楊依然，姚 華，閆江紅，孫志恒，張 余，房雪晴，李緒文，金永日

（1.吉林大學化學學院,長春 130012；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院，長春 130033；3.吉林省中醫(yī)藥科學院第一臨床醫(yī)院,長春 130021;4.新南威爾士大學材料科學學院，悉尼2033，澳大利亞）

薤（Allium chinenseG.Don），別名藠頭，是百合科蔥屬植物，廣泛種植于我國安徽、廣東、福建等地.薤因其獨特的風味，常被腌漬制成副食食用，具有健脾胃和助消化等保健功效［1，2］.薤的干燥鱗莖是中藥薤白的來源之一，具有通陽散結及行氣導滯等功效，常用于治療胸痹心痛、皖腹痞滿脹痛、瀉痢后重等疾?。?］.薤中主要含有甾體皂苷類化合物［4～13］、含氮化合物［14］、含硫化合物［15～17］、脂肪酸類化合物［18］和多糖類化合物［19］，其中甾體皂苷類化合物是薤的主要化學成分.甾體皂苷類化合物由甾體皂苷元和糖基組成，皂苷元主要分為螺甾烷醇類、異螺甾烷醇類、呋甾烷醇類和變形呋甾烷醇類4種類型，糖基中主要含有葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖等［20，21］.目前，國內外學者對薤白（中藥材）和小根蒜（中藥材薤白的另一來源）化學成分的研究較多，共分離并鑒定了約70余種甾體皂苷，其中甾體皂苷元主要包括tigogenin，laxogenin，smilagenin，sarsapogenin和gitogenin 5種類型［22］.但對薤化學成分的報道較少，僅分離出chinenoside Ⅰ和chinenoside Ⅲ～Ⅶ等十幾種甾體皂苷.

文獻報道關于薤白中甾體皂苷類化合物的生物活性研究主要集中在抗氧化和細胞毒性2 個方面［23～28］，如薤白葉片總皂苷的抗亞油酸脂質體氧化能力要強于鱗莖；薤白原汁對由白酒造成的氧應激態(tài)大鼠的T淋巴細胞具有明顯保護作用，且具有顯著抑制血清過氧化脂質形成作用；薤白中分離得到的甾體皂苷類化合物可有效抑制SF-268和NCI-H460腫瘤細胞的生長；薤白總皂苷對人宮頸癌HeLa細胞具有顯著的抑制增殖作用，并能誘導其凋亡.上述研究結果表明，薤白中某些甾體皂苷類化合物具有抗氧化功效，能夠清除體內自由基，提高機體免疫能力，并且能夠干預腫瘤的生長.

本文對薤的化學成分進行了深入研究，從中分離鑒定了6種新的呋甾型化合物（化學結構見圖1），其中化合物1和2的皂苷元結構為首次從天然產(chǎn)物中分離得到的新骨架.此外，選用H2O2誘導PC12細胞神經(jīng)氧化損傷模型，初步考察了6種新的呋甾型化合物的抗氧化活性，為薤的開發(fā)利用提供了新的科學依據(jù).

Fig.1 Chemical structures of compounds 1—6

1 實驗部分

1.1 材料、試劑和儀器

新鮮薤購于江西，經(jīng)吉林大學藥學院張靜敏教授鑒定為薤（Allium chinenseG.Don）的根莖.

乙腈（色譜純，Sigma-Aldrich公司）；柱層析硅膠（青島海洋化工廠，200～300 目）；ODS色譜柱（北京未來科技發(fā)展有限公司，75～100 μm）；Silica 60 F254 高效薄層層析板和ODS RP-18 F254高效薄層層析板（美國Merk公司）；D-101大孔吸附樹脂（南開大學化工廠）；其它試劑均為北京化工廠產(chǎn)品.

E試劑的配制：取2 g對二甲氨基苯甲醛溶解在200 mL乙醇中，加入50 mL鹽酸混合均勻即得.過氧化氫（H2O2，開原化學試劑一廠）；CCK-8細胞活性檢測試劑盒（美國Bimake生物科技有限公司）；二甲基亞砜（北京索萊寶科技有限公司）；α-MEM 培養(yǎng)基（Hyclone）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液（100×，SV30010，Hyclone）和DMEM 培養(yǎng)基（Gibco）（美國賽默飛科技有限公司）；胎牛血清（FBS，天津康源生物技術有限公司）；胰酶細胞消化液（0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA，Biosharp生物科技有限公司）；實驗用水由Unique-R20型超純水制備系統(tǒng)（廈門銳思捷科學儀器有限公司）制備（電阻率18.20 MΩ·cm）.

Aglient 1200型高效液相色譜儀（HPLC），配備Alltech-6000型蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）；RID-20A半制備型液相色譜儀（日本Shimadzu 公司），XAmide 分析型色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），XAmide制備型高效色譜柱（10 mm×250 mm，10 μm）；Bruker AV600 型核磁共振波譜儀和Agilent 1290-micrOTOF Q Ⅱ高分辨液相色譜-質譜聯(lián)用儀；New Brunswick Galaxy 170R細胞培養(yǎng)箱（德國Eppendorf股份公司）；Olympus CKX31-C11BF倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司）；Tecan Infinite 200 Pro酶標儀（瑞士帝肯有限公司）；Corning 25/75 cm2一次性培養(yǎng)瓶和Corning 3599 型96 孔培養(yǎng)板（美國康寧公司）.

