黃筱雨，洪莉

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中死亡率最高的類型，其發(fā)生率在我國僅次于子宮頸癌和子宮體癌。統(tǒng)計顯示卵巢癌的新發(fā)數(shù)和死亡數(shù)約占全部類型的1.6%和1.9%(2018年)，5年生存率僅為47%(2015年)。卵巢癌首選手術(shù)和輔助化療，但大多數(shù)晚期患者最終復發(fā)。卵巢癌具免疫原性，免疫系統(tǒng)在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用。免疫治療克服腫瘤異質(zhì)性，打破免疫抑制和耐受狀態(tài)，加強識別和殺傷能力。在免疫治療策略中過繼性細胞免疫治療(adoptive cell immunotherapy,ACT)被認為是最有前途的方法之一。

ACT是將自身或者同種異體免疫效應細胞體外擴增和/或激活再輸注。以是否依賴人白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)作用將ACT分為兩類：一類依賴HLA通過特異性T細胞受體(T cell receptor,TCR)識別腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigens,TAA)；另一類則不依賴HLA(詳見表1)。前者包括腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)以及T細胞受體改造的T細胞(T cell receptor engineered T cells,TCR-T)，后者則包括天然免疫系統(tǒng)中不依賴HLA的免疫效應細胞如自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)，淋巴因子激活的殺傷細胞(lymphokine activated killer,LAK)和細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells,CIK)及嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)。CAR直接以單鏈抗體(single chain antibody fragment,scFv)進行識別，因此為非HLA依賴。多年來基于TLC、NK、LAK、CIK的卵巢癌治療已有大量研究，而TCR-T和CAR以基因工程為基礎(chǔ)，研究門檻高，相關(guān)領(lǐng)域有待進一步探索。近年來CAR研究不斷推陳出新，在卵巢癌治療方面具有巨大潛力。

表1 ACT分類及特點

以下就不同類型ACT的特點及研究進展做一概述，為將來ACT治療卵巢腫瘤方面的研究及應用提供依據(jù)。

1 非人白細胞抗原依賴的過繼性細胞免疫治療

1.1 自然殺傷細胞

NK細胞是理想的ACT免疫因子，具有強抗瘤力，細胞亞群少，體內(nèi)存活短，通過應激誘導配體直接識別靶細胞。研究表明NK細胞毒性和腫瘤內(nèi)浸潤數(shù)量與患癌風險和預后顯著相關(guān)。

NK-ACT研究重在提高數(shù)量、活性和靶向性。常用提高活性方法包括細胞因子共培養(yǎng)，改變來源及通過改造增強活性等。細胞因子共培養(yǎng)簡單易行，大量研究支持，但方案需進一步探討。一種與白介素(interleukin,IL)12、15及18短暫預激活的細胞因子誘導的有記憶性的NK細胞能增強干擾素(interferon，IFN)γ釋放、提高對卵巢癌的殺傷活性并表現(xiàn)出潛在性規(guī)避腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)的能力[1]。IL-15超激動劑復合體甚至增強腹水來源NK活性?？贡砥どL因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)預處理可提高腫瘤細胞對NK細胞介導的抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)的敏感性，但同時降低分泌細胞因子能力[2]。NK細胞的來源多樣，如干細胞、外周血。改變來源可獲得更高活性NK，例如“非成體”人多能干細胞來源及在體內(nèi)和體外均有強抗瘤能力的造血干細胞及祖細胞來源的NK?；蛟S從患者來源擴增篩選更為直接，但如何適應臨床應用有待研究?；蚋脑旆矫?，三抗體形式的雙特異性抗體[人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)2x分化群(cluster of differentiation，CD)16]可增強抗腫瘤活性[3]；SESN(sestrins)2和SESN 3上調(diào)抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體(mammalian target of rapamycin complex，mTORC)1信號，促進一磷酸腺苷激活的蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK]信號傳導進而影響體內(nèi)外NK-92細胞殺瘤活性[4]。NK細胞與其他免疫細胞[如NK的樹突狀細胞(dendritic cell,DC)]的編輯功能或者與其他ACT(如CAR-NK)聯(lián)用也增強抗瘤活性。目前NK-ACT臨床應用的瓶頸在于體外擴增技術(shù)，關(guān)鍵在于其安全性、短耗時、低成本和高效率。

