于書娟 劉洪臣

由于頜骨作為全身骨骼的一部分,在很多方面是相似的,有研究表明，全身骨的骨量減少與頜骨的骨量減少非常相似，并且有一定的相關(guān)性[1-3]，所以很多學(xué)者在頜骨的骨量減少的防治上使用全身骨質(zhì)疏松癥的治療藥物。依普黃酮（ipriflavone，IP）是人工合成的異黃酮，已被報道能增加骨質(zhì)疏松患者的骨密度[4]并具有抗氧化特性[5]，其雖然具有雌激素的作用，但對子宮內(nèi)膜和乳腺的刺激作用小于雌激素[6，7]，作為骨質(zhì)疏松癥藥物在臨床已經(jīng)應(yīng)用多年，并且引起口腔醫(yī)學(xué)者的關(guān)注。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)依普黃酮可以促進牙周膜細胞的體外增殖和成骨分化，促進牙齒移動后的牙周組織的重組，預(yù)防正畸后的復(fù)發(fā)[8]。也有學(xué)者的研究結(jié)果提示依普黃酮可以增加頜骨的骨密度[9],從而對頜骨的骨質(zhì)疏松有一定的防治效果。本實驗通過研究依普黃酮對骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細胞的線粒體相關(guān)因子解偶聯(lián)蛋白2（uncoupling protein 2，UCP2）、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的影響，為依普黃酮應(yīng)用于口腔頜骨骨質(zhì)疏松防治的研究提供理論基礎(chǔ)，并且初步探索其分子作用機制。

1.材料和方法

1.1 主要試劑和設(shè)備 依普黃酮（Sigma，美國），杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）（Gibco，美國),胰蛋白酶（Amresco，美國），新生牛血清（四季青，杭州），胎牛血清（Gibco，美國)，培養(yǎng)細胞總RNA 提取試劑盒（TIANGEN，北京），逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒（TIANGEN，北京），SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（BOSTER，武漢），總蛋白抽提試劑盒（BOSTER，武漢），辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（Santa，美國），兔抗鼠UCP2 單克隆抗體（BOSTER，武漢）。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

雙能X 線骨密度儀（Lunar，美國），ELx800uv全自動酶標(biāo)儀（Bio-Tek，美國），倒置相差顯微鏡（Leica,德國),紫外分光光度計（Beckman-DU640，美國）,多功能熒光分析儀（FLUOstar Omega，BMG LABTECH，德國），TDZS-WS 型多管架自動平衡高速離心機（湘儀公司，長沙），低溫高速離心機（Eppendorf，德國），ST-Ⅰ型半干式轉(zhuǎn)移電泳槽（競邁生物，大連）。

1.2 動物來源20 只SD 大鼠（雌性，12 周齡，約300g）在實驗動物房中進行適應(yīng)性喂養(yǎng)，觀察一周，大鼠均健康。

1.3 骨質(zhì)疏松大鼠動物模型的建立 實驗大鼠被隨機平均分為兩組[去勢組（n=10）和假手術(shù)組（n=10）]。麻醉后取仰臥位，正中切開腹部，去勢組對雙側(cè)卵巢結(jié)扎切除，假手術(shù)組對雙側(cè)卵巢附近的與卵巢大小相似的小塊脂肪切除，嚴密縫合腹部傷口，術(shù)中注意無菌操作，術(shù)后注射抗生素防止感染。大鼠在術(shù)后12 周時，通過綜合分析評價，成功建立骨質(zhì)疏松動物模型[10]。

1.4 骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細胞的培養(yǎng)和傳代 全麻下處死已建立骨質(zhì)疏松模型的大鼠，無菌條件下取出下頜骨，去除頜骨上的肌肉和筋膜，完整的拔除頜骨上的牙齒，運用課題組人員熟練使用的成骨細胞培養(yǎng)方法，即組織塊法和酶消法共同培養(yǎng)的方法[10，11]。首先，在無菌器皿中用無菌剪刀將下頜骨，剪成約2mm 直徑大小的骨片，倒入0.125%胰蛋白酶將骨片完全覆蓋，約8min 后，將首次消化的液體倒掉。再用胰蛋白酶連續(xù)消化骨片5次，依次收集，高速離心，將離心管中上清液棄去，管底部細胞重懸后接種到培養(yǎng)瓶中。然后胰蛋白酶消化后留下的骨片加入培養(yǎng)基，繼續(xù)用無菌剪刀將骨片剪成約1mm 直徑大小，倒入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。待成骨細胞長滿全瓶后傳代。