1.2 實驗過程

1.2.1 提取分離 將30 kg 新鮮的薤攪碎成勻漿，用體積分數(shù)為98%的乙醇浸提4 次，液料比分別為10∶1，8∶1，8∶1和6∶1，每次浸提時間均為4 h，合并4次提取液，過濾并減壓濃縮；然后用5倍體積的水稀釋，再利用D-101大孔樹脂柱吸附，用體積分數(shù)為40%的乙醇洗脫并收集洗脫液；減壓濃縮后經(jīng)TLC檢測，得到125 g呋甾型總皂苷.將呋甾總皂苷采用硅膠柱色譜分離，用乙酸乙酯-乙醇-水（體積比5∶0.9∶0.1～6∶1.5∶0.2）梯度洗脫，分別收集洗脫液，經(jīng)過TLC 檢測合并相同組分，回收溶劑后得到2個部分（Fr.1 和Fr.2）.Fr.1 部分采用硅膠柱色譜分離，用二氯甲烷-甲醇-水（體積比8∶2∶0.2～8.5∶3∶0.3）梯度洗脫，分別收集洗脫液，經(jīng)過TLC 檢測合并相同組分；然后分別以丙酮-水（體積比1∶1.2～1∶4.5）為洗脫劑進行十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS）柱色譜分離，洗脫液經(jīng)TLC 檢測后合并相同組分；回收溶劑后利用制備型高效液相色譜以乙腈-水（體積比87∶13）為流動相進行分離純化，分別得到化合物1（20.6 mg）、化合物2（28.7 mg）、化合物3（31.9 mg）、化合物4（19.4 mg）和化合物5（13 mg）.Fr.2（2.1 g）部分分別用ODS柱色譜分離（流動相∶丙酮-水，體積比1∶2.5）及制備高效液相色譜（流動相∶乙腈-水，體積比92∶8）分離純化，最終得到化合物6（20.6 mg）.

1.2.2 酸水解實驗 稱取化合物1～6 粉末各5 mg，分別加入5 mL 濃度為2 mol/L 的HCl 溶液，在90 ℃下加熱回流2 h，然后用2 mol/L的NaOH 溶液中和至pH=7，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層，經(jīng)減壓濃縮得到皂苷元部分；水層經(jīng)濃縮后，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD）進行測定，使用XAmide色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，100 A），以乙腈-水（體積比90∶10）等度洗脫，檢測糖的種類.

1.2.3 細胞培養(yǎng) PC12細胞系為大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤的細胞系，是常用的神經(jīng)細胞株，購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）.采用含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的α-MEM培養(yǎng)基，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)PC12細胞.培養(yǎng)2～3天進行細胞傳代，選擇對數(shù)生長期細胞進行實驗.另外，采用DMEM 高糖培養(yǎng)基［含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液］，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).實驗時同樣使用對數(shù)生長期的細胞.

1.2.4 H2O2誘導氧化損傷及藥物保護作用 將對數(shù)期生長的PC12細胞用0.25%胰酶-EDTA溶液消化制成細胞懸液，終濃度為5×104Cell/mL.將100 μL細胞懸液接種在96孔板中，于37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h.在藥物處理前，用無血清α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h，使細胞同步化.隨后，分別加入6種化合物的樣品溶液，使其最終濃度為80 μg/mL.每個實驗組設置3個復孔，以PBS緩沖液作為陰性對照組，于37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h.向實驗組及陰性對照組加入含500 μmol/L H2O2的α-MEM培養(yǎng)基，制造氧化損傷模型，空白組不做損傷處理.在培養(yǎng)箱中孵育2 h后進行CCK-8細胞活性檢測.檢測時棄去原培養(yǎng)基，用PBS 緩沖液清洗1 次，再向每孔中加入含有10%CCK-8 檢測試劑的100 μL培養(yǎng)基，在細胞培養(yǎng)箱中反應約1.5 h.最后，用酶標儀檢測各孔在450 nm 處的光密度值（OD450nm），計算細胞存活率.對具有PC12細胞保護作用的化合物進行進一步實驗，配制終濃度分別為40，80和120 μg/mL的樣品溶液，重復上述實驗，驗證化合物對H2O2誘導的PC12細胞氧化損傷保護作用的劑量依賴性.

2 結果與討論

2.1 結構分析

化合物1為白色粉末（乙腈-水），m.p.242～244 ℃，E試劑反應顯粉紅色，提示該化合物可能為呋甾皂苷類化合物.高分辨液相色譜-質譜（HR-ESI-MS）分析得到m/z995.4689［M+H］+，提示化合物1的分子量為994.4609，推測其分子式為C46H74O23.

化合物1的13C NMR（C5D5N，150 MHz）譜共給出46個碳信號，其中包括22個皂苷元碳信號和24個糖基碳信號.結合無畸變極化轉移增強（DEPT）譜可知，低場區(qū)δC181.26 為羰基碳信號，δC105.21，105.04，104.68和102.50推測為糖的端基碳信號，δC70.95～88.65共給出18個連氧叔碳信號，推測為糖基C-2～C-5或甾體皂苷苷元上的連氧碳信號，δC18.01，13.91和12.34為3個甲基碳信號.化合物1的1H NMR（C5D5N，600 MHz）譜中，高場區(qū)出現(xiàn)了3 組甲基質子信號，分別為δH0.57（3H，s），δH0.48（3H，s），δH1.12（3H，d，J=7.2 Hz），根據(jù)異核單量子相關譜（HSQC）以及異核多鍵相關譜（HMBC），可將這3 組甲基碳信號分別歸屬為C-18（δC13.91），C-19（δC12.34）和C-21（δC18.01）.由于C18質子信號（δH0.57，3H）處于低場而C19質子信號（δH0.48，3H）處于高場，可確認甾體皂苷元5位氫為α構型［20］.

