王 璐，張 瑤，楊俊換，王艷霞，宋元達(dá)

卷枝毛霉重組菌株Mc-MT-2培養(yǎng)條件優(yōu)化及產(chǎn)油特性

王 璐，張 瑤※，楊俊換，王艷霞，宋元達(dá)

（山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，淄博 255000）

前期工作構(gòu)建了蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因過表達(dá)的卷枝毛霉重組菌株Mc-MT-2，該菌株的脂質(zhì)含量大幅度提高。該研究從培養(yǎng)基成分篩選、微生物生長控制以及發(fā)酵模式等方面深入探討Mc-MT-2菌株發(fā)酵產(chǎn)油脂的調(diào)控策略。結(jié)果表明，Mc-MT-2菌株最佳生長及產(chǎn)孢培養(yǎng)條件是以葡萄糖與蘋果酸為復(fù)合碳源且復(fù)合配比為9∶1，氮源為胰蛋白胨，其他成分同Kendrick培養(yǎng)基，初始pH值為5。經(jīng)分批培養(yǎng)獲得生物量、脂質(zhì)含量和脂質(zhì)產(chǎn)量分別為11.2 g/L，24%和2.6 g/L。在3 L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)中，補(bǔ)料培養(yǎng)Mc-MT-2菌株獲得生物量、脂質(zhì)含量和脂質(zhì)產(chǎn)量最大值為15.4 g/L、28.6%和4.4 g/L，比分批培養(yǎng)分別提高1.38、1.19和1.69倍。該研究為卷枝毛霉重組菌株Mc-MT-2在脂質(zhì)生產(chǎn)中的進(jìn)一步應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

脂質(zhì)；合成；發(fā)酵；卷枝毛霉；蘋果酸

0 引 言

隨著化石資源的日益緊缺，多渠道開發(fā)可再生油脂資源已是大勢所趨。通過微生物轉(zhuǎn)化可再生資源生產(chǎn)油脂，部分替代化石資源，將是可持續(xù)發(fā)展的必然[1-3]。產(chǎn)油微生物是指可以利用適宜營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖并在特定條件下產(chǎn)生和積累大于菌體干質(zhì)量20%的油脂的一類微生物[3-4]。其中，絲狀真菌和藻類可以合成長鏈多不飽和脂肪酸，這些具有生物活性的脂肪酸已經(jīng)被認(rèn)定為重要的營養(yǎng)食源[5-10]。其它的產(chǎn)油微生物，如酵母，合成常見脂肪酸可以轉(zhuǎn)化成生物柴油，是化石能源的重要替代品[11-13]。

產(chǎn)脂真菌卷枝毛霉（）是全球首次商業(yè)化生產(chǎn)微生物油脂的菌株，其生產(chǎn)的油脂富含具有抗癌、抗炎、抗動脈粥樣硬化及降血糖、降血脂等重要生理作用的-6多不飽和脂肪酸-亞麻酸（Gamma-Linolenic Acid，GLA）[14-16]。同時，卷枝毛霉以其成功解析的基因組序列及完善的基因操作體系成為研究真菌脂質(zhì)積累機(jī)制的模式生物[16-19]。為了進(jìn)一步提高脂質(zhì)產(chǎn)量以滿足工業(yè)應(yīng)用的需求，當(dāng)前的研究主要集中在通過調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)代謝途徑或編碼關(guān)鍵代謝酶的基因?qū)Ξa(chǎn)油微生物進(jìn)行遺傳工程改造[20-22]。前期研究中，本課題組提出了一種通過過量表達(dá)線粒體蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Malate Transporter，MT）來增加脂質(zhì)產(chǎn)量的新方法，該轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白負(fù)責(zé)蘋果酸和檸檬酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，并在脂肪酸生物合成中發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果顯示，帶有基因過表達(dá)的卷枝毛霉重組菌株Mc-MT-2，其脂質(zhì)含量比對照菌株提高了70％，表明該菌株可能在脂質(zhì)生產(chǎn)中具有潛在的應(yīng)用前景。

