彭克忠, 喻洪, 夏苗, 劉韓, 蘭常軍, 吳富雨, 伍杰*

1.四川省甘孜藏族自治州林業(yè)科學(xué)研究所，四川 甘孜 626000；

2.甘孜藏族自治州翁達(dá)國(guó)有林場(chǎng)，四川 甘孜 626000

手參（Gymnadenia conopsea）藏藥名為旺拉，又名佛手參、手掌參等。據(jù)《藏藥標(biāo)準(zhǔn)》記載，手參味甘，性平，具有補(bǔ)益氣血、生津止渴、收斂止血、壯陽等功效，常用于治療身體虛弱、脾虛咳嗽、久瀉止血、陽痿等疾病[1]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，手參具有抗過敏、延緩衰老、促進(jìn)細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)、血管舒張等諸多活性[2]。作為一種藥食兩用的植物，手參也被廣泛使用于保健食品領(lǐng)域，具有很大的開發(fā)前景和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。現(xiàn)代研究表明，手參藥材主要含有苷類、菲類、二氫芪類、芳香族類化合物，如天麻素、Dactylorhin、Militarine[3-4]。此外，還含有酚酸類、醚類、醛類和甾醇類等成分[5]。目前，已有文獻(xiàn)采用色譜技術(shù)測(cè)定了手參中對(duì)羥基苯甲醇和天麻素類成分的含量[6-7]。然而，沒有對(duì)多類成分同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)分析的研究報(bào)道，這顯然不符合中藥多成分、多靶點(diǎn)的整體性特點(diǎn)。因此，本研究首次采用體現(xiàn)整體性的氫核磁共振（1H-NMR）代謝組學(xué)技術(shù)，同時(shí)檢測(cè)分析其初生和次生代謝產(chǎn)物，建立整體1H-NMR指紋圖譜，結(jié)合PCA化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，從代謝物組水平上系統(tǒng)分析了不同產(chǎn)地手參藥材的初生和次生代謝產(chǎn)物差異，從而對(duì)不同產(chǎn)地手參藥材的質(zhì)量進(jìn)行整體評(píng)價(jià)，以期篩選出優(yōu)質(zhì)手參的產(chǎn)地，為手參藥材的人工種植、品種選育、質(zhì)量控制和開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與研究方法

1.1 儀器與材料

布魯克Bruker700MHz核磁共振波譜儀；KQ-300B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；W201型恒溫水浴鍋（上海申順生物科技有限公司）；Sartorius BP221S電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

氘代甲醇（CD3OD，99.8%）和重水（D2O，99.9%）均購(gòu)自四川賽因斯特生物科技有限公司；3-(三甲基硅基)-2,2,3,3-四氘代丙酸鈉鹽（TSP）購(gòu)自Sigma-Aldrich (St.Louis, Mo, USA)；分析級(jí)磷酸二氫鉀（KH2PO4）購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠；天麻素（批號(hào)：DST191013-013）、Dactylorhin（批號(hào)：DST200901-233）、對(duì)羥基苯甲醇（批號(hào)：DST191016-123）、對(duì)羥基苯甲醛（批號(hào)：DST200513-129）、 Militarine（ 批 號(hào) ： DST200622-025）對(duì)照品均購(gòu)自成都德斯特生物技術(shù)有限公司，純度均大于98%。

2019年8 月，共收集了16批來自四川省甘孜州不同產(chǎn)地的手參藥材，鑒定結(jié)果均為蘭科植物手參Gymnadenia conopsea。采集后先除去泥土雜質(zhì)，及時(shí)放在日光下曬干，分別置于干燥陰涼處保藏，選取手參干燥塊莖作為試驗(yàn)樣品，樣品信息見表1。

表1 不同產(chǎn)地手參藥材的來源Tab.1 Origins of Gymnadenia conopsea from different regions

1.2 研究方法

1.2.11H-NMR測(cè)定條件

以氘代甲醇為頻率內(nèi)鎖，測(cè)定條件如下：觀察頻率700.20 MHz，測(cè)定溫度T = 25 ℃，采樣次數(shù)Number of Scans = 64，脈沖延遲時(shí)間 Relaxation Delay = 4.0 s，譜寬Spectral Width = 11 363.6 Hz，采樣時(shí)間Acquisition Time = 1.441 8 s，脈沖寬度Pulse Width = 10.87 μs，采用標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)飽和脈沖序列(ZGPR)壓制水峰信號(hào)。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

主要采用“加標(biāo)準(zhǔn)品定性試驗(yàn)”及對(duì)比文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行信號(hào)歸屬，將測(cè)得的1H-NMR自由感應(yīng)衰減信號(hào)導(dǎo)入MestReNova (version 7.0)軟件進(jìn)行傅立葉轉(zhuǎn)換，并手動(dòng)調(diào)整相位和基線，以TSP（0 mg·L-1）為基準(zhǔn)校正化學(xué)位移[8]。針對(duì)0.50～9.80 mg·L-1范圍的圖譜以0.002 mg·L-1為化學(xué)位移值單位進(jìn)行分段積分(binning)，然后以總峰面積進(jìn)行歸一化處理，再以ASCII格式輸出數(shù)據(jù)，得到各化學(xué)位移段與之相對(duì)應(yīng)的信號(hào)峰面積值，最后將獲得的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P軟件(version 11.5)，數(shù)據(jù)采用Center方法進(jìn)行尺度同一化處理，預(yù)處理后的數(shù)據(jù)再進(jìn)行主成分分析（PCA），以評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地手參藥材的質(zhì)量差異。

