劉晶晶，劉瑩*，李玉珍

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指在妊娠期間出現(xiàn)不同程度的葡萄糖耐受不良，從而導(dǎo)致的高血糖代謝疾病[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約10%左右孕婦患有GDM，且其發(fā)病率逐年增加[2]。由于胎盤激素的抗胰島素作用，孕婦脂肪組織增加和胰島素抵抗被認(rèn)為是引起GDM的主要因素，GDM的進(jìn)一步發(fā)展將會增加妊娠期其他并發(fā)癥的發(fā)生率，且妊娠后患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)也越來越高[3]，嚴(yán)重威脅產(chǎn)婦與嬰兒的健康。

細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白-3(suppressor of cytokine signaling-3,SOCS-3)是細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白家族成員，由細(xì)胞產(chǎn)生并反饋性阻斷細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，參與多種細(xì)胞因子、生長因子和激素的信號調(diào)節(jié)[4]。SOCS-3可以抑制白細(xì)胞介素-1受體(interleukin-1 receptor,IL-1R)、腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor,TNF-R)可溶性蛋白和白細(xì)胞介素-6受體(interleukin-6 receptor，IL-6R)信號通路[5]。研究表明，SOCS-3及其這些負(fù)性調(diào)節(jié)因子與GDM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。本研究通過探討 SOCS-3在 GDM胎盤組織的表達(dá)情況，以及過表達(dá)SOCS-3對滋養(yǎng)細(xì)胞增殖與凋亡能力的影響，為靶向治療GDM奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料采集

選取 2018年6月至 2019 年12 月于西安市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科住院分娩的GDM患者 50例和同期健康孕婦50例。所有孕婦均為單胎，均因不同原因?qū)嵤┢蕦m產(chǎn)手術(shù)分娩，無其他病史，均簽署知情同意書。GDM患者均符合世界衛(wèi)生組織 GDM 診斷標(biāo)準(zhǔn)。待胎盤娩出后，取母體中央胎盤臍帶根部組織1 cm×1 cm×1 cm大小塊，注意避開出血、壞死與鈣化區(qū)域，使用PBS溶液漂洗后，一部分置于液氮中快速冷凍后，保存于-80℃冰箱中，另一部分固定于10%甲醛中。

1.2 主要材料與試劑

人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞株HTR-8/SVneo細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。引物和pCR 3.1/SOCS-3載體均由上海生工生物公司構(gòu)建合成。10%胎牛血清、青霉素/鏈霉素與DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Hyclone公司，Trizol試劑盒、cDNA合成試劑盒與SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒購自美國Thermo Scientific公司，CCK-8 試劑盒和AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白檢測試劑盒與發(fā)光液ECL購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，0.1%結(jié)晶紫染色液和免疫組化染色試劑購自北京雷根生物技術(shù)有限公司，SOCS-3、GAPDH一抗與辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗購自美國Abcam公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色檢測細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白-3表達(dá)

將固定好的胎盤組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，切成厚度為4 μm的薄片，脫蠟至水后，滴加2% 乙二胺四乙酸(EDTA)溶液高溫下進(jìn)行抗原修復(fù)，使用3% H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶。滴加兔抗SOCS-3(1∶200)在4℃過夜，次日PBS 沖洗，滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶1 000)，室溫下孵育1 h，PBS 沖洗后，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，在電鏡下觀察，組織中特異性淡黃色、棕黃色顆粒即為陽性表達(dá)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染

在HTR-8/SVneo細(xì)胞中加入含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于六孔板中孵育過夜，待細(xì)胞長滿瓶底50%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞隨機(jī)分為3組：空白對照組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與SOCS-3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。根據(jù)Lipofectamine 2000試劑說明操作，分別將構(gòu)建好的pCR 3.1 空質(zhì)粒載體與pCR 3.1/SOCS-3載體轉(zhuǎn)染至空質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染組與SOCS-3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后收集細(xì)胞。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白-3 mRNA表達(dá)

使用Trizol試劑提取GDM患者和健康孕婦胎盤組織及各處理組HTR-8/SVneo細(xì)胞的總RNA。按照cDNA合成試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 檢測SOCS-3 mRNA表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參基因。擴(kuò)增條件包括95°C 5 min(1個(gè)循環(huán))；95°C 30 s， 60°C 15 s， 72°C 30 s(40個(gè)循環(huán))。采用2-ΔΔCt法計(jì)算SOCS-3 mRNA相對表達(dá)量。使用引物序列如下：SOCS-3上游引物5′-CAGATCCACGCTGGCTCC-3′，下游引物5′- CGGTTGGACTTCTTGTTG-3′，β-actin上游引物:5′-CCTGGCACCCAGCACGCTTC-3′，下游引物:5′- GCCGATCCACACGGAGTAC-3′。

