劉 敬， 吳 健 ， 梁文華， 習(xí)彥花， 方 楠， 程輝彩， 康文懷

(1河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 河北 石家莊 050018； 2. 河北省科學(xué)院生物研究所， 河北 石家莊 050081)

頭孢菌素是目前應(yīng)用最為廣泛的廣譜抗生素之一，頭孢菌素C是頭孢菌素類產(chǎn)品的前體，頭孢菌素C發(fā)酵產(chǎn)生大量的抗生素菌渣，每生產(chǎn)1 t抗生素大約產(chǎn)生8～10 t濕菌渣[1]，經(jīng)提取處理的菌渣仍含有少量的抗生素，直接排放污染環(huán)境破壞生態(tài)。目前企業(yè)處理抗生素菌渣所采取的技術(shù)以焚燒為主[2]，但該技術(shù)存在能耗高、嚴(yán)重污染環(huán)境等弊端，而厭氧消化可以有效避免該問題。菌渣厭氧發(fā)酵在將低品質(zhì)的生物質(zhì)能轉(zhuǎn)換為清潔能源沼氣的同時，可以顯著降低能耗、減輕環(huán)境污染，但厭氧發(fā)酵過程會產(chǎn)生大量沼液，沼液安全處理是解決厭氧發(fā)酵產(chǎn)業(yè)鏈正常運行的關(guān)鍵問題之一。

沼液中含有豐富的氮磷鉀等營養(yǎng)物質(zhì)[3]，農(nóng)用可以促進(jìn)植物生長，并改善土壤環(huán)境[4-5]，減少化肥使用量。例如沼液對番茄、辣椒和水稻等作物的致病菌有明顯的抑制作用[6-7]和促進(jìn)早熟禾種子萌發(fā)[8]。由于厭氧發(fā)酵存在發(fā)酵周期短，進(jìn)出料時間不規(guī)范等問題，造成很多營養(yǎng)物質(zhì)無法被完全利用[9]，未完全發(fā)酵的沼液直接施入農(nóng)田會對環(huán)境和植物產(chǎn)生損害，因此需將沼液進(jìn)一步貯存使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)繼續(xù)分解完全，從而達(dá)到合理資源化利用頭孢菌素C菌渣的目的。目前對于牛糞等畜禽糞污沼液和秸稈類物質(zhì)的沼液應(yīng)用以及貯存過程研究較多，以頭孢菌素C菌渣為原料的厭氧發(fā)酵沼液應(yīng)用和貯存期間理化性質(zhì)變化文獻(xiàn)比較少，因此本研究為抗生素菌渣厭氧發(fā)酵沼液的無害化開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

白三葉(Trifoliumrepens)種子：購于某種業(yè)公司；沼液：取自實驗室連續(xù)運行的頭孢菌素C菌渣厭氧發(fā)酵罐，水力停留時間20 d。

1.2 方法

1.2.1 沼液理化性質(zhì)測定實驗方法

將沼液置于2 L塑料桶中，室溫、避光、密閉保存，每個月定時取一定量的沼液檢測相關(guān)理化性質(zhì)。將沼液貯存時間1～6個月分別編號為T1，T2，T3，T4，T5和T6。

1.2.2 沼液對白三葉種子萌發(fā)及生長的影響實驗方法

選擇顆粒飽滿的白三葉種子并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的KMnO4溶液消毒30 min，用去離子水清洗干凈后用濾紙吸去表面水分備用。

用直徑為90 mm的平板平鋪3層濾紙作為發(fā)芽床，每個平板放置50粒種子，將其均勻放置。將貯存時間為1和6個月的頭孢菌素C菌渣厭氧發(fā)酵沼液經(jīng)過3層紗布過濾后逐步稀釋，稀釋倍數(shù)為0，10，20，40，60，80，100，200，300，400，500倍。以去離子水處理組作為對照，每個處理設(shè)置3個平行，在第3、7天統(tǒng)計種子發(fā)芽數(shù)，在白三葉種子萌發(fā)的第7天，測量其根長、芽長、鮮重、干重。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 沼液理化性質(zhì)測定指標(biāo)及方法