由HMBC 譜可知，δH1.12（3H，d，J=7.8 Hz，H-21）分別與δC59.11，δC36.40，δC181.26 存在C-H遠程相關，可將這3 組碳信號分別歸屬為C-17，C-20 和C-22.δH0.57（3H，s，H-18）分別與δC38.29，δC41.87，δC54.53，δC59.11 存在C-H 遠程相關，可將這4 組碳信號分別歸屬于C-12，C-13，C-14 和C-17.δH0.48（3H，s，H-19）分別與δC37.27，δC44.69，δC54.50和δC35.87存在C-H遠程相關，可將該4組信號分別歸屬為C-1，C-5，C-9和C-10.在同核化學位移相關譜（1H-1H COSY）中，δH4.77（H-16）與δH1.28，1.98（H-15）存在1H-1H 相關，再結合HSQC 譜，可歸屬δC82.82 為C-16 信號，歸屬δC33.3 為C-15 信號.δH0.64，1.32（H-1）與δH1.48，1.91（H-2）存在1H-1H 相關，故將δC29.96 歸屬為C-2，同時δH1.48，1.91（H-2）又與δH3.77（H-3）存在1H-1H相關，故將δc 77.34（連氧叔碳）歸屬為C-3信號，并推測其與糖基相連形成糖苷鍵.將化合物1的13C NMR 數(shù)據(jù)與文獻［29］中3-羥基-5α-cholano-22，16-內酯對照，發(fā)現(xiàn)皂苷元的數(shù)據(jù)基本一致，只是A環(huán)C-2，C-3和C-4化學位移發(fā)生了變化，由于C-3連糖，導致C-3向低場移動δ6.24，進而導致其周圍的C-2和C-4分別向高場移動了δ1.44和δ3.25.

在1H NMR（C5D5N，600 MHz）譜中低場區(qū)出現(xiàn)4 個糖的端基質子信號，分別為δH4.76（1H，d，J=7.8 Hz），δH5.03（1H，d，J=7.8 Hz），δH5.19（1H，d，J=7.8 Hz），δH5.47（1H，d，J=7.8 Hz），提示化合物中存在4分子糖，由J=7.8 Hz可知4分子糖的端基質子均為β構型.酸水解結果表明，分子中存在半乳糖和葡萄糖.由HMBC 譜可知，半乳糖的端基質子信號（δH4.76，1H，d，J=7.8 Hz）與母核C-3（δC77.34）存在遠程相關，因此推測該糖連接在皂苷元母核C-3 位，內側葡萄糖的端基質子信號（δH5.03，1H，d，J=7.8 Hz）與半乳糖的C-4′（δc 80.36）存在遠程相關，推測其連接方式為1→4.外側葡萄糖端基質子信號（δH5.19，1H，d，J=7.8 Hz 和δH5.47，1H，d，J=7.8 Hz）分別與內側葡萄糖的C-3″（δC88.65）和C-2″（δC81.59）存在遠程相關，推測兩分子葡萄糖與內側葡萄糖的連接方式分別為1→3和1→2.此外，化合物1的糖基碳的化學位移值與文獻［30］報道基本一致.

綜上所述，鑒定化合物1（分子式C46H74O23）結構為5α-cholano-22，16-內酯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-（1→2）-［β-D-吡喃葡萄糖基-（1→3）］-β-D-吡喃葡萄糖基（1→4）-β-D-吡喃半乳糖苷.經(jīng)文獻檢索，確認其為新化合物.化合物1的HMBC與COSY相關圖譜見本文支持信息中圖S1，13C NMR數(shù)據(jù)見表1.

化合物2為白色粉末（乙腈-水），m.p.208～210 ℃，E試劑反應顯粉紅色，提示該化合物可能為呋甾皂苷類化合物.HR-ESI-MS 分析得到m/z787.3693［M+H］+，提示化合物2 的分子量為786.3385，推測其分子式為C38H58O17.

化合物2的13C NMR（C5D5N，150 MHz）譜共給出38個碳信號，其中包括22個皂苷元碳信號和16個糖基碳信號.結合DEPT 譜可知，低場區(qū)δC181.26 和δC209.29 為羰基碳信號，δC105.84，105.24 和102.11推測為糖的端基碳信號，δC69.96～82.5共給出12個連氧叔碳信號，推測為糖基C-2～C-5或甾體皂苷苷元上的連氧碳信號，δC13.81，13.12 和17.97 為3 個甲基碳信號.化合物2 的1H NMR（C5D5N，600 MHz）譜中，高場區(qū)出現(xiàn)了3 組甲基質子信號，分別為δH0.56（3H，s），δH0.49（3H，s）和δH1.13（3H，d，J=7.8 Hz），根據(jù)HSQC 以及HMBC 譜，可將這3 組甲基碳信號分別歸屬為C-18（δC13.81），C-19（δC13.12）和C-21（δC17.97）.由于C18質子信號（δH0.56，3H）處于低場而C19質子信號（δH0.49，3H）處于高場，可確認甾體皂苷元5位氫為α構型.

