苗潤燕，劉華，田源

子宮肌瘤是一種子宮肌層的良性腫瘤，在臨床上非常普遍，調查顯示子宮肌瘤在50歲以下女性中的累積發(fā)病率高達70%左右，且有逐年上升的趨勢[1-5]。迄今為止，其病因及發(fā)病機制仍不清楚。既往大量研究證實在子宮肌瘤組織中調控細胞凋亡的B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族存在異常高表達，如抗凋亡相關基因Bcl-2的表達顯著增加，而促凋亡基因Bax(Bcl-2 associated X protein)表達明顯減少，這導致子宮肌瘤細胞中Bcl-2/Bax比值異常升高，上述現(xiàn)象提示Bcl-2/Bax調控的細胞凋亡障礙可能參與子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展[6-8]。Bax抑制因子1(Bax inhibitor-1，BI-1)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種同時存在于動植物中的高度保守性細胞死亡抑制因子，廣泛存在于肺、前列腺、心臟、胎盤等組織中[9-10]。BI-1是Bcl-2與Bax調控細胞凋亡通路上的重要調節(jié)蛋白，研究證實BI-1能夠通過影響細胞內Ca2+濃度而調控線粒體功能從而影響B(tài)cl-2/Bax對凋亡調節(jié)作用，如在多種惡性腫瘤組織中的表達顯著增加的BI-1能夠通過上述作用調控腫瘤細胞的增殖、凋亡等生物學行為，而促進腫瘤的進展[11-13]。然而在子宮肌瘤中BI-1的表達及其對子宮肌瘤細胞增殖及凋亡的影響尚無相關研究。本研究擬通過觀察BI-1在子宮肌瘤組織中的表達，探討其相關作用機制及在子宮肌瘤發(fā)生進展中的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床標本采集

選擇2018年4月至2019年4月于延安市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科因子宮肌瘤行子宮切除術的患者20例，年齡(47.3±2.6)歲，均未絕經(jīng)。瘤旁組織為肌瘤旁≥5 cm處正常子宮肌肉組織。術中待子宮離體后迅速采集新鮮組織約15～25 g，30 min內運回實驗室進行-80℃儲藏備用。20例患者中14例為多發(fā)性肌瘤(70%)，6例為單發(fā)肌瘤(30%)；肌壁間肌瘤12例(60%)，混合性肌瘤8例(40%)。所有患者均經(jīng)病理HE及免疫組化染色證實為子宮平滑肌瘤。

納入標準：① 滿足子宮肌瘤的病理學診斷；② 標本具有足量的對應瘤旁組織；③ 患者1年內未經(jīng)任何腫瘤相關治療，如服用免疫抑制劑、放療或化療等；④ 患者及家屬對本研究目的表示知曉理解，并簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院倫理委員會審批。

1.2 主要試劑

0.25%胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；胎牛血清(FBS)、青鏈霉素混合液(均為100 U/mL)(杭州四季青生物公司)；PCR試劑盒(上?？禐槭兰o)；PCR引物(上海生工)；Opti-MEM培養(yǎng)基(美國Invitrogen 公司)；靶向沉默BI-1的小干擾RNA(si-BI-1)及其陰性對照序列(si-negative control,si-NC)(上海吉瑪生物)；JC-1線粒體膜電位檢測盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(江蘇碧云天)；兔抗Bcl-2、Bax、Cleavd-caspase-3、GAPDH單克隆抗體(美國Abcam公司)；大鼠抗BI-1單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；大鼠抗Cyt-C(美國Affinity公司)；辣根過氧化酶(HRP)標記的山羊抗兔、抗大鼠IgG(廣州晶彩生物公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 原代子宮肌瘤細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 取收集的肌瘤組織，膠原酶溶解法加差異貼壁法進行原代細胞的分離。使用含10% FBS，1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)分離所得的肌瘤細胞，并置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，待細胞生長融合至80%～90%以上時可使用胰酶進行消化傳代。選取傳代至第3代以后且生長狀態(tài)良好的子宮肌瘤細胞，應用α-Actin進行免疫細胞染色進行純度鑒定。

1.3.2 細胞轉染及分組 轉染前24 h，取處于對數(shù)生長期的子宮肌瘤細胞進行常規(guī)消化后，細胞計數(shù)，按1×106個/mL接種于6孔板中，待細胞生長融合至80%時，根據(jù)LipofectamineTM3000說明書方法將si-BI-1、si-NC轉染入細胞中。將轉染后的細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后即可進行檢測轉染效率及后續(xù)相關實驗。按細胞轉染情況的不同將其分為3組：Control組，即正常培養(yǎng)未轉染的肌瘤細胞；si-BI-1組，即轉染BI-1的肌瘤細胞；si-NC組，即轉染si-NC組。上述各組細胞均使用10% FBS，1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液中，并置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。