1.6 Western blot 檢測細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白-3蛋白表達(dá)

在各處理組HTR-8/SVneo細(xì)胞中加入RIPA細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞的總蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。以每孔30 μg蛋白的量上樣，進(jìn)行10% SDS-PAGE 電泳，將分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，滴加兔抗SOCS-3(1∶200)與內(nèi)參GAPDH(1∶1 000)抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜，滴加HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶1 000)，室溫孵育2 h，TBST 洗膜后，滴加化學(xué)發(fā)光液ECL 顯色，凝膠成像系統(tǒng)中曝光，采用Image J圖像分析軟件分析各條帶灰度值。

1.7 CCK-8 檢測細(xì)胞活性

各處理組HTR-8/SVneo細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種至 96 孔板，在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h后分別取出細(xì)胞，在每孔中加入10 μL CCK-8溶液，輕輕混勻，繼續(xù)孵育 2 h，根據(jù)CCK-8 試劑盒說明，在酶標(biāo)儀上450 nm處檢測各孔細(xì)胞光密度(OD)。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布

將各處理組HTR-8/SVneo細(xì)胞用 PBS 洗滌，使用預(yù)冷的75%乙醇重懸后在-20℃下固定24 h，PBS再次洗滌并重懸細(xì)胞，每組取 450 μL 細(xì)胞懸液，加2 μL RNase后，37℃下孵育 10 min，接著加500 μL 碘化丙啶(PI)，置于37℃下避光孵育30 min，過300 目篩網(wǎng)，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況。

1.9 Annexin V-FITC/PI染色、Hoechst 33342染色檢測細(xì)胞凋亡

將各處理組HTR-8/SVneo細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板過夜培養(yǎng)，使用胰蛋白酶消化后收集， PBS洗滌細(xì)胞。根據(jù)Annexin V-FITC試劑盒進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，加入500 μL 1×Binding Buffer重細(xì)胞，接著加入5 μL Annexin V-FITC結(jié)合液與10 μL PI混勻，室溫避光孵育15 min，立即通過流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況。

將各處理組HTR-8/SVneo細(xì)胞使用4% 多聚甲醛固定過夜，以0.5% Triton×100透化15 min，PBS洗滌細(xì)胞，滴加終濃度5 μg/mL Hoechst 33342染色，室溫避光孵育30 min，PBS再次洗滌，脫水后中性樹膠封片，使用熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 胎盤組織中細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白-3表達(dá)檢測

qRT-PCR檢測 SOCS-3 mRNA在50例GDM患者與50例健康孕婦胎盤組織中表達(dá)的結(jié)果顯示，SOCS-3 mRNA在GDM患者胎盤組織中的表達(dá)水平高于健康孕婦，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

注：*表示GDM患者與健康孕婦胎盤組織比較，P=0.001。

免疫組化染色檢測GDM 患者與健康孕婦胎盤組織中SOCS-3蛋白表達(dá)， SOCS-3在健康孕婦胎盤組織中陽性表達(dá)率為(8.42±1.03)%，GDM患者胎盤組織中SOCS-3陽性表達(dá)率為(30.70±2.87)%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，見圖2。

2.2 pCR3.1/細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白-3轉(zhuǎn)染效率鑒定

qRT-PCR與Western blot 檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，在 pCR3.1/SOCS-3 轉(zhuǎn)染的HTR-8/SVneo細(xì)胞中，SOCS-3 mRNA及蛋白的表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001、0.002)；而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組較空白對照組細(xì)胞中SOCS-3 mRNA及蛋白的表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.751、0.544)，見圖3。提示 SOCS-3 基因轉(zhuǎn)染成功。

注：A：空白對照組；B：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；C：SOCS-3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。與空白對照組比較，*P<0.05。

2.3 過表達(dá)細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白-3對HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖的影響

CCK-8檢測過表達(dá)SOCS-3對HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖能力的影響，與空白對照組比較，SOCS-3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的HTR-8/SVneo細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)細(xì)胞24 h、48 h和72 h，細(xì)胞增殖活性顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.762、8.758、10.029；P=0.003、0.003、0.001)；空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與空白對照組細(xì)胞的增殖活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.585、0.311、0.629；P=0.405、0.411、0.560)，詳見表1。

表1 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞活性比較

空白對照組空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SOCS-3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞比例分布

