梁馬可 李學(xué)民 孫蕾 馬保東 呂朋舉 岳寒

1鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院肝膽胰外科，鄭州 450000；2鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，鄭州 450000；3河南省人民醫(yī)院干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)中心 ，鄭州 450000

研究表明，樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)作為機(jī)體最重要的抗原提呈細(xì)胞，參與胰腺炎的發(fā)生和發(fā)展[1]。Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)是一類跨膜模式識(shí)別受體，可通過(guò)識(shí)別不同的病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)及損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)激活固有免疫細(xì)胞，參與炎癥反應(yīng)。內(nèi)毒素及炎癥因子可與DCs表面的TLR4識(shí)別并結(jié)合，促進(jìn)DCs的成熟并通過(guò)經(jīng)典的TLR4/IKKα/NF-κB/COX-2促炎信號(hào)通路引起炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，從而導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征[2]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞( human umbilical cord-mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)屬于干細(xì)胞家族的重要成員，不但具有自我更新和多向分化潛能[3]，還具有低免疫原性及免疫調(diào)節(jié)功能[4-5]，能夠抑制DCs的成熟、分化及誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性樹(shù)突狀細(xì)胞(regulatory DCs, regDCs)參與免疫調(diào)節(jié)。但hUC-MSCs對(duì)SAP患者DCs的影響尚不清楚。有研究認(rèn)為hUC-MSCs可以通過(guò)分泌抗炎細(xì)胞因子、抑制促炎細(xì)胞因子及減輕組織損傷來(lái)治療SAP[6-7]，但其是否通過(guò)抑制TLR4/IKKα/NF-κB/COX-2通路調(diào)控炎癥仍需進(jìn)一步探究。本研究旨在探討體外hUC-MSCs對(duì)SAP患者DCs的免疫調(diào)節(jié)作用及其調(diào)控通路，以期為SAP的臨床治療提供新的思路。

材料與方法

一、hUC-MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定

采集鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院行剖宮產(chǎn)的足月胎兒臍帶4～5 cm， PBS充分洗滌，去除血管內(nèi)殘留血液，無(wú)菌條件下分離取出臍帶外膜組織和血管組織，獲得臍帶wharton膠組織，將其盡量剪碎，用0.1% Ⅰ型膠原酶(美國(guó)Gibco公司)37℃消化4 h后200目篩網(wǎng)過(guò)濾。收集濾液，使用Thermo Scientific Heraeus Multifuge X3系列離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)以1 700 r/min離心(離心半徑60 cm)8 min，重懸細(xì)胞沉淀接種于75 cm2的培養(yǎng)瓶中，添加友康培養(yǎng)基至12 ml，在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5～6 d第1次換液，以后每2～3 d更換新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至接近85%融合時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(北京索萊寶公司)消化細(xì)胞，1∶3傳代。傳至第3代時(shí)收集細(xì)胞懸于500 μl PBS中，分別加入FITC-CD19、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR、PE-CD90、APC-CD105、APC-A750-CD73抗體4 μl，4℃避光孵育30 min，離心棄上清，加入1 ml PBS清洗細(xì)胞一次，然后將細(xì)胞重懸后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，進(jìn)行表型鑒定。同時(shí)對(duì)hUC-MSCs進(jìn)行成脂和成骨誘導(dǎo)分化，采用油紅O染色液(北京索萊寶公司)進(jìn)行脂肪細(xì)胞染色，采用茜素紅染液(北京索萊寶公司)進(jìn)行成骨細(xì)胞染色。將傳至第3代時(shí)的hUC-MSCs提前1 d接種于6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜，待hUC-MSCs融合80%～90%時(shí)，加入絲裂霉素C(10 μg/ml)，37℃孵育4 h，取出培養(yǎng)基，PBS洗滌2次后備用。

二、DCs分離、培養(yǎng)及分組

采集鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院肝膽胰外科5例SAP患者新鮮肝素抗凝外周靜脈血20 ml，用等量PBS充分混勻后，用滴管沿管壁將外周血緩慢疊加于40 ml淋巴細(xì)胞分離液層。2 300 r/min離心(離心半徑60 cm)20 min。吸取白膜層，PBS洗滌細(xì)胞2次。洗盡血小板，用RPMI1640完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞, 調(diào)整細(xì)胞密度為2×109個(gè)/L，加入6孔板中，每孔2 ml，放入37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)4 h后，吸去培養(yǎng)上清，加入預(yù)熱的培養(yǎng)液，緩慢搖動(dòng)培養(yǎng)板去除非貼壁細(xì)胞，獲得貼壁的單核細(xì)胞。每孔加入2 ml含10 ng/ml GM-CSF、5 ng/ml IL-4和10% FCS的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)5 d，隔天半量換液。于第5天開(kāi)始, 每孔加入100 ng/ml TNF-α，同時(shí)以是否與hUC-MSCs共培養(yǎng)及是否加入NF-κB下游調(diào)控基因COX-2抑制劑NS398為分組標(biāo)準(zhǔn)，將細(xì)胞分為DCs組、hUC-MSCs+DCs組、hUC-MSCs+DCs+NS398組。DCs組為上述培養(yǎng)至第8天收集的懸浮細(xì)胞；hUC-MSCs+DCs組為第6天DCs與hUC-MSCs按10∶1的比例共培養(yǎng)于含有100 ng/ml TNF-α、10 ng/ml GM-CSF、5 ng/ml IL-4和和10% FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液中，48 h后收集細(xì)胞。hUC-MSCs+DCs+NS398組為共培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)40h后加入75 μmol/ml NS398，繼續(xù)培養(yǎng)8 h，收集細(xì)胞。