1.3.3 CCK-8檢測細胞增殖能力 收集生長狀態(tài)良好的各組肌瘤細胞，進行常規(guī)消化后，接種至96孔板中，調整細胞密度至1×103個/孔,并向每孔加入200 uL含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細胞生長融合至70%～80%時，棄除原培養(yǎng)液，更換為用不含血清的DMEM/F12繼續(xù)培養(yǎng)細胞。分別于培養(yǎng)0 h、12 h、24 h、36 h、48 h時向每孔加入10 μL的CCK-8試劑，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用酶標儀于490 nm波長處檢測每孔吸光度值(OD490)，每個時間點每組設置5個復孔，繪制細胞的生長曲線。

1.3.4 Annexin V-FITC流式細胞術檢測細胞凋亡 取生長狀態(tài)良好的各組子宮肌瘤細胞， 130 g離心5 min，棄上清，收集細胞沉淀，用195 μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞，并調整細胞至7×105個/mL，依次加入5 μL Annexin V-FITC及10 μL的碘化丙啶(PI)染色液，輕輕搖晃離心管以充分混勻后，室溫下避光孵育半小時。300目濾膜過濾細胞團塊后，進行流式細胞儀檢測。實驗單獨重復3次。

1.3.5 JC-1法檢測細胞線粒體膜電位水平 取生長狀態(tài)良好的各組子宮肌瘤細胞進行常規(guī)消化后，PBS重懸細胞后并將細胞調整至5×105個/mL，取1 mL的細胞懸液于EP管中并加入0.5 mL的JC-1染色工作液，于37℃孵育20 min，4℃下800 g離心5 min，收集細胞沉淀， 重懸于1 mL的JC-1染色緩沖液中后，進行流式細胞儀檢測。實驗單獨重復3次。

1.3.6 細胞內鈣離子濃度測量 取生長狀態(tài)良好的各組子宮肌瘤細胞進行常規(guī)消化后，調整至1×105個/mL，取100 μL的細胞懸液接種至6孔板中，待細胞生長融合至70%～80%時，在無血清培養(yǎng)基中孵育24 h，胰酶消化貼壁的細胞后，130 g離心5 min，收集細胞沉淀。對于細胞內Ca2+的測量，在上述細胞沉淀中加入3 uM Fluo-4 AM，并于培養(yǎng)箱中孵育20 min；對于線粒體中的Ca2+測量，在收集的細胞沉淀中加入3 uM Rhod-2 AM，并于4℃中進行孵育30 min。上述孵育后的細胞使用Hank’s 平衡液洗滌后，300目濾膜過濾細胞團塊后，進行流式細胞儀檢測。實驗單獨重復3次。

1.3.7 實時熒光定量PCR(RT-PCR) 采用Trizol法提取待測組織或細胞中總RNA，分光光度計檢測濃度與純度后，根據(jù)逆轉錄試劑說明書逆轉錄為cDNA。再按照RT-PCR試劑說明書及預實驗確定的反應時間與溫度進行實時定量，RT-PCR反應條件為：95℃(30s)預變性后，變性95℃(7 s)→退火60℃(30 s)→72℃(15 s)，40個循環(huán)周期。RT-PCR引物為:BI-1上游引物為5′-CCTCTTCTGGTGGATGC-3′，下游引物為5′-GCCTCGCTCTGTTGATGTGA-3；GAPDH上游為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游為5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。以GAPDH為內參，采用2-△△Ct方法分析BI-1 mRNA的表達量。上述實驗單獨重復3次。

1.3.8 Western blot實驗 將子宮肌瘤組織及瘤旁組織在液氮中進行研磨，采用RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑于冰上進行組織或細胞中總蛋白的提取。BCA法進行蛋白定量，按照1∶4向上清液中加入5×上樣緩沖液，并于沸水中加熱變性10 min。取35 ug的蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳進行蛋白分離，采用濕轉法將分離的蛋白轉至PVDF膜上，5%的脫脂牛奶于室溫下封閉2 h后,分別加入BI-1(1:300)、Bcl-2(1∶800)、Bax(1∶1 000)、Cleaved caspase-3(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)一抗，4℃搖床孵育過夜。TBST溶液清洗3次，5 min/次，以HRP標記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，以TBST溶液清洗3次，5 min/次，最后在載有蛋白條帶的PVDF膜上均勻滴加ECL發(fā)光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照。Image J軟件測定條帶灰度值，以目標蛋白與內參GAPDH的比值作為其相對含量。以上實驗單獨重復3次。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 BI-1在子宮肌瘤及瘤旁組織中的表達

RT-PCR及Western blot實驗檢測20對組織樣本顯示， BI-1在子宮肌瘤中的mRNA及蛋白表達較瘤旁組織均顯著增加(P<0.05)。見下頁圖1A,B。