除了菌株本身的特性，生長環(huán)境、發(fā)酵過程控制都影響微生物的脂質(zhì)積累水平[23-25]。本研究從培養(yǎng)基成分的篩選、微生物生長的控制以及發(fā)酵模式等方面深入探討卷枝毛霉重組菌株Mc-MT-2發(fā)酵產(chǎn)油脂的調(diào)控策略，為進(jìn)一步適應(yīng)工業(yè)要求，提高脂質(zhì)產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

卷枝毛霉重組菌株Mc-MT-2（基因過表達(dá)菌株，CCTCC M2015551）為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（改良的Kendrick培養(yǎng)基）[16]：葡萄糖30 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，酒石酸銨3.3 g/L，KH2PO47.0 g/L，Na2HPO42.0 g/L，酵母粉1.5 g/L，CaCl2·2H2O 0.1 g/L，MnSO4·5H2O 1×10-4g/L，Co(NO3)2·6H2O 1×10-4g/L，CuSO4·5H2O 1×10-4g/L，ZnSO4·7H2O 0.001 g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.008 g/L。固體培養(yǎng)基需加入20 g/L瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖與蘋果酸（復(fù)合比9∶1）80 g/L，胰蛋白胨3.85 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO47.0 g/L，Na2HPO42.0 g/L，CaCl2·2H2O 0.1 g/L，MnSO4·5H2O 1×10-4g/L，Co(NO3)2·6H2O 1×10-4g/L，CuSO4·5H2O 1×10-4g/L，ZnSO4·7H2O 0.001 g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.008 g/L。

補(bǔ)料液：葡萄糖 200 g/L。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1）平板培養(yǎng)：取新鮮的濃度為20～30個/L的孢子懸液10L分別接種涂布至不同氮源、碳源或pH值的種子固體培養(yǎng)基上，放置于30 ℃光照下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24、48和65 h取出觀察菌株生長情況。

2）種子培養(yǎng)：將150L卷枝毛霉重組菌株Mc-MT-2的孢子懸浮液（孢子濃度107個/mL）接入裝有150 mL種子培養(yǎng)基的1 L帶擋板的三角瓶內(nèi)，于30 ℃，150 r/min，培養(yǎng)24 h，獲得種子液。

3）發(fā)酵培養(yǎng)：

分批培養(yǎng)：將種子液按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接入1.5 L全自動發(fā)酵罐（裝有1 L葡萄糖與蘋果酸復(fù)合的發(fā)酵培養(yǎng)基）中進(jìn)行培養(yǎng)。發(fā)酵條件設(shè)置為溫度30 ℃，pH值維持5.0，通氣量0.5 L/(L·min)，轉(zhuǎn)速500 r/min，發(fā)酵時間96 h。每隔24 h取樣測定生物量、葡萄糖和NH4+的消耗情況以及脂肪酸含量的變化情況。

補(bǔ)料分批培養(yǎng)：1 L葡萄糖與蘋果酸復(fù)合的發(fā)酵培養(yǎng)基中以體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接入種子液后進(jìn)行分批培養(yǎng)，葡萄糖耗盡后（溶氧陡然上升）每隔24 h添加補(bǔ)料液，并維持葡萄糖濃度為10～15 g/L左右。發(fā)酵條件設(shè)置為溫度30 ℃，pH值維持5.0，通氣量0.5 L/(L·min)，轉(zhuǎn)速500 r/min，發(fā)酵時間120 h。每隔24 h取樣測定生物量、葡萄糖和NH4+的消耗情況以及脂肪酸含量的變化情況。

1.2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化

1）氮源

以改良的Kendrick培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進(jìn)行優(yōu)化，由于酵母提取物中營養(yǎng)成分復(fù)雜，因此去除酵母提取物的干擾，并控制氮含量為0.5 g/L。選擇酵母膏、牛肉膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨和魚粉蛋白胨等有機(jī)氮源5種，添加量分別為6.94、3.85、3.85、5.56、4.17 g/L。選擇酒石酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉和硫酸銨等無機(jī)氮源4種，添加量分別為3.3、3.61、3.04、4.07 g/L。其他組分及添加量不變。