由HMBC譜可知，δH1.13（3H，d，J=7.8 Hz，H-21）分別與δC58.89，δC36.38和δC181.07存在C-H遠程相關，可將這3 組碳信號分別歸屬為C-17，C-20 和C-22.δH0.56（3H，s，H-18）分別與δC37.83，δC42.22，δC54.61 和δC58.89 存在C-H 遠程相關，可將這4 組碳信號分別歸屬于C-12，C-13，C-14 和C-17.δH0.49（3H，s，H-19）分別與δC36.77，δC56.5，δC53.78和δC40.87存在C-H遠程相關，可將這4組碳信號分別歸屬為C-1，C-5，C-9和C-10.δH2.02（1H，s，H-5）分別與δC209.29和δC26.97存在C-H遠程相關，可將其信號分別歸屬為C-6 和C-4.在1H-1H COSY 譜中，δH4.76（H-16）與δH1.26，1.90（H-15）存在1H-1H 相關，再結合HSQC 譜，可歸屬δC82.5（連氧叔碳）為C-16信號，歸屬δC33.0為C-15

信號.δH0.96，1.40（H-1）與δH1.48，1.95（H-2）存在1H-1H 相關，故將δC29.49 歸屬為C-2，同時δH1.48，1.95（H-2）又與δH3.82（H-3）存在1H-1H相關，故將δC76.94（連氧叔碳）歸屬為C-3信號，并推測其與糖基相連形成糖苷鍵.發(fā)現(xiàn)化合物2的皂苷元部分與化合物1的皂苷元數(shù)據(jù)基本一致，只是在C-4，C-5，C-6，C-7 和C-8 化學位移發(fā)生了變化.由于C-6（δC209.29）為羰基，形成了共軛體系，導致C-5，C-7和C-8分別向高場移動了δ11.81，14.27和2.07，C-4向低場移動了δ7.88.

Table 1 Chemical shifts of 13C NMR(600 MHz)for compounds 1—6(δ,C5D5N)

在1H NMR（C5D5N，600 MHz）譜中低場區(qū)出現(xiàn)3 個糖的端基質子信號，分別為δH4.81（1H，d，J=7.8 Hz），δH4.94（1H，d，J=7.2 Hz）和δH5.37（1H，d，J=7.8 Hz），提示化合物中存在3分子糖，由J均在7.2 Hz以上，可知4分子糖的端基質子均為β構型.酸水解結果表明分子中存在葡萄糖、木糖和阿拉伯糖.由HMBC譜可知，葡萄糖的端基質子信號（δH4.81，1H，d，J=7.8 Hz）與母核C-3（δC76.94）存在遠程相關，因此推測該糖連接在皂苷元母核C-3 位，木糖的端基質子信號（δH5.37，1H，d，J=7.8 Hz）和阿拉伯糖的端基質子信號（δH5.37，1H，d，J=7.8 Hz）分別與葡萄糖的C-4′（δC79.9）和C-6′（δC68.23）存在遠程相關，推測木糖和阿拉伯糖與葡萄糖的連接方式分別為1→4和1→6.此外，化合物2的糖基碳化學位移值與文獻［11］報道基本一致.

綜上所述，鑒定化合物2（分子式C38H58O17）結構為6-酮-5α-cholano-22，16-內酯-3-O-β-D-吡喃木糖基-（1→4）-［α-L-吡喃阿拉伯糖基-（1→6）］-β-D-吡喃葡萄糖苷.經(jīng)文獻檢索確認其為新化合物.化合物2的HMBC與COSY相關圖譜見本文支持信息中圖S2，13CNMR數(shù)據(jù)見表1.

化合物3為白色粉末（乙腈-水），m.p.265～267 ℃，E試劑反應顯粉紅色，提示該化合物可能為呋甾皂苷類化合物.HR-ESI-MS 分析得到m/z1247.6076［M+NH4］+，提示化合物3 的分子量為1229.3547，推測其分子式為C57H96O28.

化合物3的13C NMR（C5D5N，150 MHz）譜共給出57個碳信號，其中包括27個皂苷元碳信號和30個糖基碳信號.結合DEPT譜可知，低場區(qū)δC102.52，104.68，105.03，105.14和105.21推測為糖的端基碳信號，δC70.94～88.65 共給出23 個連氧叔碳信號，推測為糖基C-2～C-5 或甾體皂苷苷元上的連氧碳信號，δC13.78，12.42，13.66和17.45為4個甲基碳信號.化合物3的1H NMR（C5D5N，600 MHz）譜中，高場區(qū)出現(xiàn)了4 組甲基質子信號，分別為δH0.99（3H，s），δH0.54（3H，s），δH1.12（3H，d，J=7.2 Hz）和δH0.93（3H，d，J=6.6 Hz），根據(jù)HSQC 以及HMBC 譜，可將這4 組甲基碳信號分別歸屬為C-18（δC13.78），C-19（δC12.42），C-21（δC13.66）和C-27（δC17.45）.由于C18質子信號（δH0.99，3H）處于低場，而C19質子信號（δH0.54，3H）處于高場，可確認甾體皂苷元5位氫為α構型.

結合HMBC 譜可知，δH0.93（3H，d，J=6.6 Hz，H-27）分別與δC31.14，δC34.20 和δC75.83 存在C-H遠程相關，可將這3組碳信號分別歸屬為C-24，C-25和C-26.δH1.12（3H，d，J=7.2 Hz，H-21）分別與δC59.89，δC37.53和δC73.32存在C-H遠程相關，可將這3組碳信號分別歸屬為C-17，C-20和C-22.δH0.99（3H，s，H-18）分別與δC40.76，δcC43.36，δC54.59和δC59.89存在C-H遠程相關，可將這4組碳信號分別歸屬為C-12，C-13，C-14和C-17.δH0.54（3H，s，H-19）分別與δC37.32，δC44.82，δC54.72和δC35.86存在C-H遠程相關，可將這4組碳信號分別歸屬為C-1，C-5，C-9和C-10.在1H-1H COSY譜中，δH4.45（H-16）與δH1.36，2.16（H-15）存在1H-1H相關，再結合HSQC譜，可歸屬δC71.43（連氧叔碳）為C-16信號，歸屬δC37.83為C-15信號.δH0.69，1.43（H-1）與δH1.50，1.92（H-2）存在1H-1H相關，故將δC30.03 歸屬為C-2，同時δH1.50，1.92（H-2）又與δH3.79（H-3）存在1H-1H 相關，故將δC77.46（連氧叔碳）歸屬為C-3 信號，并推測其與糖基相連形成糖苷鍵.δH1.95（H-25）與δH3.51，3.99（H-26）存在1H-1H相關，再結合HSQC譜，可歸屬δC75.83（連氧仲碳）為C-26信號，并推測其與糖基相連形成糖苷鍵.由C-26位質子信號（δHa3.99，δHb3.51）的差值Δab=δHa-δHb≤0.48，提示25位的構型為R型［31］.將化合物3的13C NMR數(shù)據(jù)與文獻［24］中（25R）-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-甲氧基-5β-呋甾-3β，26-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-（1→2）-D-吡喃半乳糖苷數(shù)據(jù)對比，發(fā)現(xiàn)兩者皂苷元的數(shù)據(jù)基本一致.只是化合物3中皂苷元E環(huán)的C-22失去羥基，導致C-22向高場移動δ37.28，從而使C-16，C-23，C-20和C-17的化學位移值向高場移動.

