王會會，姜明星，戴 夢，葛鹍鵬*，鞠加學*，任風芝，張雪霞

(1.微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心 華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司，河北 石家莊 050015；2.華北制藥華勝有限公司，河北 石家莊 050015)

萬古霉素(Vancomycin)是由東方擬無枝酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種糖肽類抗生素[1]，早期由美國禮萊公司開發(fā)生產(chǎn)，1958年獲FDA批準上市[2]。萬古霉素通過抑制細胞壁中磷脂和多肽的生成來干擾細胞壁的合成，從而抑制細菌的生長和繁殖[3]。20世紀80年代，隨著β-內(nèi)酰胺類抗生素的大量使用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染逐漸流行。萬古霉素是臨床治療MRSA嚴重感染的重要藥物[4]，越來越受到研究者的關(guān)注，應(yīng)用日漸增多[5]。國內(nèi)萬古霉素生產(chǎn)廠家主要是浙江新昌制藥、浙江海正藥業(yè)、福星醫(yī)藥、重慶大新藥業(yè)及華北制藥等幾家大型企業(yè)[6-7]，銷量逐年遞增。

為提高發(fā)酵單位、降低產(chǎn)品成本[8]，作者在對實驗室菌株(東方擬無枝酸菌V19-07)進行選育的基礎(chǔ)上，對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，包括發(fā)酵溫度、發(fā)酵液pH值、通氣量和溶解氧濃度等，以期為萬古霉素規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 菌株與培養(yǎng)基

東方擬無枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)V19-07，由華北制藥華勝有限公司提供。

種子培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖20.0，蛋白胨5.0，NaCl 5.0，K2HPO40.3，pH值7.0～7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖30.0，玉米淀粉80.0，酵母粉10.0，低溫豆餅粉15.0，NaCl 1.0，KH2PO40.1，pH值7.0～7.2。

1.2 儀器

Innova 2300型發(fā)酵搖瓶機，美國New Brunswick Scientific；FUS-15L型種子罐、FUS-50L型發(fā)酵罐，上海國強生化工程裝備有限公司；LC-2030C型高效液相色譜儀，日本島津公司；LXJ-ⅡC型低速大容量多管離心機，上海安亭。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

搖瓶培養(yǎng)：將培養(yǎng)6 d的斜面挖塊0.5 cm2接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于28 ℃、220 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)24～28 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液以0.5%的接種量接種至10 L種子培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為28 ℃、通氣量為1.0 vvm、攪拌轉(zhuǎn)速為350 r·min-1的條件下培養(yǎng)24 h；然后以5%的接種量接種至30 L發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌通氣培養(yǎng)7 d后放罐。

1.3.2 測定方法

菌絲量的測定：將發(fā)酵液搖勻，吸取10 mL左右記為V1；3 000 r·min-1離心10 min，讀取上清液體積V2，按下式計算菌絲量(%)：

發(fā)酵效價的測定：取發(fā)酵液1.0 mL，用pH值為1.8～2.0的硫酸定容至10 mL，靜置60～90 min后于3 000 r·min-1離心10 min，取上清液進樣測定發(fā)酵效價。HPLC檢測條件：Symmetry Shield RP18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為pH值3.2的乙腈-四氫呋喃-2‰三乙胺水溶液(體積比7∶1∶92)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL·min-1；進樣量20 μL；檢測波長280 nm。

1.3.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化

采用單因素實驗分別對影響東方擬無枝酸菌V19-07發(fā)酵產(chǎn)萬古霉素的發(fā)酵溫度(26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃)、發(fā)酵液pH值(6.8、7.0、7.2、7.4)、通氣量(0.8 vvm、1.0 vvm、1.2 vvm、1.5 vvm)和溶解氧濃度(0%、10%、20%、30%)等因素進行優(yōu)化。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵溫度對東方擬無枝酸菌發(fā)酵產(chǎn)萬古霉素的影響

發(fā)酵溫度通過影響生物體內(nèi)的酶促反應(yīng)來調(diào)控微生物的代謝，進而影響次級代謝產(chǎn)物的合成[9]，是影響微生物發(fā)酵初級和次級代謝的重要因素之一。將培養(yǎng)液以5%的接種量接種至30 L發(fā)酵培養(yǎng)基中，在通氣量為1.0 vvm、攪拌轉(zhuǎn)速為350 r·min-1、發(fā)酵溫度分別為26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃的條件下培養(yǎng)7 d，考察發(fā)酵溫度對東方擬無枝酸菌V19-07發(fā)酵產(chǎn)萬古霉素的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 發(fā)酵溫度對菌絲量(a)和發(fā)酵效價(b)的影響