2）碳源

碳源是在上述已獲得最優(yōu)氮源基礎(chǔ)上進(jìn)行的進(jìn)一步優(yōu)化。仍然以改良的Kendrick培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進(jìn)行優(yōu)化，控制碳含量為12 g/L。選擇葡萄糖、蔗糖、淀粉、蘋果酸、檸檬酸、丙酮酸、乙酸鈉等碳源7種，添加量分別為30、28.5、27、33.5、35、29.3、68 g/L。以葡萄糖和蘋果酸為復(fù)合碳源時，按比例1∶1添加。其他組分及添加量不變。

葡萄糖與蘋果酸復(fù)合碳源配比按質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別設(shè)置為1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1，總碳濃度為12 g/L。其他組分及添加量不變。

3）pH值

pH值是在上述已獲得最優(yōu)氮源、最優(yōu)碳源基礎(chǔ)上進(jìn)行的進(jìn)一步優(yōu)化。pH值設(shè)置為3、4、5、6、7、8、9七個梯度按照上述方法對菌株進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 測定方法

1）菌株生長檢測及孢子濃度計數(shù)

培養(yǎng)不同時間下的培養(yǎng)皿選取3個不同方向讀取其菌落生長直徑并計算菌落面積。收集培養(yǎng)皿上的新鮮孢子并對其進(jìn)行計數(shù)，計算求得單位面積下的孢子個數(shù)。每組處理分別進(jìn)行3次重復(fù)。

2）生物量測定

采用差重法測定生物量[16]。具體方法如下：提前稱量好離心管及濾紙質(zhì)量；抽濾收集發(fā)酵后的菌體，過濾后的菌體用蒸餾水反復(fù)清洗后冷凍干燥；凍干好的菌體再次稱量其與離心管和濾紙總質(zhì)量，利用差重法得到細(xì)胞干質(zhì)量。

3）發(fā)酵上清液中葡萄糖和NH4+的測定

采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶（Glucose Oxidase-peroxidase, GOD）法測定葡萄糖含量[16]。反應(yīng)體系為1 mL葡萄糖試劑與適度稀釋標(biāo)準(zhǔn)液或樣品液10L于37 °C水浴10 min，測定505 nm波長下的吸光值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后讀取測定樣品值，并計算出上清液中葡萄糖濃度。

采用靛酚藍(lán)分光光度法測定NH4+的含量[16]。反應(yīng)體系為100L適度稀釋標(biāo)準(zhǔn)液或樣品液先與500L試劑A（10 g/L苯酚，50 mg/L硝普鈉）混勻后加入500L試劑B（5 g/L氫氧化鈉，420 mg/L次氯酸鈉）混勻，55 °C水浴5 min，于酶標(biāo)儀625 nm波長下測定吸光度。繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線后讀取測定樣品中NH4+濃度。

4）脂質(zhì)含量和脂肪酸組成的測定

參考Folch脂質(zhì)提取方法[26]，將適量凍干菌粉于盛有2 mL HCl（4 mol/L）的水解管中充分裂解，在80 °C條件下水浴3～5 h，每隔30 min漩渦震蕩一次。以十五烷酸（C15∶0）為內(nèi)標(biāo)物，使用2 mL氯仿和1 mL甲醇對提取的脂質(zhì)充分混勻15 min后進(jìn)行萃取，然后離心分離，取下層（氯仿層）借助氮?dú)獯蹈?。采用差重法測定總脂質(zhì)含量。加入1 mL鹽酸甲醇（體積分?jǐn)?shù)10%）于60 ℃水浴3 h，將脂類轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯，使用2 mL正己烷和1 mL飽和生理鹽水充分混勻后離心分離保留上層（正己烷層），借助Agilent氣相色譜儀對主要脂肪酸成分及含量進(jìn)行分析，色譜條件參閱文獻(xiàn)[16]。