在1H NMR（C5D5N，600 MHz）譜中低場區(qū)出現(xiàn)5 個糖的端基質子信號，分別為δH4.77（1H，d，J=7.8 Hz），δH5.03（1H，d，J=7.8 Hz），δH5.18（1H，d，J=7.8 Hz），δH5.46（1H，d，J=7.8 Hz），δH4.72（1H，d，J=7.8 Hz），提示化合物中存在5分子糖，由J=7.8 Hz可知5分子糖的端基質子均為β構型.酸水解實驗結果表明分子中存在半乳糖和葡萄糖.由HMBC 譜可知，半乳糖的端基質子信號（δH4.77，1H，d，J=7.8 Hz）與母核C-3（δC77.46）存在遠程相關，因此推測該糖連接在皂苷元母核C-3位，內側葡萄糖的端基質子信號（δH5.03，1H，d，J=7.8 Hz）與半乳糖的C-4′（δc 80.37）存在遠程相關，推測其連接方式為1→4.外側葡萄糖端基質子信號（δH5.18，1H，d，J=7.8 Hz和δH5.46，1H，d，J=7.8 Hz）分別與內側葡萄糖的C-3″（δC88.65）和C-2″（δC81.59）存在遠程相關，推測兩分子葡萄糖與內側葡萄糖的連接方式分別為1→3和1→2.葡萄糖的端基質子信號（δH4.72，1H，d，J=7.8 Hz）與母核C-26（δC75.83）存在遠程相關，因此推測該糖連接在皂苷元母核C-26 位.此外化合物3 的糖基碳化學位移值與文獻［30］報道基本一致.

綜上所述，鑒定化合物3（分子式C57H96O28）結構為（25R）-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-5α-呋喃甾烷-3β，26-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-（1→2）-［β-D-吡喃葡萄糖基-（1→3）］-β-D-吡喃葡萄糖基（1→4）-β-D-吡喃半乳糖苷.經(jīng)文獻檢索，確認其為新化合物.化合物3的HMBC與COSY相關譜圖見本文支持信息中圖S3，13C NMR數(shù)據(jù)見表1.

化合物4為白色粉末（乙腈-水），m.p.216～218 ℃，E試劑反應顯粉紅色，提示該化合物可能為呋甾皂苷類化合物.HR-ESI-MS 分析得到m/z887.9102［M+H-H2O］+，提示化合物4 的分子量為905.0311，推測其分子式為C44H72O19.

化合物4的13C NMR（C5D5N，150 MHz）譜共給出44個碳信號，其中包括27個皂苷元碳信號和17個糖基碳信號.結合DEPT譜可知，低場區(qū)δc 209.58為羰基碳信號，δC102.13，105.7和105.08推測為糖的端基碳信號，δC70.95～81.08 共給出13 個連氧叔碳信號，推測為糖基C-2～C-5 或甾體皂苷苷元上的連氧碳信號，δC16.68，13.16，16.53 和17.55 為4 個甲基碳信號.化合物4 的1H NMR（C5D5N，600 MHz）譜中，高場區(qū)出現(xiàn)了4組甲基質子信號，分別為δH0.71（3H，s），δH0.51（3H，s），δH1.21（3H，d，J=6.6 Hz）和δH0.86（3H，d，J=6.6 Hz），根據(jù)HSQC以及HMBC譜，可將這4組甲基碳信號分別歸屬為C-18（δC16.68），C-19（δC13.16），C-21（δC16.53）和C-27（δC17.55）.由于C18質子信號（δH0.71，3H）處于低場而C19質子信號（δH0.51，3H）處于高場，可確認甾體皂苷元5位氫為α構型.

