吳婕, 宮江寧

(1.貴州師范學(xué)院化學(xué)與材料學(xué)院, 貴陽(yáng) 550018; 2.貴州師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院, 貴陽(yáng) 550001)

近年來(lái)，人工合成藥物的不安全性逐漸被人們認(rèn)識(shí)，尋求無(wú)毒副作用的降血糖和抗自由基氧化的藥食同源植物是食品和醫(yī)藥界研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。甜茶(RubussuavissimusS. Lee)是藥食同源植物[1]，也是我國(guó)重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)型作物。甜茶屬于薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(RubusL.)植物。甜茶富含氨基酸、微量元素、黃酮類化合物和多酚類化合物等[2]，具有降血糖[3-4]、抗氧化[5]、抗癌和降血壓[6]的藥理功能。

目前，甜茶的降血糖和抗氧化作用機(jī)制在細(xì)胞[7-8]、動(dòng)物[9-11]和臨床[12]等實(shí)驗(yàn)中得到了進(jìn)一步明晰，但尚未見(jiàn)有關(guān)不同溶劑萃取大孔樹(shù)脂純化的甜茶多酚對(duì) α-葡萄糖苷酶活性和DPPH·自由基的研究。本研究根據(jù)大孔樹(shù)脂對(duì)甜茶多酚的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)的吸附-解吸性能試驗(yàn)，優(yōu)化出HPD-826樹(shù)脂分離純化甜茶多酚的工藝參數(shù)；分析了HPD-826樹(shù)脂純化甜茶多酚以及其萃取物抑制α-葡萄糖苷酶活性和清除DPPH·自由基的效果，找出適合開(kāi)發(fā)成為ɑ-葡萄糖苷酶抑制劑和抗自由基氧化的抗氧化劑的萃取相，為提高農(nóng)產(chǎn)品甜茶的經(jīng)濟(jì)價(jià)值貢獻(xiàn)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甜茶，購(gòu)于貴州省健康茶科技有限公司；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于百倫斯生物技術(shù)公司；HPD-826樹(shù)脂，購(gòu)于鄭州和成新材料科技有限公司；LSA-21樹(shù)脂，購(gòu)于和成新材料工廠；D101樹(shù)脂和AB-8樹(shù)脂，購(gòu)于滄州寶恩吸附材料科技有限公司。α-葡糖糖苷酶(α-glucosidases)，Sigma-Aldrich Company生產(chǎn)；4-硝基苯酚-α-D 吡喃葡萄糖苷(PNPG), Sigma-Aldrich Company生產(chǎn)；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉和鹽酸等均為分析純。

UV-2300紫外分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；KL04A型離心機(jī)，湖南凱達(dá)公司生產(chǎn)；JL2002型電子天平，淮安金良電子科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 大孔樹(shù)脂的活化處理

將4種大孔樹(shù)脂(HPD-826、LSA-21、D101、AB-8)在5% NaOH溶液中浸泡4 h，洗去堿溶性雜質(zhì)至中性；在5% HCl溶液中浸泡4 h，洗去酸溶性雜質(zhì)至中性；用無(wú)水乙醇浸泡4 h，洗去醇溶性雜質(zhì)。大孔樹(shù)脂活化后備用。

1.3 大孔樹(shù)脂的篩選

向活化好的4種2.0 g樹(shù)脂中加入甜茶多酚粗制溶液(100 mL，0.62 mg·mL-1)，振蕩吸附24 h，測(cè)定大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附后的甜茶多酚質(zhì)量濃度。用100 mL無(wú)水乙醇對(duì)吸附飽和的大孔樹(shù)脂振蕩解吸24 h，測(cè)定大孔樹(shù)脂靜態(tài)解吸后的甜茶多酚質(zhì)量濃度。

本研究中大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，計(jì)算公式如下。

吸附量A=(CⅠ-CⅡ)×VⅠ/MⅠ

(1)

吸附率B=(CⅠ-CⅡ)×100/CⅠ

(2)

解吸率C=CⅢ×VⅡ×100/(CⅠ-CⅡ)×VⅠ

(3)

純度D=CⅢ×VⅡ×100/MⅡ

(4)