5）蘋果酸的測定

參照文獻(xiàn)[27]采用高效液相色譜法測定發(fā)酵上清液中蘋果酸的含量，色譜柱為InfintyLab Porshell.120 EC-C18 (4.6 mm×150 mm)，流動相為0.05 mol/L的Na2HPO4(pH值 2.8)，柱溫25 ℃，流速0.5 mL/min，紫外檢測器波長設(shè)定為210 nm。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用三次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)處理，以試驗(yàn)平均值±均值標(biāo)準(zhǔn)誤差（mean±SEM）表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 16.0軟件的Student’s檢驗(yàn)或One-Way ANOVA的Tukey’s檢驗(yàn)。值小于0.05被認(rèn)定為數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮源對Mc-MT-2菌株生長及產(chǎn)孢的影響

微生物生長過程中大分子物質(zhì)的合成及代謝均需要氮源提供營養(yǎng)。早期研究表明，產(chǎn)脂微生物在生長受限的情況下積累脂質(zhì)，通常是以氮源限制的培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物，當(dāng)培養(yǎng)基中氮源耗盡后，大量的碳源被持續(xù)吸收轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)[4,16]。因此本試驗(yàn)控制氮濃度為0.5 g/L，比較培養(yǎng)72 h后不同氮源對卷枝毛霉重組菌株Mc-MT-2生長及產(chǎn)孢的影響，其結(jié)果如圖1所示。從圖1a中看出Mc-MT-2在生長過程中對有機(jī)氮源如酵母膏和蛋白胨等利用較好，而對無機(jī)氮源中的硝酸類氮源利用較低，如在硝酸鉀為唯一氮源的平板上Mc-MT-2沒有得到生長。

圖1b中結(jié)果顯示Mc-MT-2在不同氮源上產(chǎn)孢子情況也存在顯著差異，尤其在有機(jī)氮源中長勢較好。其中胰蛋白胨不僅有利于Mc-MT-2生長，且單位面積的產(chǎn)孢數(shù)量最高，約是對照（酒石酸銨為氮源）的1.8倍。其次是大豆蛋白胨和酵母膏，產(chǎn)孢數(shù)約是對照的1.3～1.4倍。而無機(jī)氮中硝酸氮不僅不利于菌株生長，Mc-MT-2菌株也完全不能利用硝酸鈉和硝酸鉀這兩種氮源產(chǎn)孢。綜合Mc-MT-2菌株的生長和產(chǎn)孢情況，其最優(yōu)氮源為胰蛋白胨。

2.2 碳源對Mc-MT-2菌株生長及產(chǎn)孢的影響

碳源對菌體的生長和代謝至關(guān)重要，碳源不僅作為微生物生長的能量物質(zhì)，構(gòu)成代謝物的碳骨架，還在誘導(dǎo)或抑制酶的合成中起作用[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)一些酵母、霉菌等可以利用蘋果酸等三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物作為唯一碳源或能量物質(zhì)，這些三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物可以滿足某些循環(huán)受限的突變株的需求[28-31]。本試驗(yàn)發(fā)酵菌株Mc-MT-2為蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因過表達(dá)菌株，可能更適于利用三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物作為碳源。本試驗(yàn)控制碳濃度為12 g/L，比較了不同碳源對Mc-MT-2菌株生長及產(chǎn)孢的影響，其結(jié)果如圖2所示。由圖2a可知，Mc-MT-2菌株在以葡萄糖、蔗糖和淀粉為碳源時生長較快。以三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物為唯一碳源時，Mc-MT-2菌株僅能利用蘋果酸或丙酮酸生長，但丙酮酸利用率很低，在以檸檬酸或乙酸鈉為唯一碳源菌株根本無法生長。同樣，圖 2b結(jié)果顯示Mc-MT-2菌株利用不同碳源產(chǎn)孢子情況存在顯著差異，其中菌株以蔗糖和淀粉為碳源時產(chǎn)孢量要低于葡萄糖，而以三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物為唯一碳源培養(yǎng)Mc-MT-2菌株均不能產(chǎn)孢子。由于Mc-MT-2菌株僅能利用蘋果酸，因此本試驗(yàn)以葡萄糖與蘋果酸作為復(fù)合碳源培養(yǎng)Mc-MT-2菌株。由圖2可見，以葡萄糖和蘋果酸為碳源時，蘋果酸的添加促進(jìn)了Mc-MT-2菌株的生長及產(chǎn)孢，其最大產(chǎn)孢量約是對照（葡萄糖為碳源）的1.2倍。