結合HMBC 譜可知，δH0.86（3H，d，J=6.6 Hz，H-27）分別與δC28.5，δC34.27 和δC75.39 存在C-H遠程相關，可將這3組碳信號分別歸屬為C-24，C-25和C-26.δH1.21（3H，d，J=6.6 Hz，H-21）分別與δC63.92，δC40.71 和δC110.74 存在C-H 遠程相關，可將這3 組碳信號分別歸屬為C-17，C-20 和C-22.δH0.71（3H，s，H-18）分別與δC39.79，δC41.51，δC56.53和δC63.92存在C-H遠程相關，可將這4 組碳信號分別歸屬為C-12，C-13，C-14 和C-17.δH0.51（3H，s，H-19）分別與δC37.3，δC56.53，δC53.84和δC40.95存在C-H遠程相關，可將其信號分別歸屬為C-1，C-5，C-9和C-10.δH1.97（1H，s，H-5）分別與δC209.58 和δC27.14 存在C-H 遠程相關，可將這2 組碳信號分別歸屬為C-6 和C-4.在1H-1H COSY 譜中，δH4.79（H-16）與δH1.78 和1.24（H-15）存在1H-1H 相關，再結合HSQC 譜，可歸屬δc 80.92（連氧叔碳）為C-16信號，歸屬δC32.17為C-15信號.δH0.91，1.42（H-1）與δH1.47，1.2（H-2）存在1H-1H相關，故將δC29.55歸屬為C-2，同時δH1.47，1.2（H-2）又與δH3.8（H-3）存在1H-1H相關，故將δC77.06（連氧叔碳）其歸屬為C-3信號，并推測其與糖基相連形成糖苷鍵.δH1.79（H-25）與δH3.49，3.82（H-26）存在1H-1H相關，再結合HSQC譜，可歸屬δC75.39（連氧仲碳）為C-26信號，并推測其與糖基相連形成糖苷鍵.由C-26位質子信號（δHa3.82，δHb3.49）的差值Δab=δHa-δHb≤0.48，提示25位的構型為R型.化合物4的皂苷元的13C NMR數(shù)據(jù)與文獻［32］報道的化合物（25R）-6-酮-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-5α-呋喃甾烷-3β，22α，26-三醇-β-D-吡喃葡萄糖苷對比，發(fā)現(xiàn)兩者皂苷元數(shù)據(jù)基本一致.

在1H NMR（C5D5N，600 MHz）譜中低場區(qū)出現(xiàn)3 個糖的端基質子信號，分別為δH4.88（1H，d，J=7.8 Hz），δH5.02（1H，d，J=7.8 Hz）和δH4.69（1H，d，J=7.8 Hz），提示化合物中存在3 分子糖，由J=7.8 Hz 可知5 分子糖的端基質子均為β構型.酸水解實驗結果表明，分子中存在葡萄糖和木糖.由HMBC 譜可知，葡萄糖的端基質子信號（δH4.81，1H，d，J=7.8 Hz）與母核C-3（δC77.06）存在遠程相關，因此推測該糖連接在皂苷元母核C-3位，木糖的端基質子信號（δH5.02，1H，d，J=7.8Hz）與葡萄糖的C-4′（δC81.08）存在遠程相關，推測木糖與葡萄糖的連接方式分別為1→4.葡萄糖的端基質子信號（δH4.69，1H，d，J=7.8 Hz）與母核C-26（δC75.39）存在遠程相關，因此推測該糖連接在皂苷元母核C-26位.此外，化合物4的糖基碳化學位移值與文獻［32］報道基本一致.

綜上所述，鑒定化合物4（分子式C44H72O19）結構為（25R）-6-酮-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-5α-呋喃甾烷-3β，22α，26-三醇-3-O-α-L-吡喃木糖基-（1→4）-β-D-吡喃葡萄糖苷.經(jīng)文獻檢索可知其為新化合物.化合物4的HMBC與COSY相關譜圖見本文支持信息中圖S4，13C NMR數(shù)據(jù)見表1.

化合物5為白色粉末（乙腈-水），m.p.189～190 ℃，E試劑反應顯粉紅色，提示該化合物可能為呋甾皂苷類化合物.HR-ESI-MS 分析得出m/z855.8714［M+H-2H2O］+，提示化合物5 的分子量為890.8940，推測其分子式為C43H70O19.

化合物5的13C NMR（C5D5N，150 MHz）譜共給出43個碳信號，其中包括27個皂苷元碳信號和16個糖基碳信號.結合DEPT譜可知，低場區(qū)δC209.63為羰基碳信號，δC102.17，105.78和105.25推測為糖的端基碳信號，δC69.96～81.31 共給出13 個連氧叔碳信號，推測為糖基C-2～C-5 或甾體皂苷苷元上的連氧碳信號，δC16.53，13.16，15.05 和13.74 為4 個甲基碳信號.化合物5 的1H NMR（C5D5N，600 MHz）譜中，高場區(qū)出現(xiàn)了4 組甲基質子信號，分別為δH0.65（3H，s），δH0.5（3H，s），δH1.05（3H，d，J=6.6 Hz）和δH0.97（3H，d，J=6.6 Hz），根據(jù)HSQC以及HMBC譜，可將這4組甲基碳信號分別歸屬為C-18（δC16.53），C-19（δC13.16），C-21（δC15.05）和C-27（δC13.74）.由于C18質子信號（δH0.65，3H）處于低場而C19質子信號（δH0.50，3H）處于高場，可確認甾體皂苷元5位氫為α構型.

