠GMC細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期大鼠GMC細胞接種于96孔培養(yǎng)板(1×104個/孔),200 μL/孔,放置于二氧化碳培養(yǎng)箱(5%、37℃)中,24 h細胞貼壁后更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,促使同步靜止,棄上清,分別加入20%正常組、輕中度增高組、重度增高組血清的培養(yǎng)液,作用12 h、24 h、48 h,各時間點設置9個復孔。臺盼藍染色,活細胞>95%,干預結(jié)束前4 h加入5 g/L噻唑藍,酶標儀設置690 nm參考波長,讀取492 nm波長光密度值,重復3次,取平均數(shù)作為最終數(shù)值。
1.2.5 血清PTH對大鼠GMC細胞周期影響 取對數(shù)生長期大鼠GMC細胞接種于6孔板(2×105個/孔),2 mL/孔,復孔均為3個,放置于二氧化碳培養(yǎng)箱(5%、37℃)中,24 h細胞貼壁后更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,促使同步靜止,棄上清,分別加入20%正常組、輕中度增高組、重度增高組血清作用48 h,胰蛋白酶消化處理,PBS洗,70%預冷乙醇懸浮固定細胞,吹打混勻,過夜(-20℃),去除乙醇,實施2遍PBS洗,再用500 μL PBS重懸細胞,加入12.8 μL核糖核酸和5 μL碘化丙啶避光顯色,保存30 min以上,應用流式細胞儀與GMCYCLE軟件進行細胞周期分析。
1.2.6 免疫熒光法測定GMC細胞中mTOR的表達 取對數(shù)生長期大鼠GMC細胞以2×104個/mL接種于蓋玻片24孔板(1 mL/孔)中,細胞貼壁后更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,促使同步靜止,棄上清,分別加入20%正常組、輕中度增高組、重度增高組血清作用48 h,取出蓋玻片,冷丙酮固定處理,山羊血清封閉,加入1∶100兔抗大鼠mTOR抗體,過夜(4℃),滴加FITC標記山羊抗兔IgG,反應2 h(避光),甘油封片,顯微鏡觀測并掃描成像。
1.2.7 免疫印跡法測定GMC細胞中Caspase-3表達 GMC細胞接種于6孔板中(1×106個/mL),2 mL/孔,PBS洗,加入細胞裂解液,冰上靜置后實施離心,每孔每次加樣10 μL,電泳分離,轉(zhuǎn)移蛋白值膜上,5%脫脂奶粉封閉于4℃下3 h,加入兔抗人Caspase-3單抗,過夜,洗膜后加入辣根過氧化物酶標記二抗,孵育2 h(室溫),加入化學發(fā)光試劑進行定量分析。
1.3 觀察指標 比較3組12 h、24 h、48 h GMC細胞光密度值;3組GMC細胞周期時相分布;3組mTOR、Caspase-3表達情況。
2.1 3組一般資料比較 3組性別、體質(zhì)量、年齡、病程、血肌酐、血尿素氮等,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。
表1 3組一般資料比較Table 1 Comparison of general data in three groups
2.2 GMC細胞光密度值 正常組、輕中度增高組、重度增高組12 h、24 h、48 h GMC細胞光密度值比較差異顯著(P<0.05);重度增高組12 h、24 h、48 h GMC細胞光密度值均高于正常組、輕中度增高組,且輕中度增高組12 h、24 h、48 h GMC細胞光密度值均高于正常組(P<0.05);3組GMC細胞光密度值在12 h、24 h、48 h隨時間推移逐漸遞增(P<0.05),見表2。
表2 3組GMC細胞光密度值比較Table 2 Comparison of optical density in three groups of gmc cells
2.3 GMC細胞周期時相分布 正常組、輕中度增高組、重度增高組GMC細胞周期時相分布比較差異顯著(P<0.05);與正常組相比,輕中度增高組、重度增高組GMC細胞進入S、G2/M期明顯增多(P<0.05);重度增高組GMC細胞進入S、G2/M期細胞多于輕中度增高組(P<0.05),見表3。
表3 比較3組GMC細胞周期時相分布Table 3 Phase distribution of cell cycle in three groups of GMC
2.4 mTOR、Caspase-3表達情況 正常組、輕中度增高組、重度增高組mTOR、Caspase-3表達量比較差異顯著(P<0.05);輕中度增高組、重度增高組mTOR表達量高于正常組,Caspase-3表達量低于正常組(P<0.05);重度增高組mTOR表達量高于輕中度增高組,Caspase-3表達量低于輕中度增高組(P<0.05),見表4。