本研究考察了葡萄糖與蘋果酸不同復(fù)合配比對Mc-MT-2菌株生長及產(chǎn)孢的影響，其結(jié)果由圖3所示。由圖3a可以看出，培養(yǎng)24 h后Mc-MT-2菌株的生長速度隨著葡萄糖與蘋果酸復(fù)合比例的加大而逐漸加快，在培養(yǎng)48 h后菌落直徑基本上達(dá)到了最大值。同樣，圖3b顯示Mc-MT-2菌株單位面積的產(chǎn)孢數(shù)量也是隨著葡萄糖與蘋果酸復(fù)合配比的增大而逐漸增多，且菌株以復(fù)合碳源培養(yǎng)要比單一碳源培養(yǎng)產(chǎn)孢子數(shù)目增多。當(dāng)葡萄糖與蘋果酸復(fù)合配比為9∶1時，Mc-MT-2菌株培養(yǎng)65 h后單位面積產(chǎn)孢數(shù)量最大，約為3.1×104個/mm2。綜合Mc-MT-2菌株的生長和產(chǎn)孢情況，其最優(yōu)碳源為葡萄糖與蘋果酸復(fù)合碳源，且復(fù)合配比為9∶1。

2.3 pH值對Mc-MT-2菌落生長及產(chǎn)孢的影響

pH值對細(xì)胞生長以及微生物產(chǎn)孢的作用是舉足輕重的，它不僅可以影響細(xì)胞的通透性，還可以影響培養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，進(jìn)而對菌體吸收營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生影響。研究不同pH值對Mc-MT-2菌株生長及產(chǎn)孢的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4a可以看出，Mc-MT-2菌株培養(yǎng)24 h后生長速度開始加快，且在酸性環(huán)境下的長勢明顯優(yōu)于堿性環(huán)境；當(dāng)培養(yǎng)65 h后Mc-MT-2菌株無論在酸性環(huán)境還是堿性環(huán)境下菌落直徑均達(dá)到最大。圖4b結(jié)果顯示，Mc-MT-2菌株在酸性環(huán)境下的產(chǎn)孢量顯著高于堿性環(huán)境的產(chǎn)孢量。當(dāng)初始pH值為3～5時菌株的產(chǎn)孢量均較高，其中pH值為5時產(chǎn)孢量達(dá)到最大值。當(dāng)pH值大于6時菌株產(chǎn)孢明顯受到抑制作用，其孢子量大大降低。綜合Mc-MT-2菌株的生長和產(chǎn)孢情況，其最優(yōu)pH值為5。此外，綜合Mc-MT-2菌株在氮源、碳源及pH值等發(fā)酵條件優(yōu)化后的產(chǎn)孢量顯著提高，約是初始產(chǎn)孢量的4倍。

2.4 分批培養(yǎng)Mc-MT-2菌株的生長特性

在平板培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，在1.5 L發(fā)酵罐內(nèi)采用最優(yōu)發(fā)酵條件進(jìn)一步對卷枝毛霉重組菌株Mc-MT-2發(fā)酵產(chǎn)油進(jìn)行分批培養(yǎng)，結(jié)果如圖5所示。氮源在12 h左右被消耗殆盡，菌體生物量在細(xì)胞生長平衡期（0～60 h）快速積累，此后生物量（72～96 h）增長較為緩慢。在整個培養(yǎng)過程中，菌株生物量達(dá)到最大值11.2 g/L。