結合HMBC 譜可知，δH0.97（3H，d，J=6.6 Hz，H-27）分別與δC70.63，δC40.08 和δC65.45 存在C-H遠程相關，可將這3組碳信號分別歸屬為C-24，C-25和C-26.δH1.05（3H，d，J=6.6 Hz，H-21）分別與δC62.54，δC40.32 和δC111.95 存在C-H 遠程相關，可將這3 組碳信號分別歸屬為C-17，C-20 和C-22.δH0.65（3H，s，H-18）分別與δC39.58，δC41.17，δC56.57和δC62.54存在C-H遠程相關，可將這4 組碳信號分別歸屬為C-12，C-13，C-14 和C-17.δH0.5（3H，s，H-19）分別與δC36.79，δC56.53，δC53.77 和δC40.95 存在C-H 遠程相關，可將這4 組碳信號分別歸屬為C-1，C-5，C-9 和C-10.δH2.02（1H，s，H-5）分別與δC209.63 和δC27.04 存在C-H 遠程相關，可將這2 組碳信號分別歸屬為C-6 和C-4.在1H-1H COSY譜中，δH4.42（H-16）與δH1.8，1.25（H-15）存在1H-1H相關，再結合HSQC譜，可歸屬δC81.31（連氧叔碳）為C-16 信號，歸屬δC31.9 為C-15 信號.δH0.97，1.44（H-1）與δH1.48，1.96（H-2）存在1H-1H相關，故將δC29.54歸屬為C-2，同時δH1.48，1.96（H-2）又與δH3.84（H-3）存在1H-1H相關，故將δC77.08（連氧叔碳）歸屬為C-3信號，并推測其與糖基相連形成糖苷鍵.δH1.71（H-25）分別與δH3.47，3.58（H-26）存在1H-1H相關，再結合HSQC譜，可歸屬δC65.45（連氧仲碳）為C-26信號，并推測其與糖基相連形成糖苷鍵.由C-26位質子信號的（δHa3.47，δHb3.58）差值Δab=δHa-δHb≤0.48，提示25位的構型為R型.將化合物5的皂苷元與化合物4的皂苷元13C NMR數(shù)據(jù)對比，化合物5的C-24位向低場移動了δ42.13，推測C-24 連有羥基.由于C-24 位連接羥基，產(chǎn)生誘導效應，導致C-22，C-23 和C-25位化學位移向低場移動.在核Overhauser相關譜（NOESY）中，可以看到C-24的氫信號（δH3.89）與Me-21（α）氫信號（δH1.05）相關，從而確定C-24的羥基為β型.

在1H NMR（C5D5N，600 MHz）譜中低場區(qū)出現(xiàn)3 個糖的端基質子信號，分別為δH4.82（1H，d，J=7.8 Hz），δH4.94（1H，d，J=7.2 Hz）和δH5.35（1H，d，J=7.8 Hz），提示化合物中存在3分子糖.酸水解結果表明，分子中存在葡萄糖、木糖和阿拉伯糖.由HMBC 譜可知，葡萄糖的端基質子信號（δH4.82，1H，d，J=7.8 Hz）與母核C-3（δC77.08）存在遠程相關，因此推測該糖連接在皂苷元母核C-3位，木糖的端基質子信號（δH5.35，1H，d，J=7.8 Hz）和阿拉伯糖的端基質子信號（δH4.94，1H，d，J=7.2 Hz）分別與葡萄糖的C-4′（δC79.92），C-6′（δC68.22）存在遠程相關，推測木糖和阿拉伯糖與葡萄糖的連接方式分別為1→4和1→6.此外，化合物5的糖基碳化學位移值與文獻［11］報道基本一致.

綜上所述，鑒定化合物5（分子式C43H70O19）結構為（25R）-6-酮-5α-呋喃甾烷-3β，22α，24β，26-四醇-3-O-β-D-吡喃木糖基-（1→4）-［α-L-吡喃阿拉伯糖基-（1→6）］-β-D-吡喃葡萄糖苷.經(jīng)文獻檢索可知其為新化合物.化合物5的HMBC與COSY相關譜圖見本文支持信息中圖S5，13CNMR數(shù)據(jù)見表1.

化合物6 為白色粉末（乙腈-水），m.p.145～147 ℃，Liebermann-Burchard 和Molish 反應陽性，與E 試劑反應顯粉紅色，提示該化合物可能為呋甾皂苷類化合物.HR-ESI-MS 分析得出m/z595.3843［M+H-H2O］+，提示化合物6的分子量為612.3843，推測其分子式為C33H56O10.

化合物6的13C NMR（C5D5N，150 MHz）譜共給出33個碳信號，其中包括27個皂苷元碳信號和6個糖基碳信號.結合DEPT譜可知，低場區(qū)δC105.29推測為糖的端基碳信號，δC71.82～81.25共給出7個連氧叔碳信號，推測為糖基C-2～C-5或甾體皂苷苷元上的連氧碳信號，δC16.88，13.83，16.56和17.57為4個甲基碳信號.化合物6的1H NMR（C5D5N，600 MHz）譜中，高場區(qū)出現(xiàn)了4組甲基質子信號，分別為δH0.76（3H，s），δH0.74（3H，s），δH1.2（3H，d，J=7.2 Hz）和δH0.89（3H，d，J=6.6 Hz），根據(jù)HSQC以及HMBC譜，可將這4組甲基碳信號分別歸屬為C-18（δC16.88），C-19（δC13.83），C-21（δC16.56）和C-27（δC17.57）.由于C18質子信號（δH0.76，3H）處于低場而C19質子信號（δH0.74，3H）處于高場，可確認甾體皂苷元5位氫為α構型.