1.2 細胞因子誘導的殺傷細胞

CIK細胞來源外周血，受CD3抗體、IFN-γ和IL-2刺激產(chǎn)生，特征性表達CD3和CD56，與貝伐珠單抗相比，對耐藥型卵巢癌細胞毒性更強。一項細胞實驗發(fā)現(xiàn)CIK治療使上清中腫瘤標記物(tumor marker,TM)如糖類抗原(carbohydrate antigen,CA)125、人附睪蛋白(human epididymis protein,HE)4降低，可考慮作為療效監(jiān)測指標之一。基于CIK的研究集中于提高殺傷性。一體外實驗通過shRNA干擾發(fā)現(xiàn)球狀癌干細胞樣細胞也能通過低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)介導的細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1 ，ICAM-1)下調(diào)抵抗CIK介導的細胞裂解[5]，結(jié)合在貼壁細胞中得到同樣的結(jié)論，未來研究考慮通過干預此通路提高CIK抗瘤毒性。CIK聯(lián)合其他ACT提高抗瘤性。葉酸受體α(folate receptor α,FRα) -CAR改造CIK細胞或者卵巢癌患者月經(jīng)血來源的DC-CIK細胞增強細胞毒性，同時DC-CIK免疫治療促進CD4+、CD25+、Treg升高，改善T細胞功能及亞群比例失衡，且免疫因子增殖率、成熟數(shù)量、抗瘤力、安全性和可行性均有提高。臨床試驗中發(fā)現(xiàn)CIK聯(lián)合化療和/或其他免疫細胞療效較好，顯著降低血清TM，改善凝血。易獲取及低成本的來源是臨床應用、推廣的關(guān)鍵。體外實驗證明臍血來源CIK細胞具抗腫瘤活性，臨床試驗中發(fā)現(xiàn)輸注臍帶血 (umbilical cord blood,UCB) -CIK的卵巢癌患者得到部分緩解[6]。

1.3 淋巴因子激活的殺傷細胞

LAK在卵巢癌治療方面的研究近年來非常有限。大量臨床試驗報道高劑量IL-2處理的自體LAK移植臨床反應有限，而以腹膜纖維化率為代表的不良反應發(fā)生率較高[7]。

1.4 嵌合抗原受體

CAR兼具抗原特異性和細胞活化特性，其胞外結(jié)構(gòu)主要是scFv，胞內(nèi)信號域是其分類依據(jù)。第4代CAR通過編輯入細胞因子基因釋放招募第二波免疫細胞對缺少CAR靶標的細胞發(fā)起攻擊。如分泌IL -18的CAR- T不僅擴增性和持久性增強，還可調(diào)節(jié)TME[8]。CAR經(jīng)典載體為T細胞，其他載體可能不良反應更低、療效更佳，如在細胞實驗和動物實驗中發(fā)現(xiàn)CAR-NK不誘導CRS、不易脫靶、毒性低而且來源廣[9]。CAR靶點在提高療效中起重要作用，許多已進入臨床試驗階段[9-13]。尿激酶纖溶酶原激活物表面受體(urokinase plasminogen activator surface receptor,U-PAR)可在非腫瘤性間質(zhì)細胞表達使靶向間質(zhì)細胞成為可能，同時另一研究構(gòu)建基于天然配體受體結(jié)合的抗uPAR-CAR，成功降低免疫原性[14]。放化療在抑制T細胞的同時也使更多靶點暴露，如協(xié)同紫杉醇與HER2-CAR-T治療。除了表面分子標記，還可開發(fā)其他靶點。TME嚴重影響CAR療效，是實體瘤治療中難以避免的障礙，但同時提供新靶點；腫瘤外泌體具免疫抑制作用，在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程起到重要作用，也可納入治療靶點的考慮之中[15-17]。靶標的正確選擇可規(guī)避不良反應，利用雙抗原特異性/可切換雙受體或者mRNA編碼降低半衰期可降低對正常組織的毒性，設(shè)計親和調(diào)節(jié)的scFv和單次低劑量的單抗預處理也被認為是潛在策略。CAR制備低成本、高效率及安全性的實現(xiàn)關(guān)鍵在載體細胞來源和制備途徑。有研究提出有望大規(guī)模生產(chǎn)的誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)-CAR-T以及具有強抗瘤能力的NK-CAR-iPSC-NK細胞作為載體來源。制備途徑方面提出了設(shè)計簡單、使用方便、成本低廉、“非腫瘤”毒性較小的基于RNA的CAR，但大規(guī)模轉(zhuǎn)染時效率較低。CAR治療策略中聯(lián)合治療常被提及。IL-2短期共培養(yǎng)產(chǎn)生利于治療的記憶CAR-T細胞[18]；IL-7和IL-15可促進CAR-T的體外擴增； 一項體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)抑制IL-10可逆轉(zhuǎn)TME的負面影響，從而提高CAR-T的存活率及抗瘤能力[18-19]。此外，多項動物實驗發(fā)現(xiàn)局部注射比靜脈注射更具潛力且可有效改善TME。