2.4 過表達(dá)細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白-3對HTR-8/SVneo細(xì)胞周期分布的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)SOCS-3對HTR-8/SVneo細(xì)胞周期分布的影響，與空白對照組比較，SOCS-3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的S期細(xì)胞比例升高而G1期細(xì)胞比例下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=35.786、40.878；P=0.001、0.001)；空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與空白對照組G1期、S期和G2期細(xì)胞比例比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.452、0.358、0.401；P=0.726、0.803、0.719)，見圖4、下頁表2。

表2 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞周期分布比較

2.5 過表達(dá)細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白-3對HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI檢測過表達(dá)SOCS-3對HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡影響，與空白對照組比較，SOCS-3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)；空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與空白對照組的細(xì)胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.801)，見圖5。

注：A：空白對照組；B：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；C：SOCS-3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。*與空白對照組比較， P<0.05。

Hoechst 33342染色檢測結(jié)果同樣顯示，空白對照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組HTR-8/SVneo細(xì)胞細(xì)胞核外圍輪廓較清晰，細(xì)胞大小較為一致，未見明顯的細(xì)胞核濃縮、碎裂等凋亡現(xiàn)象。而SOCS-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的HTR-8/SVneo細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核核固縮、碎裂和溶解的現(xiàn)象，說明細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，見圖6。

3 討論

胎盤作為聯(lián)系母嬰的重要器官，其發(fā)育情況是妊娠的重要影響因素[7]。人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞是胎盤的主要組成成分，在胎盤的發(fā)育過程中，位于母胎屏障最外層的胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞會分泌大量激素和細(xì)胞因子，從而對胎盤形成和功能的維持發(fā)揮著重要作用[8-9]，滋養(yǎng)細(xì)胞功能異常涉及多種妊娠疾病的發(fā)生。多項(xiàng)研究表明，維持滋養(yǎng)細(xì)胞的正常功能，例如增殖、凋亡、侵襲、分化和血管重塑對于確保胚胎的發(fā)育極為重要。

SOCS-3具有阻斷信號傳導(dǎo)通路的作用，已被證實(shí)為JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)節(jié)中最關(guān)鍵的因子，SOCS-3表達(dá)可以抑制Janus激酶(janus kinase,JAK)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activator of transcription,STAT)活性以及信號傳導(dǎo)途徑中一系列細(xì)胞因子的激活，此外，還能夠抑制包括脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、白細(xì)胞介素-4(interleukin-4,IL-4)以及干擾素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)等產(chǎn)生的信號通路途徑[10]。先前已有研究證明，在肝癌、肺癌和乳腺癌等的實(shí)體瘤中均檢測到SOCS-3低表達(dá)，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了SOCS-3表達(dá)下降，并導(dǎo)致了持續(xù)性STAT 3磷酸化和抗腫瘤相關(guān)基因的低表達(dá)[11-12]。而Chatterjee 等[13]通過研究發(fā)現(xiàn)，使用匹格列酮治療糖尿病會明顯減少 SOCS-3 的表達(dá)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)肝炎和胰島素抵抗的現(xiàn)象。洪小蘋等[6]的研究表明，GDM孕婦胎盤和脂肪組織中SOCS-3 mRNA表達(dá)量均升高。本研究的結(jié)果與此前一致，GDM孕婦胎盤組織中SOCS-3 mRNA和蛋白的表達(dá)量均升高。

絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞有助于滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤，使細(xì)胞能夠逐漸移入子宮螺旋動脈，替換血管內(nèi)皮和肌肉內(nèi)膜并擴(kuò)大血管直徑，從而使整個(gè)子宮內(nèi)有足夠胎盤界面。所以，胚胎的成功著床、胎盤的形成及胚胎的生長發(fā)育，與滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、侵襲功能密切相關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)SOCS-3會抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的活性，對細(xì)胞正常增殖產(chǎn)生影響。當(dāng)滋養(yǎng)層細(xì)胞遭受過度的氧化應(yīng)激時(shí)，大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)積聚，并導(dǎo)致妊娠并發(fā)癥發(fā)生[14]。過量的ROS能夠通過線粒體依賴性途徑刺激細(xì)胞凋亡。研究表明，GDM患者胎盤中滋養(yǎng)細(xì)胞異常凋亡會導(dǎo)致胎盤組織生長增加，進(jìn)而引起胎兒過度發(fā)育[15]。本研究結(jié)果顯示，在HTR-8/SVneo細(xì)胞中過表達(dá)SOCS-3后，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，由此說明過表達(dá)SOCS-3可能會導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞增殖能力下降并出現(xiàn)異常凋亡現(xiàn)象。

綜上所述，SOCS-3 在GDM患者胎盤組織中高表達(dá)，過表達(dá)SOCS-3會抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖活性并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，說明SOCS-3與GDM的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可作為生物學(xué)標(biāo)志為GDM的診治及預(yù)后判斷提供理論支持。