倪 婧，謝道燕，江秀均，楊振國，柴建萍

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101）

熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）因定量準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性高等優(yōu)點，成為基因表達差異檢測、基因分型、甲基化檢測、基因表達水平等研究中的重要技術(shù)手段，但該技術(shù)在操作過程中對樣品RNA質(zhì)量、純度要求較高，為減少不同樣品間提取的RNA質(zhì)量、純度、反轉(zhuǎn)錄效率等操作過程中的誤差，在qRT-PCR試驗中還需引入一個或幾個表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因作為參照物對表達結(jié)果進行校正和標(biāo)準(zhǔn)化處理［1，2］，因而引入的內(nèi)參基因在試驗樣品中的表達穩(wěn)定性決定基因定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

理想的內(nèi)參基因應(yīng)符合以下幾個條件：在生物體內(nèi)表達量適中；表達水平與生物體內(nèi)細(xì)胞周期及細(xì)胞活化與否無關(guān)；在生物體內(nèi)不同類型組織細(xì)胞、不同生長發(fā)育階段表達量都相對恒定，無顯著性差異；且不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，均能穩(wěn)定表達。目前常用的內(nèi)參基因有延伸因子1（elongation factor-1 alpha，ELFn）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、琥珀酸脫氫酶復(fù)合體A亞基（succinate dehydrogenase complex subunit A，SDHA）、α微管蛋白（tubulin alpha-1 chain，α-tubulin）、β-肌動蛋白（β-Actin）、5.8S核糖體RNA（5.8Sribosomal RNA，5.8SrRNA）等基因［3，4］。常用的內(nèi)參基因雖然均能在生物體內(nèi)穩(wěn)定表達，但并非所有內(nèi)參基因都完美的適用于任何生物體，因此在不同的生物樣本及特定試驗條件下，要得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果，科學(xué)篩選內(nèi)參基因以最優(yōu)選擇匹配試驗是非常必要的［5-7］。

朱砂葉螨是世界重大害螨之一，危害農(nóng)林作物范圍較廣，對噠螨靈、樂果、阿維菌素、毒死蜱、甲氰菊酯、敵敵畏、辛硫磷等多種常用藥劑產(chǎn)生了較高的抗藥性。有研究表明，朱砂葉螨抗甲氰菊酯品系中最理想的內(nèi)參基因為RPS18和5.8S rRNA基因組合，而在卵、幼螨、若螨和成螨4個不同螨態(tài)中則為RPS18和α-TUB基因組合［8，9］。二斑葉螨抗甲氰菊酯品系α-TUB基因最穩(wěn)定［10］，在抗季酮酸類品系中Ubiquitin和β-actin基因為最適內(nèi)參基因［11］，在抗阿維菌素品系中最佳內(nèi)參基因為ELFn［2］；柑橘全爪螨在不同藥劑選擇壓力和外界脅迫下，最理想的內(nèi)參基因組合為ELFn和GAPDH［12］。炔螨特曾被認(rèn)為是安全、低毒、高效且不易產(chǎn)生抗藥性的藥劑，但在近年的研究中發(fā)現(xiàn)各地區(qū)各植物上的朱砂葉螨對炔螨特也表現(xiàn)出不同程度的抗藥性，對炔螨特抗藥性的相關(guān)分子機制研究需要用到熒光定量PCR技術(shù)，但對炔螨特抗藥性的朱砂葉螨品系及各發(fā)育階段的最佳內(nèi)參基因無直接參考依據(jù)。本研究利用geNorm軟件，對朱砂葉螨敏感品系及抗炔螨特品系各發(fā)育階段中6個常用內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行評估，篩選出各品系、各發(fā)育階段的最佳內(nèi)參基因，為以后開展朱砂葉螨對炔螨特抗藥性相關(guān)分子機制研究選擇內(nèi)參基因提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試朱砂葉螨

朱砂葉螨敏感品系采自重慶市北碚區(qū)田間，在人工氣候室內(nèi)［（25±1）℃，60%～80%RH，L∶D=14 h∶10 h］持續(xù)用新栽無蟲豇豆苗（Vigna sinensis）繼代飼養(yǎng)多年，不噴施任何藥劑，作為相對敏感品系。

朱砂葉螨抗炔螨特品系：從上述敏感品系中分離出部分朱砂葉螨作為起始材料，以炔螨特為選擇藥劑，在人工氣候室內(nèi)［（25±1）℃，60%～80%RH，L∶D=14 h∶10 h］噴施炔螨特，連續(xù)多代選育出對炔螨特有較強抗性的朱砂葉螨。