Mc-MT-2菌株對葡萄糖的消耗也較快，在發(fā)酵72 h時培養(yǎng)上清液中的葡萄糖基本已耗盡。對于產(chǎn)油微生物而言，培養(yǎng)基中的碳源耗盡后將會消耗儲存的油脂作為碳源來維持細(xì)胞的生長代謝。然而，本試驗(yàn)中采用了葡萄糖和蘋果酸的復(fù)合碳源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。從圖5中發(fā)現(xiàn)，Mc-MT-2菌株最初優(yōu)先選擇消耗葡萄糖而對蘋果酸利用較少，后期隨著葡萄糖的快速消耗而對蘋果酸利用率增加，但至發(fā)酵結(jié)束蘋果酸并未完全利用，可能是因?yàn)榫陮τ袡C(jī)酸的代謝能力仍然有限。究其蘋果酸的作用一方面可促進(jìn)蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（MT）在檸檬酸/蘋果酸/丙酮酸穿梭中的功能，將乙酰輔酶A從線粒體傳遞到細(xì)胞質(zhì)并驅(qū)動磷酸戊糖途徑提供NADPH，為脂質(zhì)生物合成提供更多的原料如乙酰輔酶A和NADPH[20-22]。這一作用特別是在基因過表達(dá)菌株Mc-MT-2中促進(jìn)脂質(zhì)積累尤為顯著。另一方面添加的蘋果酸還可以作為備用碳源以供菌體的生長代謝所需，而不會消耗儲存的油脂作為碳源[29-31]。

Mc-MT-2菌株在發(fā)酵初期0～12 h時脂質(zhì)積累不明顯，但是當(dāng)培養(yǎng)基中氮源耗盡后開始積累脂質(zhì)。從12～84 h菌株的脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)從7%增長到24%并達(dá)到最大值，而84 h以后脂質(zhì)積累量降低。之前報道表明卷枝毛霉重組菌株Mc-MT-2的最高脂肪酸含量為22%[21-22]，與本研究中的發(fā)酵結(jié)果基本一致。脂質(zhì)產(chǎn)量變化趨勢同脂肪酸含量變化趨勢基本一致，在發(fā)酵84 h時脂質(zhì)產(chǎn)量達(dá)到最大值為2.6 g/L。

Mc-MT-2菌株在發(fā)酵過程中的脂肪酸組成如表1所示。隨著發(fā)酵時間的延長，油酸（C18∶1）的比例逐漸提高，亞油酸和亞麻酸（C18∶2，C18∶3）的比例逐漸降低，說明在脂質(zhì)合成過程中還有大量油酸未能轉(zhuǎn)化為功能性多不飽和脂肪酸。后續(xù)可以進(jìn)一步通過基因工程手段引入或增強(qiáng)脫飽和酶基因的活性來解決這一問題[17-18]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)Mc-MT-2菌株發(fā)酵過程中不產(chǎn)生十四烷酸（C14∶0）和棕櫚油酸（C16∶1），這與以往研究結(jié)果略有不同[20-22]。

