盧霞，許旭

宮頸癌在中國(guó)已成為中青年女性的第二大高發(fā)惡性腫瘤，每年新發(fā)病例占全球病例的28%以上[1]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT 1)是一種組蛋白去乙酰化酶，是調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要分子[2]。臨床研究表明SIRT1隨宮頸病變的加重表達(dá)升高，對(duì)宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮促進(jìn)作用，且SIRT1表達(dá)與宮頸癌的不良臨床預(yù)后相關(guān)；體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SIRT1在人乳頭狀瘤病毒(human papilomavirus,HPV)感染的宮頸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)[3-4]。然而SIRT1促進(jìn)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的具體作用機(jī)制目前尚不明確。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激維持細(xì)胞的正常生理活動(dòng)，Nrf2異常激活會(huì)引起Nrf2蓄積，導(dǎo)致Nrf2下游產(chǎn)物增多，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2蛋白在宮頸癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，上調(diào)Nrf2促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，下調(diào)Nrf2的表達(dá)后可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6]。據(jù)報(bào)道，SIRT1在細(xì)胞氧化還原平衡和抗氧化應(yīng)激中起重要作用，Nrf2的表達(dá)可受到SIRT1的正調(diào)控[7]。因此本研究探討SIRT1調(diào)控Nrf2信號(hào)通路對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡及遷移侵襲的影響，從分子角度闡述SIRT1促進(jìn)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自北京天潤(rùn)善達(dá)生物科技有限責(zé)任公司、TRIzol Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司、SIRT1、Nrf2、NQO1、GAPDH普通PCR上下游引物購(gòu)自廣州華大生物科技有限公司、SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)自TaKaRa、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自Thermo Scientific、RIPA裂解液購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自Thermo公司、SIRT1單克隆抗體、Nrf2單克隆抗體、NQO1單克隆抗體、HO-1單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)條件：將Hela細(xì)胞加入到體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞分組：① 空白對(duì)照組：每孔細(xì)胞加入PBS液；② SIRT1陰性對(duì)照組(negative control group，NC組)：每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)照空載體(GFP-SIRT1)；③ SIRT1抑制組：每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIRT1干擾載體(si-SIRT1)。

1.2.2 Western Blot和qRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞SIRT1的表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞參照總蛋白提取試劑盒步驟提取各組細(xì)胞總蛋白，加入等體積上樣緩沖液，沸水浴變性5～10 min。取50 μL變性蛋白樣品至SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中電泳。經(jīng)轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜后浸于含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉。洗滌后加入抗體(1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜，再加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000)常溫下孵育2 h。比較各組細(xì)胞SIRT1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

各組細(xì)胞按照總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明分別提取總RNA及cDNA模板，取1 μL cDNA產(chǎn)物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃ 5 min，94℃變性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸30 s。40個(gè)循環(huán)后72℃維持10 min。引物由廣州華大生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，引物設(shè)計(jì)如下：SIRT1上游5′-GCAACAAGCATCTTGCCTGAT-3′，下游5′-GTGCTACTGGTCTCACTT-3′；GAPDH上游5′-ACGGCCGCATCTTCTTGTGCA-3′，下游5′-TGCCACTG CAAAT- GGCAGCCC-3′。SIRT1基因的相對(duì)表達(dá)量按公式(2-△△Ct法)計(jì)算，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力 待細(xì)胞數(shù)達(dá)到1.0×106/mL后更換為無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。避光條件下每孔加入0.5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄100 μL上清后每孔加DMSO 100 μL，震蕩10 min，分別于0 h、24 h、48 h、96 h檢測(cè)490 nm處的吸光度(OD值)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡能力及細(xì)胞周期 各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后收集2×105～5×105細(xì)胞加入Binding Buffer液500 μL懸浮細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 5 μL混勻，加Propidium Iodide 5 μL。室溫避光反應(yīng)10 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

