摘要：引起豬腹瀉疾病的病因較多，病毒性腹瀉是最嚴(yán)重的一個類型，它是由腹瀉病毒引起的急性傳染性的疾病。近年，豬流行性病毒腹瀉在世界范圍內(nèi)爆發(fā)，為控制該病毒，研究人員建立病毒的靶向RNA重組技術(shù)、細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)菌人工染色載體系統(tǒng)等豬流行性腹瀉病毒的遺傳學(xué)研究技術(shù)，對豬流行性腹瀉病毒的致病機(jī)理和疫苗開發(fā)有重要意義。該文總結(jié)了豬流行性腹瀉病毒反向遺傳操作技術(shù)研究現(xiàn)狀及生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用情況，為新型疫苗的研究提供參考。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒;反向遺傳學(xué);疫苗研發(fā)

中圖分類號：S858.28? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B? ? ? ? doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2021.21.064

Application Status of Reverse Genetic Manipulation of Porcine Epidemic Diarrhea Virus

Abstract：There are many causes of porcine diarrhea disease，and viral diarrhea is the most serious type.It is an acute infectious disease caused by diarrhea virus.In recent years，the swine epidemic virus diarrhea has broken out in the world，and there is no effective method to control the disease so far.To control the virus，researchers have developed targeted RNA recombination techniques，bacterial culture techniques，bacterial artificial stain vector systems，and other genetic research techniques for porcine epidemic diarrhea virus，it is of great significance to the pathogenesis and Vaccine Development of porcine epidemic diarrhea virus.In this paper，the research status of reverse genetic manipulation of porcine epidemic diarrhea virus and its application in production were summarized.

Keywords：porcine epidemic diarrhea virus，reverse genetics，vaccine development

引言

規(guī)?；B(yǎng)殖條件下豬的疫病控制較好，但因為有些疾病的關(guān)鍵藥物和防治手段不明確，還存在大范圍爆發(fā)的可能性。包括豬流行腹瀉病毒、豬傳染性腸胃炎病毒，2種病毒都屬于冠狀病毒科α冠狀病毒屬，是帶有囊膜的正鏈RNA病毒。因為豬流行性腹瀉病毒分鏈為28 kb，很難對其進(jìn)行遺傳學(xué)反向操作。對其進(jìn)行研究時要對其遺傳信息進(jìn)行拷貝，但因為其具有毒性，在拷貝過程中不穩(wěn)定。目前已成功開發(fā)3種豬流行性腹瀉病毒的反向遺傳學(xué)操作技術(shù)。

1 豬流行性腹瀉病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)

1.1 同源重組技術(shù)

靶向同源RNA技術(shù)是現(xiàn)在應(yīng)用較為普遍的分子技術(shù)，在重組鼠甘油病毒中首次使用該技術(shù)，并獲得完整的感染病毒毒株。冠狀病毒的同源RNA重組主要是利用了輕度的S蛋白的毒性作用，通過替換S蛋白合成基因的方式完成病毒的重組。建立冠狀病毒的豬流行性腹瀉病毒的反向操作技術(shù)，分2步完成病毒重組，先是構(gòu)建鼠源的細(xì)胞嗜性的肝炎病毒基因的S蛋白基因的編譯序列，在Vero細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行重組獲得重組豬流行性病毒腹瀉病毒。第1步是選擇構(gòu)建供體質(zhì)粒，選擇噬菌體T7RNA聚合酶作為基因編碼序列、orf1a/1b基因、鼠肝炎S蛋白細(xì)胞以外的編碼序列與orf3、e、m、n基因的豬流行性腹瀉病毒基因下游序列，將質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄獲得的病毒轉(zhuǎn)到Vero細(xì)胞內(nèi)，利用LR7細(xì)胞篩選出病毒致病基因。第2步是構(gòu)建包含同基因組區(qū)域、攜帶豬流行性腹瀉病毒基因的第2個重組質(zhì)粒，在質(zhì)粒構(gòu)建時可以根據(jù)病毒的研究方向，選擇替換致病基因的序列或順序。雖然使用同源重組技術(shù)可將病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，但在轉(zhuǎn)錄中因為有些區(qū)域中含有終止復(fù)合酶，在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄中要先對病毒的終止信號進(jìn)行鑒別。在進(jìn)行重組中要對病毒的致病基因進(jìn)行鈍化，技術(shù)較為煩瑣[1]。