當(dāng)培養(yǎng)的成骨細胞在培養(yǎng)瓶中達到約80%的融合率時，換成不含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h,以使得細胞達到同步化，然后將細胞分成依普黃酮組和對照組，分別采用含10-8M 依普黃酮[12]的培養(yǎng)基和不含依普黃酮的培養(yǎng)基培養(yǎng)成骨細胞72h。然后進行ATP含量檢測、ROS含量檢測、UCP2的RT-PCR基因檢測和UCP2 的western blot 蛋白檢測。

1.5 成骨細胞的ATP 含量檢測 將成骨細胞以3×105細胞/ml 接種于5個6 孔板，用無血清培養(yǎng)基同步化，每個6 孔板中3個孔使用藥物干預(yù)，3個孔用作對照。藥物干預(yù)72h 后。使用ATP 檢測試劑盒（Beyotime，中國）中提供的試劑，溶解成骨細胞10min。溶解后，混合物在12000g 和4oC下離心10min。將ATP 檢測工作液在不透明的96孔板中孵育5min，以減少ATP 的背景。然后將離心后的成骨細胞上清液轉(zhuǎn)移到96 孔板中2s，立即用多功能熒光分析儀（FLUOstar Omega，BMG LABTECH，德國）在562nm 波長下測量化學(xué)發(fā)光（熒光素酶催化熒光素產(chǎn)生熒光）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出ATP 濃度。

1.6 成骨細胞的ROS 含量檢測 將成骨細胞以1×106細胞/ml 的密度接種于5個6 孔板，每個6 孔板中3個孔使用藥物干預(yù)，3個孔用作對照。細胞同步化和藥物干預(yù)培養(yǎng)后，用PBS 洗滌細胞兩次，并將用無血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA 探針（1∶1000 稀釋）添加到培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)細胞20min 后，用無血清培養(yǎng)基連續(xù)洗滌3次，用于去除多余的DCFH-DA，然后以800 轉(zhuǎn)/分離心6min。用PBS 洗滌細胞并在0.3ml PBS 中重新懸浮，將0.2ml 含有細胞的懸浮液轉(zhuǎn)移到96 孔板中，用多功能熒光光分析儀（FLUOstar Omega，BMG LABTECH，德國）測量熒光（488nm 的激發(fā)/波長，525nm 的散發(fā)波長）。通過減去自身熒光背景校正，最終獲得成骨細胞的ROS 含量。

1.7 RT-PCR 將成骨細胞以1×105細胞/ml接種于3個12 孔板，每個12 孔板中6個孔使用藥物干預(yù)，6個孔用作對照。培養(yǎng)72h 后，用PBS 連續(xù)沖洗三次，用總RNA 提取試劑盒抽提成骨細胞的總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)式試劑盒反轉(zhuǎn)錄1.5μg 的mRNA 為cDNA，進行PCR。引物的合成通過專業(yè)生物技術(shù)公司（上海英俊公司，中國）完成，見表1。

表1 用于RT?PCR的基因引物

每個25μl 的PCR 反應(yīng)體系包括1.5μl 的cDNA，0.5μl 的dNTPs（10mM），2.5μl 的10×PCR 緩沖液，0.5μl 的β-肌動蛋白f（25pmol/ul），0.5μl 的β-肌動蛋白r（25pmol/ul），0.5μl的Taq 酶（2u/ul）和ddH2O（補足至25μl）。設(shè)置循環(huán)參數(shù)，在94℃預(yù)變性2min，再按94℃/30s、63℃/30s 和72℃/30s 擴增30個循環(huán)。然后用瓊脂糖凝膠電泳30min，獲得圖像，用Labworks 4.0 圖像采集分析軟件（PerkinElmer，Waltham，Massachusetts，USA）對各條帶積分光密度值（IOD）進行分析，以目標(biāo)基因與GADPH 基因的IOD 值之比作為目標(biāo)基因表達水平，每一個樣品分析三次。