表1 分批培養(yǎng)Mc-MT-2菌株過程中的脂肪酸組分

2.5 間歇補(bǔ)料培養(yǎng)Mc-MT-2菌株的生長特性

在分批培養(yǎng)Mc-MT-2菌株發(fā)酵產(chǎn)油的過程中，由于發(fā)酵中后期葡萄糖不能滿足菌體生長和脂質(zhì)積累，所以獲得的菌體生物量和脂質(zhì)產(chǎn)量不高。為進(jìn)一步提高油脂產(chǎn)量，在3 L發(fā)酵罐上進(jìn)行了補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)Mc-MT-2菌株產(chǎn)油的研究。為確定葡萄糖補(bǔ)料濃度對菌株生長及產(chǎn)脂的影響，補(bǔ)料時設(shè)置了3個葡萄糖濃度梯度，分別是維持葡萄糖在10～15、20～25和30～35 g/L，然而發(fā)現(xiàn)其最終獲得的生物量和脂質(zhì)含量的差別不大。這可能是由于發(fā)酵中后期菌體生物量變化較小，而菌體將碳源轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)的能力也有限，所以即使提高補(bǔ)料濃度也沒有增加產(chǎn)脂量。本試驗(yàn)中考慮到發(fā)酵成本因素就選取了補(bǔ)料的葡萄糖濃度控制在10～15 g/L。菌株補(bǔ)料發(fā)酵過程各參數(shù)變化趨勢見圖6所示，在發(fā)酵至48 h時葡萄糖基本耗盡，此時開始補(bǔ)加葡萄糖，每隔24 h補(bǔ)加一次，將葡萄糖濃度控制在10～15 g/L。此條件下，菌體生物量在細(xì)胞生長平衡期（0～48 h）快速積累，此后生物量（48～96 h）增長較為緩慢，發(fā)酵96 h時生物量達(dá)到最大值15.4 g/L，比分批發(fā)酵提高了1.38倍。

由于發(fā)酵中后期補(bǔ)加葡萄糖，后續(xù)可以為菌株的脂質(zhì)積累提供足夠的碳源。培養(yǎng)基中蘋果酸的含量在補(bǔ)料前隨著葡萄糖的消耗速率增加而逐漸減少，而在補(bǔ)料后蘋果酸的消耗逐漸降低。整個發(fā)酵過程中脂質(zhì)含量和脂質(zhì)產(chǎn)量的變化趨勢基本一致，都是在72 h之前隨發(fā)酵時間的延長持續(xù)增加，72 h后增加緩慢，而在96 h后開始降低。當(dāng)發(fā)酵96 h時脂質(zhì)含量和脂質(zhì)產(chǎn)量均達(dá)到最大值，分別為28.6%和4.4 g/L，比分批培養(yǎng)分別提高了1.19和1.69倍。

Mc-MT-2菌株在發(fā)酵過程中的脂肪酸組成如表2所示，其變化趨勢同分批發(fā)酵相似。但是與分批發(fā)酵相比，補(bǔ)糖發(fā)酵后期產(chǎn)生了少量的十四烷酸（C14∶0）和棕櫚油酸（C16∶1），油酸（C18∶1）的比例略有上升而棕櫚酸（C16∶0）的比例略有下降。

表2 間歇補(bǔ)料發(fā)酵Mc-MT-2菌株過程中的脂肪酸組分

3 結(jié) 論

1）Mc-MT-2菌株最佳生長及產(chǎn)孢培養(yǎng)條件是以葡萄糖與蘋果酸為復(fù)合碳源且復(fù)合配比為9∶1，氮源為胰蛋白胨，其他成分同Kendrick培養(yǎng)基，初始pH值為5，30 °C光照培養(yǎng)。經(jīng)條件優(yōu)化下所得產(chǎn)孢量顯著提高，約是初始產(chǎn)孢量的4倍。

2）Mc-MT-2菌株在氮源、碳源及pH值等發(fā)酵條件優(yōu)化后，進(jìn)一步在1.5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批培養(yǎng)。發(fā)酵條件設(shè)置為溫度30 ℃，pH值維持5.0，通氣量0.5 L/(L·min)，轉(zhuǎn)速500 r/min，發(fā)酵時間96 h。最終獲得生物量、脂質(zhì)含量和脂質(zhì)產(chǎn)量分別為11.2 g/L，24%和2.6 g/L。

3）Mc-MT-2菌株在3 L發(fā)酵罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，葡萄糖耗盡后（溶氧陡然上升）每隔24 h添加補(bǔ)料液，并維持葡萄糖濃度為10～15 g/L左右。補(bǔ)料培養(yǎng)獲得生物量、脂質(zhì)含量和脂質(zhì)產(chǎn)量最大值為15.4 g/L、28.6%和4.4 g/L，比分批培養(yǎng)分別提高1.38、1.19和1.69倍。

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Optimization of the culture conditions and lipid production characteristics ofrecombinant strain Mc-MT-2