在不同貯存時間測其pH值，電導(dǎo)率，VFA，TIC，SCOD，總磷，氨氮等。VFA和TIC：Nordmann滴定法[10]。SCOD和氨氮：8000 rpm離心10 min后取上清，用連華試劑盒測定。全磷：鉬酸銨分光光度法[11]。

1.3.2 沼液對白三葉種子萌發(fā)及生長的影響測定指標(biāo)及方法

統(tǒng)計白三葉生長發(fā)芽勢、發(fā)芽率、芽長、根長、活力指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)。

發(fā)芽勢=(發(fā)芽初期(3天內(nèi)發(fā)芽種子數(shù))/供試種子數(shù))×100%；

發(fā)芽率=(第7天正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)；

式中：Gt為處理t日的發(fā)芽數(shù);Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)； 活力指數(shù)=(根長+芽長)×發(fā)芽指數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用spss10.0對實驗進(jìn)行方差分析(One-way ANOVA)，用DPS7.05進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析(Duncan法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯存時間對沼液理化性質(zhì)的影響

為確定貯存時間對沼液理化性質(zhì)的影響，在不同貯存時間(半年內(nèi))，分別對頭孢菌素C菌渣厭氧發(fā)酵沼液進(jìn)行定期取樣，測定其pH值，電導(dǎo)率，VFA/TIC，SCOD，總?cè)芙庑粤?、氨氮等理化指?biāo)。

2.1.1 貯存時間對沼液pH值和電導(dǎo)率的影響

沼液貯存過程中pH值和電導(dǎo)率變化如圖1所示，結(jié)果表明，pH值在7.05～8.36范圍內(nèi)，貯存期間pH值呈弱堿性，隨著貯存時間延長，沼液的pH值和電導(dǎo)率均呈逐漸升高趨勢；電導(dǎo)率主要受自由移動的離子影響，電導(dǎo)率范圍在25.9 ～28.55 ms·cm-1，隨著貯存時間延長，沼液電導(dǎo)率呈逐漸增加的趨勢，保證植物生長的EC值應(yīng)該0.2～0.6 ms·cm-1范圍內(nèi)[12]，遠(yuǎn)超于種子發(fā)芽最適電導(dǎo)率，因此沼液原液對種子發(fā)芽有很強抑制作用，不能直接使用。

圖1 不同貯存時間對沼液pH值和電導(dǎo)率的影響

2.1.2 貯存時間對沼液VFA，TIC和SCOD的影響

SCOD(可溶性有機物)值由13560 mg·L-1降至2350 mg·L-1，降低了84.6%，說明在起始沼液中存在大量有機物，發(fā)酵不完全。在沼液貯存過程中，隨著沼液中微生物對有機物的降解，SCOD水平顯著下降，而在貯存第6個月時，由于大部分有機物已經(jīng)降解，導(dǎo)致微生物活動較緩慢，從而SCOD值變化較小。如圖2和圖3所示。沼液在貯存0～6個月內(nèi)迅速下降后趨于平緩，SCOD維持在2400 mg·L-1，也證明了發(fā)酵越完全的沼液SCOD值越低，更適用于農(nóng)田作為肥料，按照國家《蔬菜灌溉水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》要求化學(xué)需氧量≤150 mg·L-1，因此沼液農(nóng)田應(yīng)用時應(yīng)該稀釋相應(yīng)的倍數(shù)才能將其用于灌溉。