2 研究結(jié)果

2.1 1H-NMR 信號(hào)歸屬及代謝物鑒定結(jié)果

本試驗(yàn)共得到4 650段積分，扣除23段屬于甲醇溶劑的信號(hào)(3.280～3.326 mg·L-1)和200段殘留水峰的信號(hào) (4.65～5.05 mg·L-1)，最終獲得 4 427 段數(shù)據(jù)，代表4 427個(gè)變量進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)與分析。本研究從手參藥材提取物中共鑒定出14種化合物，包括天麻素、dactylorhin、militarine、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛、蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖、醋酸、丁二酸、甲酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸，同時(shí)發(fā)現(xiàn)含有飽和脂肪酸類、不飽和脂肪酸類和甾醇類成分（手參藥材代表性的一維1H-NMR譜見圖1）。由于1H-NMR是一種代謝組學(xué)分析技術(shù)，強(qiáng)調(diào)的是整體分析，無法準(zhǔn)確測(cè)定每一個(gè)成分的絕對(duì)含量，但可以通過峰面積代表相對(duì)含量進(jìn)行組間比較，圖3展示了不同產(chǎn)地手參藥材中幾個(gè)主要代謝成分的相對(duì)含量差異。

2.2 基于化學(xué)計(jì)量學(xué)的不同產(chǎn)地手參藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，天麻素、dactylorhin、militarine、對(duì)羥基苯甲醇、丙氨酸和不飽和脂肪酸類可能是引起不同產(chǎn)地手參的主要差異代謝物。PCA的得分圖見圖2，每一個(gè)投影點(diǎn)代表一個(gè)樣品，樣品編號(hào)對(duì)應(yīng)表1，前2個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為98.4%（PC1 = 94.2%，PC2 = 4.2%），由第一主成分（PC1）與第二主成分（PC2）的得分圖可知，不同產(chǎn)地的手參藥材主要沿著PC1軸分為兩大類，GC-1、GC-2、GC-3、GC-4、GC-5、GC-6、GC-7、GC-8、GC-9、GC-10 聚為一類，GC-11、GC-12、GC-13、GC-14、GC-15、GC-16聚為另外一類，表明不同產(chǎn)地藥材的質(zhì)量存在一定的差異。

圖2 不同產(chǎn)地手參藥材的 PCA 得分圖Fig.2 PCA score plot of Gymnadenia conopsea from different regions

圖3 不同產(chǎn)地手參藥材中主要代謝成分的表達(dá)水平比較Fig.3 Comparison of the expression levels of main metabolites in Gymnadenia conopsea from different regions

通過對(duì)鑒定的17種成分的歸一化峰面積進(jìn)行組間t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明（見圖3），與GC-11、GC-12、 GC-13、 GC-14、 GC-15、 GC-16 比 較 ，PCA分析聚為另一類的（GC-1、GC-2、GC-3、GC-4、GC-5、GC-6、GC-7、GC-8、GC-9、GC-10）手參藥材含有明顯更多的天麻素、dactylorhin、militarine、對(duì)羥基苯甲醇、丙氨酸和不飽和脂肪酸類成分（P＜0.05），而其他11種成分在不同產(chǎn)地間沒有顯著性差異?，F(xiàn)代研究表明，天麻素、dactylorhin、militarine和對(duì)羥基苯甲醇為手參藥材的主要活性成分，因此GC-1、GC-2、GC-3、GC-4、GC-5、GC-6、GC-7、GC-8、GC-9、GC-10產(chǎn)地的手參藥材有更好的質(zhì)量。

3 結(jié)論與討論

總體上看，本研究采用體現(xiàn)整體性的1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)，檢測(cè)分析了手參藥材的整體化學(xué)成分信息，鑒定了包括苷類、糖類、有機(jī)酸類及氨基酸類等初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物在內(nèi)的14種化合物，包括天麻素、dactylorhin、militarine、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛、蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖、醋酸、丁二酸、甲酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸，同時(shí)發(fā)現(xiàn)含有飽和脂肪酸類、不飽和脂肪酸類和甾醇類成分，建立的1H-NMR圖譜為手參藥材的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供了新的技術(shù)手段。同時(shí)，結(jié)合主成分分析發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地手參的差異代謝標(biāo)志物主要為天麻素、dactylorhin、militarine、對(duì)羥基苯甲醇、丙氨酸和不飽和脂肪酸，結(jié)果表明GC-1、GC-2、GC-3、GC-4、GC-5、GC-6、GC-7、GC-8、GC-9、GC-10 產(chǎn)地的手參藥材的質(zhì)量更好。

國(guó)內(nèi)外各類研究和本研究均表明，手參藥材的主要活性成分在不同產(chǎn)地的樣品間含量差異較大，不同產(chǎn)地的手參藥材質(zhì)量可能存在較大的差別，但造成這些差別的主要原因尚未被揭示，本研究從海拔梯度來看，不同產(chǎn)地手參的主要代謝產(chǎn)物的含量沒有變化規(guī)律，今后應(yīng)進(jìn)一步深入研究不同產(chǎn)地手參存在差異代謝產(chǎn)物的原因，以促進(jìn)當(dāng)?shù)厥謪①Y源的開發(fā)利用。