注：A圖為RT-PCR實驗檢測BI-1 mRNA在子宮肌瘤及瘤旁組織中的表達；B為Western blot實驗檢測BI-1蛋白在子宮肌瘤及瘤旁組織中的表達；a為肌瘤組織，b為瘤旁組織；與肌瘤組織相比，**P<0.01。

2.2 分離培養(yǎng)子宮肌瘤細胞的鑒定

體外分離培養(yǎng)的原代子宮肌瘤細胞經(jīng)α-Actin免疫染色后，結果顯示超過90%的細胞胞質內可見棕黃色陽性染色，提示分離培養(yǎng)的原代子宮肌瘤細胞純度較高，可滿足后續(xù)實驗研究。見下頁圖2。

圖2 免疫組織化學鑒定分離培養(yǎng)的原代子宮肌瘤細胞(×40)

2.3 轉染si-BI-1后子宮肌瘤細胞中BI-1 mRNA與蛋白表達

RT-PCR及Western blot實驗檢測轉染后子宮肌瘤細胞中BI-1 mRNA的表達，結果顯示與正常培養(yǎng)的Control組子宮肌瘤細胞相比，si-BI-1組細胞中BI-1 mRNA的表達顯著降低(P<0.01)，而si-NC組細胞中BI-1 mRNA的表達無明顯變化(P>0.05)。見下頁圖3。

注：與Control組細胞相比，**P<0.01。

2.4 沉默BI-1對子宮肌瘤細胞增殖的影響

CCK-8檢測沉默BI-1基因對子宮肌瘤細胞增殖的影響，結果顯示隨培養(yǎng)時間的延長，3組子宮肌瘤細胞的增殖能力無明顯變化(P>0.05)。見圖4。

圖4 3組子宮肌瘤細胞增殖能力變化圖

2.5 沉默BI-1對子宮肌瘤細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC細胞流式檢測沉默BI-1基因對子宮肌瘤細胞凋亡的影響，結果顯示與Control組子宮肌瘤細胞相比，si-BI-1組細胞的凋亡率明顯增加(P<0.01)，而si-NC組細胞凋亡率無明顯變化(P>0.05)。見下頁圖5。

注：與Control組細胞相比，*P<0.05。

2.6 沉默BI-1對子宮肌瘤細胞線粒體膜電位的影響

JC-1流式檢測沉默BI-1對子宮肌瘤細胞中線粒體膜電位的影響，結果顯示與Control組相比，si-BI-1組中細胞的線粒體膜電位顯著降低(P<0.05)，而si-NC組細胞凋亡率無明顯變化(P>0.05)，見下頁圖6。

注：與Control組細胞相比，**P<0.01。

2.7 沉默BI-1對子宮肌瘤細胞線粒體鈣離子濃度的影響

流式細胞術檢測沉默BI-1對子宮肌瘤細胞線粒體Ca2+濃度的影響，結果顯示與Control組細胞相比，si-BI-1組細胞的胞質及線粒體中的Ca2+濃度均顯著增加(P<0.05)，其中以線粒體中的Ca2+濃度升高更為顯著；而si-NC組細胞的Ca2+濃度無明顯變化(P>0.05)，見下頁圖7A，B。

注：與Control組細胞相比，*P<0.05。

2.8 沉默BI-1對子宮肌瘤細胞中Cyt-C及凋亡相關蛋白表達的影響

Western blot檢測沉默BI-1對子宮肌瘤細胞中Cyt-C及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax及Cleaved caspase-3表達的影響，結果顯示與Control組相比，si-BI-1組中細胞的Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)，Bax、Cleaved caspase-3及Cyt-C蛋白表達明顯增加(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.05)，si-NC組細胞的上述蛋白均無明顯變化(P>0.05)。見下頁圖8。

注：與Control組細胞相比，*P<0.05，** P<0.01。

3 討論

盡管子宮肌瘤不是女性生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤，但其能引起多種與婦科及生殖相關的棘手問題，如異常子宮出血、慢性盆腔疼痛、復發(fā)性流產(chǎn)，甚至不孕等[2,4]。長期以來，臨床上對子宮肌瘤的治療方法多為子宮切除術或肌瘤切除/剔除術，但手術治療不僅嚴重影響患者的生活質量，且肌瘤切術/剔除術后仍有不少患者會出現(xiàn)肌瘤的復發(fā)[5]，因此積極探究子宮肌瘤的分子機制有望從源頭上阻遏疾病的發(fā)生及進展。