表4 比較3組mTOR、Caspase-3表達情況Table 4 Comparison of expression in three groups of mTOR and Caspase-3
系膜細胞是腎臟3種固有細胞之一,是血漿大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)運通道,具有分泌系膜基質(zhì)作用,可支持與保護腎小球毛細血管袢,且兼具平滑肌細胞功能,能調(diào)節(jié)腎小球系膜通道與濾過功能,控制腎小球毛細血管血流量[6-7]。當GMC受到外界因素刺激時,可發(fā)生活化、增殖、收縮,形成肌成纖維細胞,造成濾過面積減少,濾過分數(shù)降低,腎功能進行性惡化[8-9]。目前普遍認同炎癥、免疫、氧化等是以上事件發(fā)生的重要原因,但血清對GMC細胞增殖影響尚不明確。有研究指出,GMC細胞增殖與尿毒癥病情、預后具有一定相關性[10-11]。本研究結(jié)果顯示,正常組、輕中度增高組、重度增高組12、24、48 h GMC細胞光密度值依次呈增高趨勢(P<0.05),提示尿毒癥患者血清能促進GMC細胞增殖,且血清PTH水平越高,GMC細胞增殖越明顯。同時3組GMC細胞光密度值在12、24、48 h隨時間推移逐漸遞增(P<0.05),提示GMC細胞增殖呈時間依賴性。
正常情況下,GMC增殖與凋亡處于動態(tài)平衡中,以維持腎小球正常濾過功能[12-13]。而細胞生長增殖是通過細胞周期實現(xiàn)的,G1期細胞增多常提示細胞周期進程阻滯,S、G2/M期增多常提示細胞凋亡阻滯[14-15]。本研究結(jié)果顯示,與正常組相比,輕中度增高組、重度增高組GMC細胞進入S、G2/M期明顯增多,重度增高組GMC細胞進入S、G2/M期細胞多于輕中度增高組(P<0.05),說明尿毒癥患者GMC細胞凋亡阻滯,增殖與凋亡平衡紊亂,這是其腎功能衰竭發(fā)生的重要原因。相關報道指出,將細胞周期阻滯于G1期可抑制GMC細胞增殖,改善腎臟疾病患者病情[16-17]。此外,Caspase-3是Caspase家族成員之一,激活后可介導結(jié)構(gòu)與調(diào)節(jié)蛋白的裂解,反映細胞內(nèi)凋亡機制的啟動,在細胞凋亡中具有不可替代作用[18-21]。本研究在以上研究基礎上發(fā)現(xiàn),正常組、輕中度增高組、重度增高組Caspase-3表達量依次降低(P<0.05),與以上研究相符,提示尿毒癥患者血清PTH越高,細胞凋亡越少,這符合GMC細胞過度增殖狀態(tài)。
PI3K/Akt/mTOR信號通路是機體經(jīng)典信號通路之一。有學者研究指出[23-24],PI3K/Akt/mTOR信號通路與腫瘤細胞增殖有關。PI3K磷酸化磷脂酰肌醇(PI)的肌醇環(huán)上有5個可被磷酸化位點,其中PI-3-磷酸能刺激細胞遷移,PI-3,4-二磷酸可促進細胞增殖,抵抗細胞凋亡,PI-3,4,5-三磷酸能調(diào)節(jié)細胞黏附、生長、存活,因此PI3K/Akt/mTOR信號通路與GMC細胞增殖有關[25-28]。鐘利平等[31]指出,腎纖維化模型小鼠PI3K/AKT/mTOR信號通路表達量較高。張春江等[30]研究指出,下調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號通路可抑制大鼠GMC細胞增殖。本研究結(jié)果顯示,正常組、輕中度增高組、重度增高組mTOR表達量依次升高(P<0.05),說明尿毒癥患者血清PTH可調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路表達,這可影響GMC細胞增殖情況,故推測PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑可抑制GMC細胞增殖,有利于緩解患者病情,但詳情及可靠性有待大樣本量的深入研究。慢性腎臟病患者通常在3期逐漸出現(xiàn)PTH升高,本研究不足之處在于,納入患者中較多PTH完全正常的患者,可能造成納入樣本的偏倚,有待后續(xù)的進一步研究。
尿毒癥患者血清可導致GMC增殖,且甲狀旁腺功能亢進可促進GMC增殖,提高PI3K/Akt/mTOR信號通路表達,PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制劑可能有助于抑制GMC增殖,延緩尿毒癥患者腎功能衰竭進程,有望為早期預防腎功能衰竭提供一個新靶點。