式中,A為大孔樹(shù)脂對(duì)甜茶多酚的吸附量，mg·g-1；B為大孔樹(shù)脂對(duì)甜茶多酚的吸附率，%；C為大孔樹(shù)脂對(duì)甜茶多酚的解吸率，%；D為甜茶多酚純度，%；CⅠ、CⅡ、CⅢ分別為初始、吸附后和解吸出的甜茶多酚質(zhì)量濃度，mg·mL-1；VⅠ、VⅡ分別為粗制樣品體積和洗脫劑乙醇體積，mL；MⅠ為大孔樹(shù)脂的質(zhì)量，mg；MⅡ?yàn)榻?jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂純化后甜茶的質(zhì)量，mg。

1.4 HPD-826樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附-解吸甜茶多酚的研究

將20 mL活化的HPD-826樹(shù)脂裝入層析柱中，分析上樣液的質(zhì)量濃度、體積和上樣流速對(duì)HPD-826樹(shù)脂吸附率的影響；探討洗脫劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)、洗脫體積和洗脫流速對(duì)HPD-826樹(shù)脂解吸率的影響。找到HPD-826樹(shù)脂純化甜茶多酚的最佳工藝條件。

1.4.1上樣液質(zhì)量濃度的優(yōu)化 分別將100 mL上樣液(質(zhì)量濃度1.0、2.0、3.0和4.0 mg·mL-1)以2 BV·h-1流速加入HPD-826樹(shù)脂柱中，測(cè)定流出液中甜茶多酚質(zhì)量濃度，得到HPD-826樹(shù)脂的吸附率。

1.4.2上樣流速和上樣體積數(shù)的優(yōu)化 將上樣液(100 mL，2.0 mg·mL-1)以不同上樣流速(2和3 BV·h-1)加入到HPD-826樹(shù)脂柱中，測(cè)定流出液甜茶多酚的質(zhì)量濃度，得到適宜的上樣流速和上樣體積數(shù)。

1.4.3洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化 分別將250 mL不同體積分?jǐn)?shù)(30%、40%、50%、60%和70%)乙醇洗脫液，以2 BV·h-1流速，洗脫飽和HPD-826樹(shù)脂柱，測(cè)定流出液甜茶多酚的質(zhì)量濃度，得出HPD-826樹(shù)脂的解吸率。

1.5 α-葡萄糖苷酶抑制劑反應(yīng)體系的篩選

以降低餐后血糖的常見(jiàn)口服降血糖藥阿卡波糖為參照[13-14]，將HPD-826樹(shù)脂純化樣品濃縮，分別用乙酸乙酯和三氯甲烷進(jìn)行萃取，得到乙酸乙酯相萃取物和三氯甲烷相萃取物，測(cè)定其α-葡萄糖苷酶抑制率。

參照吳婕等[14]的方法，將α-葡萄糖苷酶(0.2 mL，0.5 U·mL-1)加入到0.2 mL 樣液中，放置在恒溫(37 ℃)水浴鍋中反應(yīng)(15 min)，在反應(yīng)混合溶液中加入PNPG(0.1 mL，5 mmoL·L-1) ，繼續(xù)反應(yīng) 20 min；加入Na2CO3溶液(1.4 L，0.2 moL·L-1)；磷酸鉀緩沖溶液(0.1 mmoL·L-1，pH 6.8)定容10 mL。平行試驗(yàn)3 次，在402 nm處測(cè)定硝基苯的吸光度值，結(jié)果取平均值。抑制率計(jì)算公式如下。

抑制率Q=[Q空白-(Q樣品-Q背景)]×100%/Q空白

(5)

式中，Q為甜茶多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率；Q樣品為待測(cè)體系的吸光度；Q空白為不加樣液體系的吸光度；Q背景為不加酶體系的吸光度。

1.6 甜茶多酚抗氧化性研究

配制成不同質(zhì)量濃度的甜茶多酚樣品，以常見(jiàn)的抗氧化劑Vc為參比，測(cè)其吸光度，計(jì)算DPPH·清除率。參照崔紫姣[15]的方法，以乙醇(分析純)作為參比，將甜茶多酚樣品放置于暗處30 min，在515 nm處，測(cè)其吸光度。加入DPPH·溶液(1.6 mL，0.2 mg·mL-1)，測(cè)定吸光度(Z0)；移取1.0 mL甜茶多酚樣品，測(cè)定吸光度(Z1)；測(cè)定混合液(1.0 mL甜茶多酚樣品+1.6 mL DPPH·溶液)的吸光度(Z2)。DPPH·清除率(Z)的計(jì)算公式如下。