1.2 主要試劑盒

RNeasy Plus Micro Kit，PrimeScriptTMRT reagent Kit Perfect Real Time，SYBR?Premix Ex TaqTMII。

1.3 方法

1.3.1 朱砂葉螨敏感品系和抗炔螨特品系各發(fā)育階段供試螨獲取 參照葉碟法并加以改進飼養(yǎng)各發(fā)育階段的朱砂葉螨，取7～10 cm的培養(yǎng)皿若干，把濾紙剪成直徑6～8 cm大小的圓形紙碟，在培養(yǎng)皿內(nèi)先鋪上適當(dāng)大小的脫脂棉，再把濾紙平鋪在脫脂棉上，加清水至飽和，將新栽的無蟲豇豆苗葉片剪成直徑5.0 cm大小，背面朝上正面緊貼濾紙平鋪，形成孤島狀，防止葉螨逃離。分別將敏感品系和抗炔螨特品系3～5日齡的活潑雌成螨用毛筆挑至葉蝶上，每個葉蝶接入40～50頭雌成螨，置于（25±1）℃、RH 60%～80%、光照周期14L∶10D的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，產(chǎn)卵24 h后移除葉蝶上的雌成螨，依次收集不同發(fā)育階段的螨。

卵的收集：產(chǎn)卵后待卵發(fā)育至3日齡時，用毛筆輕輕挑取約4 000粒卵于1.5 mL離心管中，用于RNA的提取。

幼螨的收集：部分卵留在葉蝶上繼續(xù)孵化為黃白色，3對足幼螨，孵化后12 h內(nèi)用毛筆挑取活動期的幼螨約2 500頭至1.5 mL離心管中，用于RNA的提取。

若螨的收集：剩余幼螨繼續(xù)在葉蝶上發(fā)育1 d成為4對足若螨（1齡若螨），用毛筆挑取約1 000頭于1.5 mL離心管中，用于RNA的提取。

雌成螨的收集：剩余若螨再經(jīng)過3 d發(fā)育為成螨（3日齡），用毛筆挑取約200頭雌成螨于1.5 mL離心管中，用于RNA的提取。

1.3.2 實時熒光定量PCR內(nèi)參基因引物設(shè)計 參照孫偉［9］和高新菊［10］設(shè)計的內(nèi)參基因引物，其中6個常用的內(nèi)參基因備選（表1）。

表1 朱砂葉螨內(nèi)參基因qRT-PCR引物序列

1.3.3 朱砂葉螨兩個品系各發(fā)育階段總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 使用Qiagen公司RNeasy Plus Micro Kit試劑盒提取敏感品系和抗炔螨特品系卵、幼螨、若螨、雌成螨總RNA，并進行質(zhì)量檢測。使用TAKARA公司PrimeScriptTMRT reagent Kit Perfect Real Time試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA合成第一鏈cDNA。

1.3.4 內(nèi)參基因引物熔解曲線分析及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 熔解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線是判斷設(shè)計合成的引物是否具有特異性及較高擴增效率的重要指標(biāo)。

熔解曲線分析：以敏感品系雌成螨cDNA為模板，在實時熒光定量PCR儀中進行內(nèi)參基因引物熔解曲線擴增，試驗設(shè)3次技術(shù)重復(fù)，溫度以0.5℃∕10 s的速度從60℃緩慢遞增到95℃，連續(xù)測定樣品的熒光強度以獲取熔解曲線，熔解曲線為單峰且單峰前后無其他雜峰出現(xiàn)時對應(yīng)的引物特異性強，無引物二聚體形成，無非特異性擴增。

標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：以敏感品系雌成螨cDNA為模板，呈3倍梯度將模板稀釋為4個濃度（30、3-1、3-2、3-3），將熔解曲線為單峰的內(nèi)參基因引物在實時熒光定量PCR儀上進行試擴增，每個濃度梯度內(nèi)設(shè)3個技術(shù)重復(fù)，對照為滅菌蒸餾水。結(jié)果以相對拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)建立相對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)Ct值在15～30，斜率為-3.3±0.3，擴增效率在90%～110%，決定系數(shù)R2＞0.99時，說明該引物擴增性較好，可用于后續(xù)試驗。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系按照SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒說明書在冰上配制。

1.3.5 內(nèi)參基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測 分別以朱砂葉螨敏感品系和抗炔螨特性品系的卵、幼螨、若螨和雌成螨cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR檢測，滅菌蒸餾水為對照。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系按照SYBR?Premix Ex TaqTM II試劑盒說明書在冰上配制。