1.8 Western Blotting 將成骨細胞以1×105細胞/ml接種于3個12孔板，每個12孔板中6個孔使用藥物干預(yù)，6個孔用作對照。藥物干預(yù)培養(yǎng)72h后，將待檢測的成骨細胞用PBS洗滌三次后加入細胞裂解液，冰上輕搖晃15min。刮取各孔的成骨細胞并且收集于1.5ml試管中，在12000g下4℃離心15min，上清液經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后分裝。含有等量蛋白質(zhì)（30μg）的成骨細胞上清液，用、SDS-PAGE 分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。轉(zhuǎn)移后，用40ml的0.1%Tris緩沖鹽水吐溫（Tris-Buffered Saline Tween-20，TBST）洗滌緩沖液（含5%脫脂乳，pH值7.4）并在4℃下過夜封閉，加入稀釋度1∶300的兔抗鼠UCP2抗體（BOSTER，武漢），稀釋度1∶2000的β-肌動蛋白，在37℃下孵育2h后，洗滌膜三次后，加入稀釋度1∶2000的辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（Santa，美國），繼續(xù)37℃下孵育1h，滴加化學(xué)發(fā)光試劑，X光片盒中曝光。通過Quantity One軟件分析得出結(jié)果。以β-肌動蛋白的百分比表示成骨細胞的UCP2蛋白表達。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計軟件SPSS 25.0進行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示，對于依普黃酮組和對照組之間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗，P<0.05認為兩組間有顯著性差異。

2.結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下成骨細胞的形態(tài)觀察 骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細胞的形態(tài)如圖1 所示，多呈長梭形、三角形或多角形等多種形態(tài)，有多個長或短突起，與相鄰的細胞連接；細胞核呈圓形或橢圓形，居于細胞中間或略偏向一側(cè)，可看到明顯的一個或兩個核仁；在細胞重疊生長的區(qū)域，可見緊靠的多個細胞核。

圖1 骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細胞（×200）

2.2 成骨細胞ATP 含量檢測的結(jié)果 骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細胞ATP 含量的熒光檢測結(jié)果如圖2 所示，依普黃酮組（15.3±1.31μmol/g）明顯高于對照組（9.9±0.78μmol/g），并且這種差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01)。

圖2 成骨細胞ATP水平的檢測結(jié)果（*代表P<0.05）

2.3 成骨細胞的ROS含量檢測結(jié)果 檢測實驗組和對照組成骨細胞ROS 含量的結(jié)果顯示（如圖3），依普黃酮組（276±20）明顯低于對照組（427±35），有高度顯著性差異（P<0.01)。

圖3 成骨細胞ROS含量的檢測結(jié)果（*代表P<0.05）

2.4 成骨細胞UCP2 的mRNA 基因表達水平圖4 顯示的是成骨細胞UCP2 的mRNA 基因表達情況，與對照組（0.68±0.05）相比，依普黃酮組（0.84±0.08）出現(xiàn)了顯著的升高，P<0.05。

圖4 成骨細胞UCP2的mRNA的基因表達水平（*代表P<0.05）

2.5 成骨細胞UCP2 的蛋白表達水平UCP2蛋白檢測結(jié)果顯示，依普黃酮組較高（0.51±0.04），對照組較低（0.39±0.03），兩組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)上的意義（P<0.05），見圖5。

圖5 成骨細胞UCP2蛋白水平表達的檢測結(jié)果（*代表P<0.05）

3.討論

近年來，人們越來越關(guān)注骨質(zhì)疏松癥對口腔醫(yī)學(xué)的影響，如種植體植入后的骨整合，拔牙后牙槽骨的骨吸收，或牙周炎的骨改變等[13-16]。依普黃酮作為一種有效的防治骨質(zhì)疏松的藥物，在多個國家得到了廣泛的應(yīng)用。其不但可以抑制骨吸收，并且具有雌激素和降鈣素的作用。依普黃酮可能在GPER1 的p38MAPK 信號通路途徑中發(fā)揮重要的作用[17]。因此，依普黃酮對頜骨以及口腔疾病的影響也越來越受到學(xué)者的關(guān)注，對于其相關(guān)的分子機制研究也成為熱點。有研究表明依普黃酮可以增加牙周膜干細胞的成骨分化，并且GPR30 介導(dǎo)的PI3K/Akt 通路在其中起著重要的作用[8]。p38MAPK 通路和PI3K/Akt 通路均能通過磷酸化某些因子調(diào)控著細胞的增殖和凋亡。而磷酸化的過程是在線粒體中完成的。在本研究中，通過體外培養(yǎng)骨質(zhì)疏松大鼠下頜骨成骨細胞，研究依普黃酮對成骨細胞的線粒體相關(guān)細胞因子的影響，也為口腔醫(yī)學(xué)的進一步研究提供了一定的研究思路。