由圖1可知，不同發(fā)酵溫度下，2 d內(nèi)菌絲均能快速生長，菌絲量迅速增加；之后隨著發(fā)酵時間的延長，菌絲量總體呈增加趨勢，28 ℃發(fā)酵7 d的菌絲量達到最高，為60%。但菌絲存在自溶現(xiàn)象，不利于發(fā)酵產(chǎn)萬古霉素，尤其在32 ℃時，菌絲自溶更加明顯，5 d后發(fā)酵效價明顯下降；而26 ℃、28 ℃、30 ℃時，發(fā)酵效價基本呈直線上升趨勢，在7 d放罐時達到最高，其中，28 ℃時的發(fā)酵效價最高，達到13 457 U·mL-1。因此，選擇東方擬無枝酸菌V19-07發(fā)酵產(chǎn)萬古霉素的最佳發(fā)酵溫度為28 ℃。

2.2 發(fā)酵液pH值對東方擬無枝酸菌發(fā)酵產(chǎn)萬古霉素的影響

發(fā)酵液pH值的變化是微生物代謝活動的綜合反映。微生物在代謝過程中，迅速改變發(fā)酵液pH值的能力十分驚人，除與培養(yǎng)基成分有關(guān)外，決定性因素還是微生物自身的代謝特性。微生物生長繁殖和代謝合成產(chǎn)物都有最適的pH值范圍，因此，發(fā)酵過程中，必須使發(fā)酵液pH值保持在最適范圍內(nèi)[10]。東方擬無枝酸菌V19-07在發(fā)酵產(chǎn)萬古霉素的過程中消耗碳源持續(xù)產(chǎn)酸降低了發(fā)酵液的pH值，不利于菌株生長和代謝合成產(chǎn)物，需要通過補加氨水來調(diào)節(jié)pH值。

將培養(yǎng)液以5%的接種量接種至30 L發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過補加20%的氨水來控制發(fā)酵液pH值分別為6.8、7.0、7.2、7.4，在發(fā)酵溫度為28 ℃、通氣量為1.0 vvm、攪拌轉(zhuǎn)速為350 r·min-1的條件下培養(yǎng)7 d，考察發(fā)酵液pH值對東方擬無枝酸菌V19-07發(fā)酵產(chǎn)萬古霉素的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 發(fā)酵液pH值對菌絲量(a)和發(fā)酵效價(b)的影響

由圖2可知，不同發(fā)酵液pH值下，2 d內(nèi)菌絲均能快速生長，菌絲量迅速增加；之后進入次級代謝過程，菌絲量出現(xiàn)波動，在發(fā)酵液pH值為7.0和7.4時，發(fā)酵6 d后菌絲自溶明顯，菌絲量減少。不同發(fā)酵液pH值下，隨發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵效價基本呈直線上升趨勢，其中發(fā)酵液pH值為7.2時的發(fā)酵效價最高，發(fā)酵7 d達到13 513 U·mL-1。因此，選擇東方擬無枝酸菌V19-07發(fā)酵產(chǎn)萬古霉素的最佳發(fā)酵液pH值為7.2。

2.3 通氣量對東方擬無枝酸菌發(fā)酵產(chǎn)萬古霉素的影響

東方擬無枝酸菌發(fā)酵產(chǎn)萬古霉素屬于好氧發(fā)酵，因此，發(fā)酵過程中必須不斷通入一定量的無菌空氣。發(fā)酵液中溶解氧濃度大于微生物呼吸的最低氧濃度時，微生物才能正常生長和代謝合成產(chǎn)物。通氣量就是單位時間內(nèi)(通常為每分鐘)通入到發(fā)酵液中的氣體體積[11]。發(fā)酵過程中，通氣量由微生物呼吸需氧的多少決定。微生物呼吸需氧越多，通氣量就越大，反之則小。確定最佳通氣量不僅能提高發(fā)酵效率，還能節(jié)約能源。

將培養(yǎng)液以5%的接種量接種至30 L發(fā)酵培養(yǎng)基中，在發(fā)酵溫度為28 ℃、發(fā)酵液pH值為7.2、攪拌轉(zhuǎn)速為350 r·min-1、通氣量分別為0.8 vvm、1.0 vvm、1.2 vvm、1.5 vvm的條件下培養(yǎng)7 d，考察通氣量對東方擬無枝酸菌V19-07發(fā)酵產(chǎn)萬古霉素的影響，結(jié)果見表1。

表1 通氣量對東方擬無枝酸菌V19-07發(fā)酵產(chǎn)萬古霉素的影響

由表1可知，隨著通氣量的增加，菌絲量逐漸增加，說明通氣有利于菌絲生長；通氣量對發(fā)酵效價影響不大；隨著通氣量的增加，發(fā)酵液蒸發(fā)量隨之增加，放罐體積減小，發(fā)酵產(chǎn)量降低?？紤]到通氣量過大，消耗的空氣量相應(yīng)過多，造成能源的浪費，因此，選擇東方擬無枝酸菌V19-07發(fā)酵產(chǎn)萬古霉素的最佳通氣量為1.0 vvm。