1.2 載體反向遺傳操作技術(shù)

根據(jù)豬流行性腹瀉病毒基因組限制酶切位點的功能特點，將其分為8個片段，每個片段的兩端均選擇合適的限制性酶切位點進(jìn)行內(nèi)切，之后再利用脫氧核糖核酸（DNA）鏈將片段合成全長的長鏈DNA。該技術(shù)可以減少冠狀病毒的毒性序列在拷貝質(zhì)粒中復(fù)制的不穩(wěn)定難題，可對病毒所有基因進(jìn)行剪切整合操作，獲得病毒具有高的表達(dá)效率。由于需要引入新的限制性酶切位點，需要認(rèn)真分析和選擇限制性酶，避免引入內(nèi)切酶后引起突變影響病毒的復(fù)制而導(dǎo)致拯救病毒失敗。

1.3 體外反向遺傳學(xué)操作技術(shù)

體外反向遺傳技術(shù)可避免細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)增殖引起病毒的不穩(wěn)定性，是抑制病毒毒性的最有效措施。按照體外連接的反向遺傳學(xué)操作技術(shù)，先將體外病毒轉(zhuǎn)移到長鏈的DNA鏈上，保證病毒基因的穩(wěn)定，利用核糖核酸（RNA）聚合酶體對該病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄獲得病毒基因組，再將含有致病基因的病毒組轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行病毒重組。首先利用這種體外組裝技術(shù)，獲得大片段的DNA并將冠狀病毒感染性克隆，此技術(shù)還可在肝炎病毒、傳染性支氣管炎病毒、非典型肺炎病毒（SARS）、禽流感和中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS）的反向遺傳學(xué)操作中應(yīng)用。

1.4 其他反向遺傳學(xué)操作技術(shù)

除上文提到的同源重組技術(shù)、載體反向遺傳操作技術(shù)、體外反向遺傳學(xué)操作技術(shù)外，目前還有以痘病毒為載體的反向遺傳技術(shù)、基于Gibson組裝系統(tǒng)為基礎(chǔ)的反向遺傳技術(shù)。雖目前對這2種技術(shù)的研究還較少，但是均具有良好的發(fā)展前景，值得進(jìn)行進(jìn)一步的開發(fā)和應(yīng)用。

2 技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1 在豬流行性腹瀉病毒的研究應(yīng)用

應(yīng)用反向遺傳技術(shù)對豬流行性腹瀉病毒進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)其對胰蛋白酶具有依賴性，采用反向遺傳后發(fā)現(xiàn)S蛋白基因受到胰蛋白酶影響下發(fā)生空間構(gòu)像的改變。在進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)S蛋白基因中的T752位點是胰蛋白酶依賴點，這對于病毒體外擴(kuò)增具有重要意義。

豬流行性腹瀉病毒的主要毒力蛋白S，其具有不同的類型，使用反向基因?qū)W可以將這些不同類型的毒力蛋白因子進(jìn)行剪切，為進(jìn)一步對病毒的致病力研究提供參考。豬流行性腹瀉病毒的豬圓環(huán)病毒3型（ORF3）蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個輔助性蛋白，應(yīng)用反向遺傳學(xué)技術(shù)ORF3蛋白可以使分析其他病毒蛋白細(xì)胞適應(yīng)和致病性的影響與ORF3蛋白的影響結(jié)合起來成為可能[2]。