線粒體是一種重要的細胞器，為細胞功能活動提供能量，有“電力站”之稱，同時，它也是有氧呼吸的重要場所，與ATP 和ROS 的生成直接相關(guān)。而UCP2 作為線粒體內(nèi)膜上的質(zhì)子轉(zhuǎn)運蛋白，使質(zhì)子通過直接滲漏回線粒體基質(zhì)的方式，部分解偶聯(lián)氧化磷酸化，使得ATP的產(chǎn)生出現(xiàn)減少的情況[18，19]；同時，UCP2 通過減少呼吸鏈電子漏的發(fā)生和降低線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的電化學(xué)梯度，能減少ROS 的產(chǎn)生。對于ATP 來說，Megha Rajendran 等認為，ATP 不僅是細胞進行各種功能活動能量的直接來源，也是生物體內(nèi)外新陳代謝和信號傳導(dǎo)的中心分子[20]。Lukas Jaroslaw 等研究報道UCP2 通過調(diào)控ATP 的濃度起到調(diào)控細胞鈣的攝取[21]；而鈣離子在細胞行使功能活動時起到重要的作用。同時，對于ROS 來說，ROS 是衰老、炎癥及某些疾病的發(fā)病機制之一，可以通過氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細胞凋亡，從而起到調(diào)節(jié)機體細胞生死平衡的作用。已有多個研究表明，當(dāng)線粒體內(nèi)膜電勢升高時，UCP2可抑制ROS 的產(chǎn)生[22，23]。而在口腔醫(yī)學(xué)研究中，也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)炎癥微環(huán)境可以顯著地提高牙周膜干細胞的ROS表達水平，從而起到抑制細胞線粒體生成和抗氧化反應(yīng)[24]。Fatokun AA 等[25]的研究也表明，ROS 起到影響成骨樣細胞作用，從而推測其可能與骨質(zhì)疏松癥有一定得關(guān)系。所以說，線粒體相關(guān)因子UCP2、ATP和ROS三者既關(guān)系密切，又各自在細胞的各種功能活動中起著重要的作用，從而為依普黃酮對骨質(zhì)疏松癥頜骨成骨細胞影響的分子機制的探討，提供一種好的研究思路和途徑。

已經(jīng)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，去勢后大鼠脂肪組織中UCP2的表達出現(xiàn)了降低[26]。并且我們前期的研究結(jié)果顯示，骨質(zhì)疏松大鼠下頜骨成骨細胞表達UCP2 較低，而ROS 和ATP 較高[10]。在本實驗中，研究發(fā)現(xiàn)依普黃酮能促進UCP2 的表達，降低ROS的表達，部分糾正了骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細胞的異常表達，通過降低ROS對成骨細胞的結(jié)構(gòu)和功能具有保護作用，也提示依普黃酮可能通過UCP2 和ROS 來調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細胞的功能活動。然而，本實驗還表明，依普黃酮對成骨細胞的作用，除了ROS 的減少和UCP2 的增加，ATP 的產(chǎn)生也增加，這似乎是使得骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細胞本來就很高的ATP 的表達更高了，但是，其一方面表明ATP的產(chǎn)生可能不僅僅受UCP2的調(diào)控，其他基因或蛋白質(zhì)也可能對ATP 的產(chǎn)生起調(diào)控作用，另一個方面也說明依普黃酮通過增加ATP 水平為成骨細胞的各種功能活動提供足夠的能量支持，促進骨生成，從而起到一定的防治骨質(zhì)疏松的作用。

總之，依普黃酮可能起到調(diào)控骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細胞的線粒體相關(guān)因子UCP2、ROS 和ATP等的作用，但是其作用機制的研究非常復(fù)雜，我們的研究結(jié)果只是提供了一定的研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)，仍然需要進一步開展更多的實驗研究來探索。