結合HMBC 譜可知，δH0.89（3H，d，J=6.6 Hz，H-27）分別與δC28.46，δC34.55 和δC75.51 存在C-H遠程相關，可將這3組碳信號分別歸屬為C-24，C-25和C-26.δH1.2（3H，d，J=7.2 Hz，H-21）分別與δC64.05，δC40.80 和δC110.73 存在C-H 遠程相關，可將這3 組碳信號分別歸屬為C-17，C-20 和C-22.δH0.76（3H，s，H-18）分別與δC40.34，δC41.26，δC56.46和δC64.05存在C-H遠程相關，可將這4 組碳信號分別歸屬為C-12，C-13，C-14 和C-17.δH0.74（3H，s，H-19）分別與δC46.63，δC45.37，δC54.75 和δc 37.68 存在C-H 遠程相關，可將這4 組碳信號分別歸屬為C-1，C-5，C-9 和C-10.在1H-1H COSY譜中，δH4.82（H-16）與δH1.9，1.3（H-15）存在1H-1H相關，再結合HSQC譜，可歸屬δc 81.25（連氧叔碳）為C-16 信號，歸屬δC32.53 為C-15 信號.δH1.8（H-25）與δH3.5 和3.82（H-26）分別存在1H-1H相關，再結合HSQC 譜，可歸屬δC75.51（連氧仲碳）為C-26 信號，并推測其與糖基相連形成糖苷鍵.δH1.16，1.24（H-1）與δH3.93（H-2）存在1H-1H 相關，故將δC73.18 歸屬為C-2，同時δH3.93（H-2）又與δH3.74（H-3）存在1H-1H相關，故將δC76.8（連氧叔碳）歸屬為C-3信號，并推測C-2，C-3連有羥基.由于C-2，C-3 連有羥基產(chǎn)生誘導效應，導致C-1 和C-4 化學位移值向低場移動.在NOESY 譜中，可以看到C-2的氫信號（δH3.93）與Me-19（β）氫信號（δH0.74）相關，從而確定C-2的羥基為α型.C-3的氫信號（δH3.74）與C-5（α）氫信號（δH1.09）相關，從而確定C-3 的羥基為β型.C-26 位質子信號（δHa3.47，δHb3.58）的差值Δab=δHa-δHb≤0.48，提示25位的構型為R型.

在1H NMR（C5D5N，600 MHz）譜中低場區(qū)出現(xiàn)1個糖的端基質子信號為δH4.69（1H，d，J=7.8 Hz），提示化合物中存在1分子糖，由J=7.8 Hz可知1分子糖的端基質子為β構型，酸水解結果表明分子中存在葡萄糖.由HMBC 譜可知，葡萄糖的端基質子信號（δH4.69，1H，d，J=7.8 Hz）與母核C-26（δC75.51）存在遠程相關，因此推測該糖連接在皂苷元母核C-26位.

綜上所述，鑒定化合物6（分子式C33H56O10）結構為（25R）-5α-呋甾-2α，3β，22α，26-四醇-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷.經(jīng)文獻檢索可知其為新化合物.化合物6的HMBC與COSY相關譜圖見本文支持信息中圖S6，詳細13C NMR數(shù)據(jù)見表1.

2.2 薤中6種化合物對PC12細胞H2O2誘導氧化損傷的保護作用

各實驗組對PC12細胞的活性測試結果如圖2所示.與未經(jīng)處理的空白對照組相比，模型組細胞活性明顯降低，說明H2O2對PC12細胞產(chǎn)生了氧化損傷.而經(jīng)過6種化合物共孵育處理后，化合物3實驗組與模型組相比，細胞活性顯著提高（*P＜0.05），其它5組未見明顯改善，說明化合物3對H2O2誘導的細胞損傷有顯著保護效果.

Fig.2 Effects of six compounds in Allium chinense G.Don on the viability of PC12 cells induced by H2O2

Fig.3 Effect of compound 3 on PC12 cell activity induced by H2O2 at different concentrations

將不同濃度的化合物3 與PC12 細胞共孵育24 h，再經(jīng)H2O2誘導PC12 細胞損傷后檢測細胞活性，結果如圖3所示.對照組是未經(jīng)H2O2處理的空白對照，其余各組均經(jīng)H2O2處理.與對照組（0 μg/mL）相比，80和120 μg/mL實驗組的細胞活性明顯提高，說明化合物3對H2O2誘導的PC12細胞氧化損傷的保護作用呈現(xiàn)劑量依賴性.

3 結 論

從新鮮薤（Allium chinenseG.Don）中分離得到6個新的甾體皂苷類化合物并鑒定了其化學結構，這6個化合物分別為5α-cholano-22，16-內酯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-（1→2）-［β-D-吡喃葡萄糖基-（1→3）］-β-D-吡喃葡萄糖基（1→4）-β-D-吡喃半乳糖苷（1）、6-酮-5α-cholano-22，16-內酯-3-O-β-D-吡喃木糖基-（1→4）-［α-L-吡喃阿拉伯糖基-（1→6）］-β-D-吡喃葡萄糖苷（2）、（25R）-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-5α-呋喃甾烷-3β，26-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-（1→2）-［β-D-吡喃葡萄糖基-（1→3）］-β-D-吡喃葡萄糖基（1→4）-β-D-吡喃半乳糖苷（3）、（25R）-6-酮-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-5α-呋喃甾烷-3β，22α，26-三醇-3-O-α-L-吡喃木糖基-（1→4）-β-D-吡喃葡萄糖苷（4）、（25R）-6-酮-5α-呋喃甾烷-3β，22α，24，26-四醇-3-O-β-D-吡喃木糖基-（1→4）-［α-L-吡喃阿拉伯糖基-（1→6）］-β-D-吡喃葡萄糖苷（5）和（25R）-5α-呋甾-2α，3β，22α，26-四醇-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（6）.其中，化合物1和2的皂苷元骨架在天然產(chǎn)物中首次分離得到.

抗氧化損傷活性實驗結果表明，由薤中分離出的6種化合物中只有化合物3對H2O2誘導的PC12細胞損傷有明顯保護作用，且具有劑量依賴關系，其它5種化合物無明顯保護效果.通過分析6種化合物的結構發(fā)現(xiàn)，化合物3與其它同類型5種化合物相比，側鏈糖基為葡萄糖和半乳糖組成的數(shù)量相對較多，同時22位無羥基或羰基存在，推測這些結構上的差異可能導致了其對H2O2誘導PC12細胞氧化損傷的不同的生物活性，這一點有待進一步研究.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20200905.