2 人白細胞抗原依賴的過繼性細胞免疫治療

2.1 特異性T細胞受體/腫瘤浸潤淋巴細胞

TIC/TIL系由腫瘤T細胞分離擴增一反應性CD3+亞群，通過分泌IFNγ和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)α抑制體外腫瘤。TIL分離結(jié)果與患者結(jié)局間存在相關(guān)性。1項臨床試驗對轉(zhuǎn)移性卵巢癌患者進行TIL聯(lián)合IL-2治療，證明其可行性和耐受性，但TIL作用不完全，研究考慮與抑制性免疫檢查點通路即淋巴細胞激活基因3 (lymphocyte-activation gene 3 ，LAG3)/MHCII和細胞程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD1)/細胞程序性死亡配體1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)有關(guān)[20]。TIL研究存在不良反應、難以標準化分離及難以擴展跨癌癥模型以及其識別、殺傷機制尚不明確等障礙。

2.2 特異性T細胞受體

TCR由對患者T細胞受體鏈進行基因工程設(shè)計得到，同CAR-T一樣由于識別正常組織中靶點導致“在靶離瘤”毒性及低親和力導致“離靶離瘤”毒性，故實體瘤治療中獲益有限。近年來研究嘗試通過開發(fā)靶點、改善受體親和性、設(shè)計合適轉(zhuǎn)染載體及改善TME等途徑來解決。

目前TCR靶標可分為癌-睪丸抗原、致癌性病毒抗原和新抗原。新抗原系由非同義突變、標簽基因突變或基因融合產(chǎn)生，可觸發(fā)CD8+T細胞反應，目前已開發(fā)可增強并快速識別新抗原的TCRs及高效生產(chǎn)的方法，其有效性也已驗證。同時新抗原TCRs的優(yōu)化和誘導簡化研究都強調(diào)新表位選擇對避免交叉反應的重要性?？朔砻婵乖陌邢蚓窒扌赃€可考慮正常組織中缺乏表達的胞內(nèi)靶標。增強TCRs親和力可增強T細胞特異性和功能性，但高親和性受體數(shù)量少、難識別，可嘗試改造互補決定區(qū)改變親和力和親和度[21]。然而TCRs具超過敏性親和力閾值，而且高親和力易導致不良反應，存在自反應性。通過腫瘤內(nèi)注射提高T細胞局部濃度、加入抑制性分子區(qū)分出腫瘤細胞及T細胞誘導自殺開關(guān)可能解決以上問題[22]。此外，一種天然高親和力HLA-A*02:01 (a*02)-限制性TCR可有效靶向紐約食管鱗狀細胞癌1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1,NY-ESO-1)細胞系且無交叉反應發(fā)生，同時另一研究發(fā)現(xiàn)HLA-A*02:01-TCR轉(zhuǎn)導的CATs具相似特性[23]。構(gòu)建TCR時內(nèi)源性α和β亞基錯配不僅降低其靶向性，還產(chǎn)生新抗原特異性反應。適當?shù)妮d體設(shè)計可減少誤配，如利用基因編輯技術(shù)消除競爭性內(nèi)源TCR和干擾PD-1基因[24]。TME阻礙T細胞浸潤，可通過TCR-T表達針對腫瘤的細胞因子并結(jié)合逆轉(zhuǎn)抑制信號的信號開關(guān)來解決，或者通過人工T細胞活化適配分子調(diào)節(jié)TCR-T信號通路，提高其在TEM中的持久性[22,25]。

3 過繼性細胞免疫治療研究熱點

目前提高ACT安全性和有效性的可行策略包括靶點開發(fā)、效應細胞基因改造及改善臨床治療策略。靶點是提高ACT靶向性關(guān)鍵，準確靶向?qū)Ρ苊?“在靶離瘤”、“離靶離瘤”毒性及提高療效具重要意義。而以基因改造為基礎(chǔ)的CAR和TCR-T愈受青睞，主要由于基因修飾的角度和方法選擇范圍廣[24,26]；也可以基因修飾的造血干細胞作為來源或者編輯入自殺基因開關(guān)提高安全性[27-28]；基因修飾效應細胞還可拓展到NK細胞、iNKT細胞、GD型T細胞、iPS細胞等。其中CAR-NK細胞亞群少、生存期短故體外風險低，但有效性及毒副作用有待驗證[27]。TME降低ACT效應物激活能力和生存時間，是ACT臨床應用中不可避免的障礙。對卵巢癌TME的研究不僅能提供更多靶點，還幫助探尋更優(yōu)治療策略及開發(fā)早期卵巢癌檢測標志物。ACT的聯(lián)合治療提高療效，避免不良反應，改善預后，應用潛力巨大，但臨床試驗有限，缺乏有力結(jié)論。

未來ACT研究不僅應關(guān)注基礎(chǔ)研究，更應關(guān)注臨床試驗及推廣應用中的具體問題：如何避免TME干擾，如何保證免疫效益因子大規(guī)模生產(chǎn)的高效性及安全性，如何實現(xiàn)效應因子的制備既滿足個性化同時降低成本等。