圖2 不同貯存時間對沼液VFA和TIC的影響

圖3 不同貯存時間對沼液SCOD的影響

隨著貯存時間延長，VFA(揮發(fā)性酸)在貯存6個月含量逐漸降低，由10549 mg·L-1降至1307.5 mg·L-1，降低了87.6%，之后趨于平緩。揮發(fā)性酸是由發(fā)酵產(chǎn)酸菌利用小分子化合物產(chǎn)生，甲烷菌主要利用小分子VFA形成甲烷，在貯存0～3個月，微生物發(fā)酵導(dǎo)致VFA消耗較快，貯存4～6個月之間趨于平緩，這與SCOD的變化趨勢類似，表明貯存過程延續(xù)了厭氧發(fā)酵，隨著剩余可利用的有機物含量及VFA的進(jìn)一步消耗，發(fā)酵基本結(jié)束。TIC(碳酸氫鹽堿度)值顯著升高后維持不變。TIC值由6400 mg·L-1增至15900 mg·L-1，增加了148.4%。而VFA/TIC是衡量厭氧發(fā)酵過程中發(fā)酵液性質(zhì)穩(wěn)定的一個重要指標(biāo)[13]，由圖2可知，在沼液貯存6個月期間系統(tǒng)的VFA/TIC值由1.65降至0.082，貯存末期的發(fā)酵趨于穩(wěn)定。

2.1.3 貯存時間對沼液總磷、氨氮的影響

沼液中的總磷和氨氮都是保證植物生長所必要的營養(yǎng)元素，沼液中TP(總磷)的含量隨著貯存時間的增長顯著降低，TP由114.4 mg·L-1降至77.4 mg·L-1，降低了32.3%，并且在貯存初期總磷含量降低較緩慢，后期下降較快速，沼液中的氮主要是以氨態(tài)氮形式存在[14]，沼液中氨氮含量隨著貯存時間的增長無顯著變化，在3700 mg·L-1左右浮動(見圖4)。氨氮是由含氮有機物分解產(chǎn)生，在體系中的分解、揮發(fā)、吸附沉淀和硝化作用以及被甲烷菌等微生物利用的過程中達(dá)到并維持動態(tài)平衡狀態(tài)[15]。

圖4 貯存時間對沼液總磷、氨氮的影響

2.2 貯存時間沼液對白三葉萌發(fā)和幼苗生長的影響

根據(jù)上述研究結(jié)果，由于發(fā)酵中新出的沼液有機質(zhì)含量較高毒性較強，對植物影響較大，為了探究不同貯存時間對白三葉萌發(fā)的影響，分別選取了貯存時間為1和6個月的沼液，進(jìn)行種子萌發(fā)試驗，觀察不同貯存時間對白三葉種子萌發(fā)和生長指標(biāo)的影響。

2.2.1 貯存時間沼液對白三葉種子萌發(fā)參數(shù)影響

發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)是描述種子萌發(fā)以及長勢的指標(biāo)。由表1所示，沼液原液無法使白三葉萌發(fā)，但是隨著沼液稀釋倍數(shù)的增大，發(fā)芽率和發(fā)芽勢在抑制解除后與對照無顯著差異，沼液對發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)高濃度抑制，低濃度促進(jìn)。

表1 貯存時間對白三葉種子萌發(fā)的影響

T1在沼液稀釋20倍以下三葉草不萌發(fā)，稀釋200倍時，發(fā)芽勢、發(fā)芽率和活力指數(shù)與對照無顯著差異，解除抑制作用；發(fā)芽指數(shù)在稀釋60倍時與對照無顯著差異，并且在稀釋300倍時相比對照提高了37.5%；活力指數(shù)在稀釋400倍時相比對照提高了10.9%。T6在沼液稀釋10倍以下三葉草基本不萌發(fā)，在沼液稀釋60倍時，發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)與對照無顯著差異，解除抑制作用；沼液稀釋100倍時，發(fā)芽指數(shù)相比對照提高了37.4%；活力指數(shù)相比對照提高了16.4%。也表明了高濃度沼液對種子有顯著的抑制作用和毒害作用，沼液稀釋一定倍數(shù)后抑制作用解除，綜合考慮T1在稀釋300倍時效果最好，而T6在稀釋100倍時效果最好，也說明了抗生素沼液貯存一定時間可以減少毒害作用，并且稀釋相應(yīng)倍數(shù)可以促進(jìn)白三葉的萌發(fā)。