1.3.6 內(nèi)參基因穩(wěn)定性評價 使用geNorm軟件計算6個內(nèi)參基因表達穩(wěn)定度的平均值M，M值越小，該內(nèi)參基因表達越穩(wěn)定，再通過標(biāo)準(zhǔn)化因子配對差異分析（Vn∕n+）l來確定最適內(nèi)參基因數(shù)目［13，14］，ge-Norm軟件以0.15為默認(rèn)閾值，當(dāng)Vn∕n+l＜0.15時，說明沒必要使用數(shù)量大于n+l個內(nèi)參基因［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 朱砂葉螨兩個品系各發(fā)育階段總RNA純度測定和質(zhì)量檢測

用微量核酸蛋白質(zhì)濃度測定儀測定RNA濃度和純度，結(jié)果顯示（表2），所有提取的RNAOD260∕280在1.89～2.20，OD260∕230在1.95～2.31，說明提取的朱砂葉螨兩個品系各發(fā)育階段的RNA完整性好，可作為實時熒光定量PCR反應(yīng)模板。

表2 各RNA純度信息

對RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示（圖1），28S與18S條帶清晰，無拖帶，且亮度比約為2∶1，5S條帶較淡或幾乎不見，說明RNA降解較少，質(zhì)量好，可滿足后續(xù)試驗要求。

圖1 朱砂葉螨不同品系和不同螨態(tài)總RNA電泳

2.2 內(nèi)參基因引物熔解曲線及擴增效率分析

內(nèi)參基因熔解曲線顯示（圖2），6個內(nèi)參基因引物熔解曲線均為尖銳單峰，且單峰前后無其他雜峰，說明無非特異性擴增，無引物二聚體形成。標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示（表3，圖3），6個內(nèi)參基因重復(fù)性好，Ct值均在15～30，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程斜率為-3.3±0.3，擴增效率為92.125%～96.588%，決定系數(shù)R2均大于0.99。以上檢測結(jié)果說明合成的6個內(nèi)參基因引物特異性好，符合熒光定量PCR要求。

圖3 朱砂葉螨內(nèi)參基因qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 朱砂葉螨內(nèi)參基因qRT-PCR引物擴增效率

圖2 朱砂葉螨內(nèi)參基因qRT-PCR引物擴增產(chǎn)物的熔解曲線分析

2.3 內(nèi)參基因穩(wěn)定性評估

geNorm軟件計算出兩個品系6個候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定度為（表4，圖4）RPS18＞α-TUB＞SDHA＞5.8SrRNA＞GAPDH＞ELFn，軟件評估結(jié)果顯示，兩個品系間RPS18與α-TUB內(nèi)參基因組合表達穩(wěn)定度較高；不同發(fā)育階段6個候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定度為（表4，圖5）α-TUB＞GAPDH＞RPS18＞5.8S rRNA＞SDHA＞ELFn，軟件評估結(jié)果顯示不同發(fā)育階段α-TUB與GAPDH內(nèi)參基因組合表達穩(wěn)定度較高。

圖4 朱砂葉螨兩個品系候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

圖5 朱砂葉螨不同螨態(tài)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

表4 內(nèi)參基因穩(wěn)定性的評估結(jié)果

geNorm軟件標(biāo)準(zhǔn)化因子配對差異分析（Vn∕n+）l得出的比值顯示，兩個品系中V2∕3=0.07（圖6），不同發(fā)育階段V2∕3=0.112（圖7），均小于0.15的閾值，其余比值均大于0.15，說明沒必要選擇超過2個的內(nèi)參基因參與試驗，所以在兩個品系及不同發(fā)育階段不多于2個內(nèi)參基因作為參照最適合。

圖6 朱砂葉螨兩個品系多內(nèi)參參數(shù)P值

圖7 朱砂葉螨不同螨態(tài)多內(nèi)參參數(shù)P值

3 討論

所有基因包括內(nèi)參基因在生物體不同類型的組織、細(xì)胞、不同發(fā)育時期、不同試驗條件下均存在表達差異，所以內(nèi)參基因的選擇并非一勞永逸的事，而是需要根據(jù)特定的生物樣本及特定的試驗條件進行選擇。本試驗通過geNorm軟件篩選出朱砂葉螨敏感品系及抗炔螨特品系RPS18和α-TUB基因為最佳內(nèi)參組合，在卵、幼螨、若螨、雌成螨4個發(fā)育階段α-TUB和GAPDH基因為最佳內(nèi)參組合，為后續(xù)研究朱砂葉螨對炔螨特抗藥性分子機制等相關(guān)研究選擇理想內(nèi)參基因提供參考。