將各組細(xì)胞于37℃環(huán)境中孵育48 h后，使用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入含量為70%預(yù)冷乙醇輕柔吹打混勻細(xì)胞后，于4℃環(huán)境中固定12 h，使用PBS洗滌細(xì)胞2次。取0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，加入10 μL 7-AAD，同時(shí)加入適量RNaseA使其終濃度均為50 mg/L，于37℃環(huán)境中溫浴30 min后，加400 μL PI避光染色30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，按2×105/孔接種于6孔板，37℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜，用200 μL高壓滅菌槍頭垂直于板孔進(jìn)行劃線，用PBS沖洗劃出的細(xì)胞后加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后對(duì)劃痕處細(xì)胞遷移情況進(jìn)行觀察、拍照；劃痕寬度用Image-proplus 6.0進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力 取Matrigel基質(zhì)膠，用不含胎牛血清的培養(yǎng)液按9∶1進(jìn)行稀釋，平鋪于Transwell小室的上室，37℃過(guò)夜凝固。取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105/mL，取200 μL加入小室的上室，將600 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)液加入下室，37℃培養(yǎng)24 h，取出小室，1%多聚甲醛混合，結(jié)晶紫溶液染色15 min，顯微鏡觀察拍照，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 Western Blot和qRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞Nrf2、NQO1、HO-1的表達(dá)水平 具體實(shí)驗(yàn)操作步驟同1.2.2。Nrf2上游5′-GGACCTAAAGCACAGCCAACACAT-3′，下游5′-TCGGCTTGAATGTTTGTCTTTTGTG-3′；NQO1上游5′-TGGAAGCTGCAGACCTGGTG-3′，下游5′-TTGTCATA CATGGTGGCATACGTG-3′；HO-1上游5′-CTTTTTTCACC TTCCCGAGCATC-3′，下游5′-GGTCTTAGCCTCTTCTGT CAGGGTGT-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞SIRT1的表達(dá)水平比較

與空白對(duì)照組和SIRT1 NC組相比，SIRT1抑制組SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)圖1。

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05；與SIRT1 NC組相比，#P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞的增殖能力比較

與空白對(duì)照組和SIRT1 NC組相比，SIRT1抑制組細(xì)胞的吸光度值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)圖2。

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05；與SIRT1 NC組相比，#P<0.05。

2.3 各組細(xì)胞的凋亡能力及細(xì)胞周期比較

細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和SIRT1 NC組相比，SIRT1抑制組細(xì)胞的凋亡能力顯著增加；細(xì)胞周期結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SIRT1抑制組G0/G1期細(xì)胞數(shù)明顯多于空白對(duì)照組和SIRT1 NC組；而SIRT1抑制組S期細(xì)胞數(shù)明顯少于空白對(duì)照組和SIRT1 NC組。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)下頁(yè)圖3、4。

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05；與SIRT1 NC組相比，#P<0.05。

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05；與SIRT1 NC組相比，#P<0.05。

2.4 各組細(xì)胞的遷移和侵襲能力比較

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SIRT1抑制組中劃痕寬度顯著寬于空白對(duì)照組和SIRT1 NC組；Transwell 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組和SIRT1 NC組相比，SIRT1抑制組中穿過(guò)小室基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)目顯著減少。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)下頁(yè)圖5、6。

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05；與SIRT1 NC組相比，#P<0.05。

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05；與SIRT1 NC組相比，#P<0.05。

2.5 各組細(xì)胞Nrf2、NQO1、HO-1的表達(dá)水平比較

SIRT1抑制組Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA表達(dá)水平[(0.48±0.11)、(0.67±0.09)、(0.53±0.07)]與空白對(duì)照組[(1.00±0.15)、(1.00±0.15)、(1.00±0.11)]和SIRT1 NC組[(1.01±0.12)、(0.95±0.14)、(1.00±0.05)]相比均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與空白對(duì)照組和SIRT1 NC組相比，SIRT1抑制組Nrf2、NQO1、HO-1的蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)下頁(yè)圖7。