Wang Lu, Zhang Yao※, Yang Junhuan, Wang Yanxia, Song Yuanda

(,,255000, China)

recombinant strain Mc-MT-2 is generally responsible for the trans-membrane transport of malate and citric acid in lipid synthesis. A preliminary research has been carried out to successfully construct therecombinant strain Mc-MT-2 overexpressing the malate transporter gene. It was found that the strain can be expected to behave potential applications in lipid production, indicating that the lipid content of the strain was 70% higher than that of the control strain. In addition, the lipid accumulation level of microorganisms depends mainly on the strain characteristics, growth environment, and fermentation. In this study, a regulation strategy of the Mc-MT-2 strain was presented to produce the lipid, ranging from the selection of medium composition to microbial growth control and fermentation mode. An investigation was made to clarify the effects of nitrogen/carbon sources and pH values on the growth and sporulation of recombinant strain Mc-MT-2. An optimal condition was achieved for the growth and sporulation culture of the Mc-MT-2 strain, where the compound carbon source of glucose and malate with the compound ratio of 9:1, tryptone as the nitrogen source, other components as same as Kendirck medium, and pH 5. The yield of spores significantly increased under optimized conditions, about 4 times the initial one. A systematic optimization was also performed on the plate culture conditions, such as nitrogen/carbon source, and pH value. A batch cultivation was further carried out in a 1.5 L fermenter to determine the optimal fermentation of recombinant strain Mc-MT-2 in lipid production. The fermentation conditions were set as follows: a temperature of 30°C, pH value of 5.0, aeration of 0.5 L/(L·min), a rotation speed of 500 rpm, and a fermentation time of 96 h. The biomass, lipid content, and yield after batch cultivation reached 11.2 g/L, 24%, and 2.6 g/L, respectively. A fed-batch fermentation culture of the Mc-MT-2 strain was carried out in a 3 L fermenter to further increase the lipid production. The fermentation conditions were set as follows: a temperature of 30°C, pH of 5.0, aeration of 0.5 L/(L·min), a rotation speed of 500 rpm, and a fermentation time of 120 h. The feed solution was added every 24 hours, and the glucose concentration was maintained at about 10-15 g/L, after the glucose was exhausted (the dissolved oxygen rose sharply). The maximum biomass, lipid content, and yield of the Mc-MT-2 strain in the fed-batch culture were 15.4 g/L, 28.6%, and 4.4 g/L, which were improved by 1.38-, 1.19-, and 1.69-fold, respectively, compared with the batch culture. There was an obvious difference in the composition of fatty acid for the Mc-MT-2 strain during fermentation, with a high content of oleic acid (C18: 1), while low contents of linoleic acid and linolenic acid (C18: 2, C18: 3), as well as no or less tetradecanoic acid (C14:0), and palmitic acid (C16:1). This finding can offer a potential theoretical foundation for therecombinant strain Mc-MT-2 to be further applied in the lipid production suitable for industrial requirements.

lipid; synthesis; fermentation; malate;

王璐，張瑤，楊俊換，等. 卷枝毛霉重組菌株Mc-MT-2培養(yǎng)條件優(yōu)化及產(chǎn)油特性[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2021，37(8)：251-258.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.08.029 http://www.tcsae.org

Wang Lu, Zhang Yao, Yang Junhuan, et al. Optimization of the culture conditions and lipid production characteristics ofrecombinant strain Mc-MT-2[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(8): 251-258. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.08.029 http://www.tcsae.org

2020-12-14

2021-03-18

山東省自然科學(xué)基金（ZR2020MC007）；山東省重點(diǎn)研發(fā)計劃項(xiàng)目（2018GSF121013）；山東理工大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新計劃項(xiàng)目

王璐，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。Email：1095280593@qq.com

張瑤，博士，副教授，主要從事食品微生物發(fā)酵與代謝調(diào)控方面的研究工作。Email：zhangyao@sdut.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.08.029

TS264.2

A

1002-6819(2021)-08-0251-08