DPPH·清除率Z=[1+(Z1-Z2)/Z0]×100%

(6)

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用LSD法進(jìn)行多重比較。采用Origin 11.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹(shù)脂吸附-解吸甜茶多酚的效果

由表1可知，不同型號(hào)大孔樹(shù)脂對(duì)甜茶多酚吸附-解吸能力差異較大，由于HPD-826樹(shù)脂對(duì)甜茶多酚的吸附是通過(guò)氫鍵作用，具有最高的平均吸附率(28.1%) 和平均解吸率(99.5%)，故HPD-826樹(shù)脂最適合用于純化甜茶多酚。

表1 4種大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附-解吸結(jié)果Table 1 Static adsorption and desorption capacity results of four macroporous resins

2.2 HPD-826樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附-解吸甜茶多酚的優(yōu)化工藝條件

2.2.1上樣液質(zhì)量濃度 由圖1可知，隨著上樣液質(zhì)量濃度增加，HPD-826樹(shù)脂對(duì)甜茶多酚的吸附率表現(xiàn)出先增加后減小的趨勢(shì)。當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL-1時(shí)， HPD-826樹(shù)脂對(duì)甜茶多酚的平均吸附率最大(92.9%)，因此，最佳上樣液質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL-1。

圖1 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響Fig.1 Effect of sample mass concentration on the adsorption rate

2.2.2上樣流速 當(dāng)大孔樹(shù)脂吸收后的流出液質(zhì)量濃度為上樣液質(zhì)量濃度的10%時(shí)，即達(dá)到大孔樹(shù)脂滲漏點(diǎn)[16]。如圖2所示，當(dāng)上樣流速為2和3 BV·h-1時(shí)，HPD-826樹(shù)脂的滲漏點(diǎn)對(duì)應(yīng)的累計(jì)上樣體積分別在60和50 mL。綜合考慮，應(yīng)選擇50 mL上樣液和2 BV·h-1流速為宜。

圖2 上樣流速對(duì)吸附效果的影響Fig.2 Effect of sample flow rate on the adsorption efficiency

2.2.3洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù) 圖3顯示，洗脫液體積分?jǐn)?shù)從30%增加到70%時(shí)，HPD-826樹(shù)脂對(duì)甜茶多酚的解吸率有先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，HPD-826樹(shù)脂對(duì)甜茶多酚的解吸率達(dá)到最大值73.1%。因此，本研究中洗脫劑乙醇的最佳體積分?jǐn)?shù)為60%。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on desorption rate

2.3 不同極性溶劑萃取物對(duì)ɑ-葡萄糖苷酶的抑制率

ɑ-葡萄糖苷酶抑制劑可以抑制人體ɑ-葡萄糖苷酶的活性，降低餐后血糖值[14]。如圖4 所示，甜茶多酚在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其不同極性溶劑萃取物與 ɑ-葡萄糖苷酶的抑制率呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系(R2=0.92～0.98)。若甜茶多酚質(zhì)量濃度相同時(shí)，其不同極性溶劑萃取物對(duì) ɑ-葡萄糖苷酶的抑制率差異較大，其強(qiáng)弱順序依次是：乙酸乙酯相萃取物 > HPD-826樹(shù)脂純化樣品 > 阿卡波糖 > 粗制樣品 > 三氯甲烷相萃取物。乙酸乙酯相萃取物、HPD-826樹(shù)脂純化樣品、阿卡波糖、粗制樣品、三氯甲烷相萃取物分別對(duì) ɑ-葡萄糖苷酶抑制作用的半數(shù)抑制濃度(IC50)值分別為0.183、1.328、0.379、2.109和79.676 mg·mL-1。由此可見(jiàn)，乙酸乙酯相萃取物和HPD-826樹(shù)脂純化樣品對(duì)ɑ-葡萄糖苷酶的活性抑制率均優(yōu)于參照物阿卡波糖，其中乙酸乙酯相萃取物最適合開(kāi)發(fā)成為醫(yī)藥ɑ-葡萄糖苷酶抑制劑。

圖4 不同極性溶劑萃取物對(duì) α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.4 Inhibition rate of α-glucosidase by different polarity solvent extracts