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05；與SIRT1 NC組相比，#P<0.05。

3 討論

宮頸癌是一種以腫瘤細(xì)胞的持續(xù)增生和侵襲、不凋亡為特征的惡性腫瘤，目前對(duì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲及抑制凋亡的細(xì)胞機(jī)制是研究的熱點(diǎn)[7]。研究表明，腫瘤細(xì)胞高遷移性和侵襲性是導(dǎo)致復(fù)發(fā)的重要原因[8]。SIRT1能夠涉及到細(xì)胞的能量代謝、凋亡以及惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展多個(gè)方面，其中SIRT1在機(jī)體發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用[9-10]。目前研究顯示，SIRT1在腫瘤中過(guò)表達(dá)，其表達(dá)水平越高，腫瘤細(xì)胞的凋亡越少，惡性生長(zhǎng)特征越明顯，侵襲轉(zhuǎn)移增殖等現(xiàn)象增加[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-204可通過(guò)下調(diào)SIRT1抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-34a可下調(diào)SIRT1的表達(dá)從而抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，提示SIRT1具有維持前列腺癌增殖的作用[13]。

本研究采用轉(zhuǎn)染SIRT1干擾載體(si-SIRT1)特異性抑制Hela細(xì)胞中SIRT1基因的表達(dá)，Western Blot和qRT-PCR結(jié)果均顯示，SIRT1抑制組Hela細(xì)胞中SIRT1基因的蛋白和mRNA表達(dá)水平均低于空白對(duì)照組和SIRT1 NC組，提示Hela細(xì)胞中SIRT1基因的表達(dá)被成功抑制。MTT結(jié)果顯示，48 h、96 h后SIRT1抑制組細(xì)胞的吸光度值均低于空白對(duì)照組和SIRT1 NC組，提示SIRT1參與細(xì)胞的增殖過(guò)程，下調(diào)SIRT1基因的表達(dá)可有效抑制細(xì)胞的增殖活性。細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和SIRT1 NC組相比，SIRT1抑制組細(xì)胞的凋亡能力顯著增加；細(xì)胞周期結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SIRT1抑制組G0/G1期細(xì)胞數(shù)明顯多于空白對(duì)照組和SIRT1 NC組；而SIRT1抑制組S期細(xì)胞數(shù)明顯減少，提示下調(diào)SIRT1基因的表達(dá)可使細(xì)胞在G1期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SIRT1抑制組中劃痕寬度顯著寬于空白對(duì)照組和SIRT1 NC組；Transwell 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組和SIRT1 NC組相比，SIRT1抑制組中穿過(guò)小室基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)目顯著減少，提示特異性抑制細(xì)胞中SIRT1基因的表達(dá)可有效降低細(xì)胞遷移及侵襲能力。

當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激、親電子試劑等刺激后，Nrf2可迅速解離出來(lái)并活化轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與ARE結(jié)合進(jìn)而激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，以保護(hù)正常細(xì)胞免受氧化應(yīng)激。但是，高水平的Nrf2在癌癥中促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)，具有化學(xué)抗性和放射抗性[14]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明Nrf2具有致癌特性，如乳腺癌、肺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌等[15-16]。NQO1是一種黃素酶，在機(jī)體的解毒代謝中發(fā)揮著重要作用，能維持抗氧化物質(zhì)的生物活性和還原性[17]。HO-1是熱休克蛋白家族中的重要成員，具有抗增殖的作用，在許多疾病中發(fā)揮作用[18-19]。有研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)上升，提示在宮頸癌中Nrf2/ARE通路被特異性激活，為宮頸癌的早期干預(yù)提供參考依據(jù)[20]。焦淑娟等[21]研究發(fā)現(xiàn)，維吾爾族宮頸鱗癌組織中存在Nrf2通路的激活，Nrf2基因沉默可能通過(guò)調(diào)控HO-1抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，與空白對(duì)照組和SIRT1 NC組相比，SIRT1抑制組Nrf2、NQO1、HO-1的蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著降低，提示抑制細(xì)胞中SIRT1基因的表達(dá)可降低Nrf2、NQO1、HO-1的表達(dá)，從而抑制Nrf2信號(hào)通路的活化，在腫瘤的生物學(xué)行為中起到一定的作用。

綜上所述，SIRT1可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，抑制其凋亡，其可能的作用機(jī)制是SIRT1促進(jìn)Nrf2信號(hào)通路的活化，為臨床治療宮頸癌提供一個(gè)新的思路。