既往大量數(shù)據(jù)證實，控制細胞凋亡基因的異常表達在子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，其中最為重要的是Bcl-2基因家族。Bcl-2家族主要分為兩類，一類是以Bcl-2為代表的抗凋亡基因與一類以Bax為代表的促凋亡基因[6-8]。在正常生理狀態(tài)下，Bcl-2家族基因根據(jù)不同上游信號傳導的信息激活特定的下游基因，并誘導相應基因的表達與轉錄，從而調控細胞的凋亡與存活，從而維持細胞代謝的穩(wěn)定[14]。Bcl-2基因廣泛表達于多種細胞的線粒體、內質網(wǎng)以及細胞核膜等細胞器表面，通過調控細胞周期進展，并影響Ca2+內流等多種機制抑制細胞發(fā)生凋亡[15]。而促凋亡基因Bax能夠拮抗Bcl-2的抗凋亡作用，其主要通過結合線粒體膜上的糖蛋白，以形成Bax/Bax同源二聚體結構，進而導致線粒體膜損傷及膜電位的下降，最終導致細胞的凋亡[16]。BI-1是一種新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因，其蛋白產(chǎn)物能夠抑制由Bax、星形細胞素等引起的細胞凋亡[9]。既往對其的研究發(fā)現(xiàn)，BI-1并非與Bax直接作用，而是與抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL相互結合，通過改變其自身的表達，以調節(jié)BI-1/Bcl-XL/Bcl-2和Bax比值，調控細胞的凋亡[10]。同時BI-1還能有效抑制Bax/Bax同源二聚體的形成，從而阻止其誘導的線粒體對Cyt-C的釋放，抑制該途徑引起細胞凋亡的發(fā)生[17-18]。此外，有研究報道，BI-1/Bcl-2二聚體能夠與線粒體通透性轉換孔(MPTP)的主要組成成分進行結合，從而通過維持線粒體膜電位的穩(wěn)定，以保護線粒體結構及功能的完整，進而發(fā)揮抗凋亡作用[19]?；贐I-1的上述抗凋亡作用機制，既往大量研究證實在多種腫瘤組織中異常增加的BI-1能夠通過上述機制促進腫瘤細胞的增殖并抑制其發(fā)生凋亡[12-13]。

本研究首先通過檢測子宮肌瘤組織與瘤旁組織中BI-1的表達，證實BI-1在子宮肌瘤組織中同樣表現(xiàn)為異常高表達。利用siRNA干擾技術，沉默原代分離培養(yǎng)的子宮肌瘤細胞中BI-1基因，采用相關實驗檢測發(fā)現(xiàn)沉默肌瘤細胞中BI-1基因表達不影響細胞的增殖能力，但能夠促進細胞發(fā)生凋亡。鑒于Bcl-2、Bax及BI-1均能影響線粒體功能且主要通過線粒體途徑影響細胞凋亡，我們進一步通過實驗檢測沉默BI-1基因對子宮肌瘤細胞線粒體膜電位及細胞中Ca2+濃度的影響，結果顯示沉默BI-1基因能夠通過促進線粒體及胞質中的Ca2+濃度的增加，以誘導子宮肌瘤細胞線粒體膜電位的下降。而線粒體膜電位是離子在跨膜轉運時所產(chǎn)生的膜外正電位，而線粒體基質能夠產(chǎn)生大量負電荷，這導致線粒體內外膜兩側形成電位差。在細胞受到持續(xù)性有害刺激時，線粒體通透性增加，膜電位下降從而啟動線粒體途徑的細胞凋亡事件[17]。這與Lee等[20]研究發(fā)現(xiàn)的BI-1能夠通過影響Ca2+濃度，以調控線粒體功能的結果相似。最后我們通過Western blot實驗證實沉默BI-1基因能夠通過促進細胞中Cyt-C、Bax及Cleaved caspase-3蛋白表達的增加，而降低Bcl-2蛋白水平。Cyt-C一般存在于線粒體的內外膜間隙之間，生理條件下其不能穿過線粒體外膜到達細胞質，而線粒體膜電位的變化及結構損傷時，Cyt-C從線粒體內釋放到胞漿中，并作為重要的促凋亡因子，在三磷酸脫氧腺苷的協(xié)同作用下與凋亡蛋白酶活化因子-1相互結合，激活Caspase-3，啟動Caspases的級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡的發(fā)生。其中Caspases的活化是凋亡的中心環(huán)節(jié)，而Caspase-3是細胞凋亡過程中的關鍵執(zhí)行者，它的活化是凋亡進入不可逆階段的標志[21]。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)BI-1在子宮肌瘤組織中的表達顯著增加，沉默子宮肌瘤細胞中BI-1基因可能通過改變Bcl-2/Bax比值，促進胞質及線粒體中Ca2+濃度的增加，進而引起線粒體膜電位的下降，最終誘導細胞發(fā)生凋亡。本研究首次探究并報道了BI-1在子宮肌瘤中的表達及相關作用，為進一步闡明子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制提供了一定的理論基礎及實驗室依據(jù)。