2.4 甜茶多酚對(duì)DPPH·的抗氧化性

圖5結(jié)果表明，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，粗制樣品、三氯甲烷相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、參照物Vc與HPD-826樹(shù)脂純化樣品具有抗氧化性，均能有效的清除DPPH·。乙酸乙酯相萃取物、參照物Vc、HPD-826樹(shù)脂純化樣品、粗制樣品和三氯甲烷相萃取物對(duì)DPPH·的半數(shù)抑制濃度IC50值分別為0.060、0.385、0.553、0.729和0.868 mg·mL-1。由此可見(jiàn)，乙酸乙酯相萃取物對(duì)DPPH·抗氧化效果最好，適合開(kāi)發(fā)成抗氧化劑。

圖5 不同樣品的DPPH·清除率Fig.5 DPPH· scavenging rate of different samples

3 討論

3.1 甜茶多酚的純化工藝研究

植物多酚是分子中具有多個(gè)羥基的酚類總稱，主要存在于植物的葉和皮中。目前，提取植物多酚可采用溶劑提取法、超聲提取法、微波浸提法和大孔樹(shù)脂純化法等；大孔樹(shù)脂純化法具有選擇性好、效率高和能耗低等特點(diǎn)[17]。

大孔樹(shù)脂是三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高聚物，它對(duì)甜茶多酚的吸附-解吸是相互競(jìng)爭(zhēng)的過(guò)程，改變上樣質(zhì)量濃度、上樣速率和洗脫液的體積分?jǐn)?shù)等參數(shù)，將影響大孔樹(shù)脂的吸附-解吸效果。崔紫姣[15]研究出HPD-100樹(shù)脂純化甜茶粗制樣品的最佳上樣液工藝條件(pH 4.0，2.5～5.0 mg·mL-1，2 BV·h-1)，洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)30%，得到甜茶多酚純度為63%；林繼元[18]研究 DM-301 樹(shù)脂純化甜茶粗制樣品的最佳上樣液參數(shù)(pH 5.5，2 mg·mL-1，1.2 BV·h-1)，洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)70%， 甜茶多酚得率為72.1%。

本研究以甜茶多酚為研究對(duì)象，對(duì)HPD-826、D101、LSA-21和AB-8樹(shù)脂進(jìn)行靜態(tài)吸附-解吸性能的試驗(yàn)， HPD-826樹(shù)脂對(duì)甜茶多酚表現(xiàn)出最好的吸附和解吸性能，其平均吸附率和平均解吸率分別為28.1%和 99.5%，因此HPD-826樹(shù)脂最適合分離純化甜茶多酚。HPD-826樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)結(jié)果表明，在相同流速下，隨著上樣液質(zhì)量濃度的增加，HPD-826樹(shù)脂對(duì)甜茶多酚的吸附率呈現(xiàn)減小趨勢(shì)。這主要是由于甜茶多酚上樣液的質(zhì)量濃度越高，單位體積內(nèi)多酚類化合物的分子數(shù)多，多酚類化合物與HPD-826樹(shù)脂的接觸量越大，傳質(zhì)速率降低；同時(shí)單位體積內(nèi)增加的雜質(zhì)量會(huì)與多酚類化合物形成競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致HPD-826樹(shù)脂對(duì)多酚化合物吸附率降低。若選擇上樣液質(zhì)量濃度2.0 mg·mL-1，其平均吸附率達(dá)到最大值92.9%。上樣流速是影響HPD-826樹(shù)脂吸附甜茶多酚的重要因素之一；當(dāng)上樣流速為2和3 BV·h-1時(shí)，HPD-826樹(shù)脂對(duì)應(yīng)的累計(jì)上樣體積分別為60和50 mL，此時(shí)出現(xiàn)滲漏點(diǎn)。考慮工業(yè)生產(chǎn)效率，選擇50 mL上樣液和2 BV·h-1流速為宜。HPD-826樹(shù)脂對(duì)甜茶多酚的解吸率會(huì)隨著洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加表現(xiàn)出先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，HPD-826樹(shù)脂對(duì)甜茶多酚解吸率可以達(dá)到最大值73.1%。因?yàn)楫?dāng)洗脫劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，它對(duì)甜茶多酚的洗脫不完全，得到的解吸率較低；當(dāng)洗脫劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)較高時(shí)，其極性反而降低，溶出的極性較小的醇溶性雜質(zhì)會(huì)與甜茶多酚類化合物形成競(jìng)爭(zhēng)，降低甜茶多酚類化合物與乙醇-水分子結(jié)合的可能性，導(dǎo)致其解吸率降低[17-18]。綜上所述， HPD-826樹(shù)脂優(yōu)化的動(dòng)態(tài)工藝參數(shù)：上樣液質(zhì)量濃度、上樣液體積和上樣流速分別為2.0 mg·mL-1、50 mL和2 BV·h-1；洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)、洗脫液體積、洗脫流速分別為60%、250 mL和 2 BV·h-1。在此優(yōu)化條件下，甜茶多酚的平均純度可以達(dá)到81.2%。