2.4 溶解氧濃度對東方擬無枝酸菌發(fā)酵產(chǎn)萬古霉素的影響

抗生素產(chǎn)生菌大多為異養(yǎng)好氧型微生物，發(fā)酵過程中對溶解氧的要求很高，發(fā)酵液中的溶解氧濃度過高或者過低都會對微生物代謝產(chǎn)生不良影響。當溶解氧濃度過低時，氧的同化作用不足以滿足抗生素產(chǎn)生菌代謝活動所需的能量，限制了微生物代謝合成產(chǎn)物，降低了發(fā)酵效價；而溶解氧濃度過高，易引起初級代謝加快，基質(zhì)迅速消耗，導致投入基質(zhì)量增加，同時溶解氧濃度過高對空氣量和攪拌動力造成巨大浪費。因此，控制合適的溶解氧濃度非常必要。

將培養(yǎng)液以5%的接種量接種至30 L發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速控制最低溶解氧濃度分別為0%、10%、20%、30%，在發(fā)酵溫度為28 ℃、發(fā)酵液pH值為7.2、攪拌轉(zhuǎn)速為350 r·min-1、通氣量為1.0 vvm的條件下培養(yǎng)7 d，考察溶解氧濃度對東方擬無枝酸菌V19-07發(fā)酵產(chǎn)萬古霉素的影響，結(jié)果見表2。

表2 溶解氧濃度對東方擬無枝酸菌V19-07發(fā)酵產(chǎn)萬古霉素的影響

由表2可知，當溶解氧濃度超過10%時，發(fā)酵效價明顯提高；為了維持發(fā)酵過程中的高溶解氧，需要加快攪拌轉(zhuǎn)速，發(fā)酵液蒸發(fā)量相應(yīng)增加，放罐體積減小，發(fā)酵產(chǎn)量降低；菌絲量則隨攪拌轉(zhuǎn)速的加快逐漸增加，說明萬古霉素菌絲對攪拌剪切力不敏感。綜合各項指標可知，當溶解氧濃度控制在10%時，東方擬無枝酸菌V19-07發(fā)酵產(chǎn)萬古霉素的產(chǎn)量最高，此時攪拌轉(zhuǎn)速不快，動力成本相應(yīng)較低。

2.5 討論

東方擬無枝酸菌V19-07發(fā)酵產(chǎn)萬古霉素過程中，其菌絲生長和代謝合成產(chǎn)物均受多種因素的影響，包括發(fā)酵溫度、發(fā)酵液pH值、通氣量、溶解氧濃度等。發(fā)酵過程中的最大菌絲量隨發(fā)酵溫度的升高而增加，但超過30 ℃時，放罐時菌絲自溶，發(fā)酵效價下降。發(fā)酵液pH值對菌絲生長影響不大，對代謝合成產(chǎn)物影響明顯，發(fā)酵過程中效價均直線上升，pH值為7.2時發(fā)酵效價最高。較大的通氣量有利于菌絲生長，對代謝合成產(chǎn)物無影響，但通氣量增加會減小放罐體積，影響萬古霉素產(chǎn)量。萬古霉素菌絲對攪拌剪切力不敏感，發(fā)酵過程中加快攪拌轉(zhuǎn)速影響了溶解氧的傳遞，菌絲生長加快，菌絲量增加，但同時發(fā)酵液蒸發(fā)量增加，放罐體積減小。

2.6 50 L發(fā)酵罐驗證實驗

通過單因素實驗確定東方擬無枝酸菌V19-07發(fā)酵產(chǎn)萬古霉素的最優(yōu)工藝條件為：發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵液pH值7.2、通氣量1.0 vvm、溶解氧濃度10%，在上述條件下，進行50 L發(fā)酵罐驗證實驗，連續(xù)進罐3批，發(fā)酵效價穩(wěn)定，平均發(fā)酵效價達14 117 U·mL-1(表3)，平均產(chǎn)量達442 g，較優(yōu)化前提高18.8%。

表3 50 L發(fā)酵罐驗證實驗結(jié)果

3 結(jié)論

采用東方擬無枝酸菌V19-07發(fā)酵產(chǎn)萬古霉素，通過單因素實驗對發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，確定最優(yōu)發(fā)酵工藝為：發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵液pH值7.2、通氣量1.0 vvm、溶解氧濃度10%。該工藝經(jīng)50 L發(fā)酵罐驗證，發(fā)酵效價穩(wěn)定，可用于規(guī)模化生產(chǎn)。