2.2 研制新型豬流行性腹瀉疫苗

新生仔豬因為不能及時產(chǎn)生免疫應(yīng)答能力，自身生產(chǎn)免疫抗原的能力有限，一般是依靠母乳獲得免疫能力。實驗證實豬流行性腹瀉病毒具有直接侵襲小腸膜的能力，這種從母體獲得免疫抗體的方式，可以有效控制病毒的侵害。在對母豬病毒腹瀉抗原的體內(nèi)變化監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)，母豬長期生活在固定環(huán)境下，體內(nèi)會產(chǎn)生大量的病毒性腹瀉抗原，這些抗原會通過乳汁供給仔豬，為仔豬提供免疫能力，但在母豬產(chǎn)后3 d左右免疫抗原的量會急速降低，抗原對仔豬的保護(hù)時間較短。豬病毒性腹瀉疫苗主要是通過口服的方式，提高母豬乳汁的面向抗原量，減少仔豬腹瀉的發(fā)生。

現(xiàn)在開發(fā)的口服疫苗的效果主要依賴疫苗對豬腸上皮細(xì)胞上的感染能力，然而豬流行性腹瀉病毒在體外培養(yǎng)過程中影響它作為口服疫苗的病毒效力。通過Vero多代次培養(yǎng)后，Vero細(xì)胞適應(yīng)毒株的能力相比豬流行性腹瀉病毒Dr13親本株培養(yǎng)的免疫疫苗效果差。Chen不同代數(shù)毒株培養(yǎng)制成的免疫疫苗，進(jìn)行口服接種的毒力實驗也證實多代細(xì)菌無法感染仔豬的小腸上皮細(xì)胞。為了開發(fā)有效的豬流行性病毒腹瀉疫苗，接種的疫苗要保持其在體外的高生長性，還要保證毒力的同時必須保持病毒對小腸細(xì)胞的適應(yīng)性。

豬流行性腹瀉病毒反向遺傳學(xué)操作及時給新型疫苗的研發(fā)提供巨大的潛力。為臨床分離毒株和細(xì)胞適應(yīng)株提供了技術(shù)保證，對重組病毒侵入豬小腸上皮細(xì)胞機(jī)制研究的不斷深入，將進(jìn)一步揭示消化道內(nèi)的蛋白酶類對疫苗免疫的作用機(jī)制。利用反向遺傳學(xué)技術(shù)改造體外培養(yǎng)的細(xì)胞以增加其小腸細(xì)胞適應(yīng)性[3]。

3 結(jié)束語

豬病毒性腹瀉的爆發(fā)給養(yǎng)殖業(yè)帶來極大沖擊，也對養(yǎng)殖者的效益產(chǎn)生極大損害。目前，反向遺傳學(xué)技術(shù)的應(yīng)用給研發(fā)新型疫苗提供了技術(shù)基礎(chǔ)，以突變或抑制毒力基因表達(dá)的形式研制新型疫苗。但是，病毒在不同宿主體內(nèi)的變異情況不同，其感染機(jī)制還不能清楚闡明，雖體外研究方式在一定程度上能解決該問題，但依據(jù)體外方式研發(fā)的技術(shù)類藥品和疫苗在試驗中的效價很低，有時會有諸多不良反應(yīng)。反向遺傳技術(shù)可以針對不同宿主進(jìn)行病毒致病機(jī)理研究，為解決個體差異提供可行的技術(shù)手段。

參考文獻(xiàn)

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[2] 張金晶，王亞娟，丁翊君.多重聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合反向線性點雜交技術(shù)檢測新生兒化膿性腦膜炎的病原及其耐藥基因[J].中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志，2019（11）：774-780.

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作者簡介：王曉蕾（1984-），女，山東煙臺人，本科，獸醫(yī)師，從事畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣、重大動物疫病防控、動物及動物產(chǎn)品檢疫、畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督等工作。