3.2 甜茶多酚不同萃取物對(duì) α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

α-葡萄糖苷酶抑制劑可以和人體小腸的α-葡萄糖苷酶的中心活性部位結(jié)合，阻止餐后高血糖[16]。許多流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，飲茶能夠降低血糖的水平和降低患糖尿病風(fēng)險(xiǎn)，具有α-葡萄糖苷酶抑制劑的作用。Wu等[19]探討了綠茶提取物在雄性 SD大鼠中對(duì)糖耐量的影響，發(fā)現(xiàn)綠茶水溶性成分可以提高胰島素活力，具有明顯的降血糖功效。Sabu等[20]研究表明，綠茶多酚能夠抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，具有清除氧自由基和羥自由基等能力，降改善肝腎功能和低血糖水平，改善糖尿病病情。

不同極性溶劑萃取的甜茶多酚，其多酚類化合物結(jié)構(gòu)差異較大，降糖效果也不同。本研究結(jié)果表明，在一定甜茶多酚質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(0.1～0.9 mg·mL-1)，阿卡波糖、乙酸乙酯相、HPD-826樹(shù)脂純化樣品和粗制樣品對(duì)ɑ-葡萄糖苷酶都有較好的抑制效果, 呈現(xiàn)出良好的“劑量-效率”正相關(guān)關(guān)系；當(dāng)甜茶多酚質(zhì)量濃度相同時(shí)，乙酸乙酯相和HPD-826樹(shù)脂純化樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用均優(yōu)于參照物阿卡波糖，乙酸乙酯相萃取物對(duì)應(yīng)的抑制率最高，這主要是由于乙酸乙酯相富集了最多的抑制α-葡萄糖苷酶的茶多酚。因此，經(jīng)過(guò)HPD-826樹(shù)脂純化的甜茶多酚乙酸乙酯萃取物具有開(kāi)發(fā)成α-葡萄糖苷酶天然抑制劑的巨大潛力，后續(xù)的工作重點(diǎn)將對(duì)乙酸乙酯萃取物中的單體進(jìn)行分離和分析，明確結(jié)構(gòu)和藥效的關(guān)系。

3.3 甜茶多酚不同萃取物對(duì)DPPH·的抗氧化性研究

天然植物的活性提取物的體外抗氧化能力檢測(cè)通常使用DPPH·清除率檢測(cè)法[14]。HPD-826樹(shù)脂純化樣品、粗制樣品、三氯甲烷相萃取物和乙酸乙酯相萃取物對(duì)DPPH·均有較好的清除能力，其強(qiáng)弱順序?yàn)椋阂宜嵋阴ハ噍腿∥?> 參照物Vc> HPD-826樹(shù)脂純化樣品> 粗制樣品 >三氯甲烷相萃取物。在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，DPPH·清除率均隨著三氯甲烷相萃取物、粗制樣品、HPD-826樹(shù)脂純化樣品和乙酸乙酯相萃取的質(zhì)量濃度增加而提高，其中DPPH·清除率對(duì)乙酸乙酯相萃取物質(zhì)量濃度的響應(yīng)最靈敏(IC50值僅為0.06 mg·mL-1)。因此，經(jīng)過(guò)HPD-826樹(shù)脂純化的甜茶多酚乙酸乙酯萃取物具有開(kāi)發(fā)成天然抗氧化劑的巨大潛力，拓寬甜茶深加工領(lǐng)域，推動(dòng)甜茶區(qū)經(jīng)濟(jì)持續(xù)快速的發(fā)展。