2.2.2 沼液貯存時間對白三葉幼苗生長的影響

根長、芽長、鮮重和干重是衡量幼苗生長情況的指標(biāo)。由圖5～圖8可知，采用不同濃度沼液對幼苗生長有不同影響，沼液對根長和芽長有不同程度促進(jìn)作用，沼液高濃度抑制白三葉根、芽生長，低濃度促進(jìn)。T1對根長有顯著的抑制作用，在沼液稀釋400倍時，根長達(dá)到最長；芽長、干重和鮮重分別在沼液稀釋200倍、100倍、100倍與CK相比無顯著差異，芽長在稀釋400倍時相比CK提高了10.7%，鮮重在稀釋400倍時相比對照提高了10.6%。T6隨著沼液稀釋倍數(shù)的增大，出現(xiàn)先抑制后促進(jìn)的現(xiàn)象，根長在沼液稀釋100倍時與對照無顯著差異，芽長、鮮重和干重分別在沼液稀釋80倍時解除抑制，根長在稀釋300倍時相比對照增加了17.1%，芽長在稀釋100倍時相比對照提高了9.3%，在稀釋100倍時相比對照增加了14.9%。也說明了沼液在稀釋一定的倍數(shù)可以促進(jìn)幼苗的生長和發(fā)育，綜合考慮幼苗生長指標(biāo)的影響，T1在沼液稀釋400倍時幼苗生長最好，而T6在稀釋100倍時幼苗生長最好。

圖5 不同貯存時間對白三葉芽長的影響

圖6 不同貯存時間對白三葉根長的影響

圖7 不同貯存時間對白三葉鮮重的影響

圖8 不同貯存時間對白三葉干重的影響

3 討論

3.1 貯存時間對沼液理化性質(zhì)的影響

目前針對沼液農(nóng)用、畜禽糞污和農(nóng)作物秸稈沼液貯存期間理化性質(zhì)變化等方面的研究相對較多，但是對抗生素菌渣厭氧發(fā)酵沼液貯存變化特征未見相關(guān)報道。沼液中的成分較為復(fù)雜，而不同原料之間也存在很大差異，甚至同一豬場產(chǎn)生沼液都有很大不同[16]。本試驗將沼液貯存6個月，觀察理化性質(zhì)的變化，表明抗生素菌渣厭氧發(fā)酵沼液貯存一定時間，pH值和電導(dǎo)率均呈上升趨勢，這一結(jié)果與黃丹丹[17]等和對豬糞沼液貯存46天內(nèi)pH值緩慢上升結(jié)論一致。pH值越大，電導(dǎo)率也隨之增大，堿性條件有助于SCOD和溶解性蛋白質(zhì)和部分磷的溶出[18]，堿性條件下電導(dǎo)率會增加。在沼液貯存過程中SCOD值顯著降低，與張麗萍[19]等對豬糞沼液貯存維持11天化學(xué)需氧量也呈逐漸減小并趨于平穩(wěn)的趨勢結(jié)果相一致，其整體下降了69%以上，本試驗為貯存時間0～6個月降低了84.6%，可能是由于厭氧發(fā)酵原料不同導(dǎo)致貯存周期變長。

總磷和氨氮作為營養(yǎng)物質(zhì)，是植物生長所需要的必要營養(yǎng)元素，沼液在貯存過程中氨氮濃度相對比較穩(wěn)定。此結(jié)論與劉慶玉[20]等對沼液貯存結(jié)論不同，貯存時間為30天，氨氮含量在遮光、厭氧條件下會上升，在光照、自然貯存會降低，但本試驗得到氨氮與貯存時間無顯著差別的結(jié)論，可能與貯存方式不同有關(guān)。總磷在貯存過程中有下降趨勢，而這與李曉娟[21]對不同貯存方式貯存玉米秸稈沼液總磷下降了51%以上，而在貯存環(huán)境30℃，遮光耗氧條件下總磷含量下降最快，總磷變化一致。總磷含量下降原因可能是磷酸類物質(zhì)被孔隙度較大的物質(zhì)吸附，或者與其他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)不斷沉降到沼渣中所造成，同時沼液貯存過程中受季節(jié)的環(huán)境溫度不同而影響到的微生物活性，物質(zhì)利用速率隨之受到影響。

各項理化指標(biāo)變化進(jìn)一步說明在初始階段沼液尚未發(fā)酵完全，還有大量未發(fā)酵的有機物，直接施用會對植物和土壤造成損害，需要將沼液貯存一定時間再施用。

3.2 不同貯存時間沼液對白三葉萌發(fā)和幼苗生長的影響

高濃度沼液對白三葉種子萌發(fā)和生長有顯著的抑制作用，尤其沼液原液無法使白三葉萌發(fā)，隨著稀釋倍數(shù)的增加，抑制效果會逐漸降低，而沼液低濃度會促進(jìn)白三葉種子的萌發(fā)和生長。T1在稀釋200倍時白三葉萌發(fā)的各項指標(biāo)與CK無顯著差異，解除抑制，低濃度沼液對白三葉萌發(fā)無顯著影響，但是對幼苗生長影響較大，綜合各項指標(biāo)其最適稀釋倍數(shù)為400倍，T6在稀釋60倍時白三葉萌發(fā)的各項指標(biāo)基本解除抑制，而綜合各項指標(biāo)其最適稀釋濃度為100倍，這一結(jié)果與唐才祿[22]等對沼液對生姜催芽效果在適宜濃度上有差異，可能是由于厭氧發(fā)酵原料和沼液組成不同導(dǎo)致的。

T6與T1相比，白三葉種子萌發(fā)和幼苗生長的各項參數(shù)解除抑制的沼液稀釋倍數(shù)要低，但是隨著沼液稀釋倍數(shù)的增大，就會造成各項參數(shù)(除根長)都要顯著低于貯存6個月的沼液，這證明了隨著貯存時間的增長，沼液毒性會降低，但是營養(yǎng)物質(zhì)也隨之降低。T1根長遠(yuǎn)低于T6根長，但是芽長兩者在適宜的濃度都會促進(jìn)其生長，也說明了白三葉根和芽對于毒性的敏感性不同，根要比芽敏感。沼液可用于農(nóng)用，但是將其直接作用于農(nóng)田有一定風(fēng)險[23]。將沼液貯存一段時間，貯存期間還可以將降低銅、鋅和砷等重金屬的含量以及大腸桿菌數(shù)量[24]，將其用于農(nóng)用也會減少重金屬富集和有害微生物風(fēng)險，并且本試驗也表明了沼液貯存一定時間，對種子毒性減小，將其利用時稀釋倍數(shù)也逐漸減小。綜上所述，頭孢菌素C菌渣厭氧發(fā)酵沼液貯存一定時間，毒性和對植物傷害會降低，稀釋到適宜的倍數(shù)，會促進(jìn)白三葉種子的萌發(fā)和幼苗生長。

4 結(jié)論

(1)頭孢菌素C菌渣厭氧發(fā)酵沼液隨貯存時間延長，VFA和SCOD顯著下降，TIC顯著上升，pH值，電導(dǎo)率和總磷呈下降趨勢，氨氮濃度相對比較穩(wěn)定。

(2)高濃度沼液顯著抑制種子萌發(fā)、根和芽的生長。貯存6個月的沼液，稀釋60倍以上解除抑制作用，并且在適宜濃度還顯著促進(jìn)種子萌發(fā)、根、芽的生長。

(3)貯存1個月的沼液稀釋300倍時，發(fā)芽指數(shù)達(dá)到最大，增長了37.5%，沼液稀釋400倍時，活力指數(shù)、芽長和鮮重分別提高10.9%，10.7%和10.6%。貯存6個月的沼液稀釋300倍時，根長達(dá)到最大，相比CK增大9.3%，沼液稀釋100倍時，發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、芽長和鮮重分別提高37.4%，16.4%，9.3%，14.9%。