三、DCs表面標(biāo)志物鑒定

取上述3組1×105個(gè)細(xì)胞于流式管，每組細(xì)胞設(shè)5個(gè)管，分別加入FITC-Lineage Cocktail 1、PE-anti-human HLA DR、APC-750-anti-human CD11c、APC-anti-human CD80或APC-anti-human CD86，抗體用量按照說(shuō)明書(shū)推薦量，總?cè)莘e為100 μl。設(shè)置同型對(duì)照管，加入相同濃度的同型對(duì)照抗體。避光保存，并于1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞DCs表面標(biāo)志物CD11b、CD1a、CD11c的表達(dá)量。

四、DCs組、hUC-MSCs+DCs組細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子水平檢測(cè)

采集DCs組、hUC-MSCs+DCs組培養(yǎng)24 h上清，使用LEGENDplex自定義11細(xì)胞因子檢測(cè)板(美國(guó)Biolegend公司)，并根據(jù)說(shuō)明書(shū)在培養(yǎng)上清中加入磁珠標(biāo)記的IL-1β、IL-1α、IL-2、IL-6 、IL-10抗體。避光孵育后采用Cytoflex流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，通過(guò)Legendplex V8.0軟件(Biolegend)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出待測(cè)樣本各指標(biāo)的濃度。

五、各組細(xì)胞炎癥相關(guān)蛋白NF-κB-p65、IKKα及TLR4表達(dá)檢測(cè)

取上述3組細(xì)胞，采用RIPA裂解液(北京索萊寶公司)抽提細(xì)胞總蛋白。BCA法定量蛋白后常規(guī)行蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)NF-κB-p65、IKKα及TLR4蛋白表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參。NF-κB-p65、IKKα、TLR4及GAPDH均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗購(gòu)于美國(guó)Pierce公司。最后ECL發(fā)光、X線片曝光、顯影、定影。采用凝膠圖像軟件分析系統(tǒng)掃描圖像，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、hUC-MSCs的生物學(xué)特性及表型鑒定

第3代hUC-MSCs呈成纖維樣，細(xì)胞大小與形態(tài)均一、排列有序(圖1A)。hUC-MSCs可成功誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞(圖1B)、骨細(xì)胞(圖1C)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示hUC-MSCs表面標(biāo)志物CD90、CD105、CD73表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率分別為94.38%、99.45%、94.91%(圖1D～1F)，而CD19、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR表達(dá)陰性，符合hUC-MSCs的表型特征。

圖1 hUC-MSCs形態(tài)、分化能力及表面標(biāo)志物鑒定。1A示第3代hUC-MSCs倒置顯微鏡下形態(tài)(×100)；1B示hUC-MSCs進(jìn)行成脂誘導(dǎo)21 d，光鏡下形態(tài)(油紅O染色，×100)；1C示hUC-MSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)21 d光鏡下形態(tài)(茜紅素染色，×100)；1D～1F示流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hUC-MSCs表面標(biāo)志物CD90、CD105、CD73表達(dá)陽(yáng)性

二、DCs細(xì)胞形態(tài)及reg DCs表型鑒定

在DCs培養(yǎng)第3天時(shí)，細(xì)胞周邊出現(xiàn)較短的樹(shù)突狀突起，細(xì)胞呈現(xiàn)聚集生長(zhǎng)，并隨時(shí)間延長(zhǎng)聚集更明顯，此時(shí)形成未成熟DCs(imDCs，圖2A))。imDC中加入TNF-α培養(yǎng)4～5 d后，成簇的imDCs逐漸分開(kāi)，細(xì)胞體積變大，細(xì)胞外突起增多、變長(zhǎng)，形成成熟DCs(maDCs，圖2A)。培養(yǎng)至第5天加入hUC-MSCs共培養(yǎng)后，imDCs呈黏附生長(zhǎng)，細(xì)胞樹(shù)突較少(圖2B)，流式細(xì)胞檢測(cè)CD11b表達(dá)增加，CD1a和CD11c表達(dá)下降，出現(xiàn)CD11bhighCD1alowCD11clow的表型特點(diǎn)，即為regDCs(圖2B)。

圖2 DCs組培養(yǎng)3～5 d，可見(jiàn)偽足樣凸起，有未成熟DCs及成熟DCs(2A，×10)，加入hUC-MSCs共培養(yǎng)后，DCs多呈黏附生長(zhǎng)，細(xì)胞樹(shù)突較少，主要為regDCs(2B，×10)

三、hUC-MSCs對(duì)DCs成熟和分化的影響

與DCs組比較，hUC-MSCs+DCs組的regDCs標(biāo)志物CD11b表達(dá)顯著上調(diào)[(14.26±1.25)%比(4.87±0.58)%]，CD1a、CD11c表達(dá)顯著下調(diào)[(2.81±0.34)%比(13.62±1.52)%、(3.88±0.50)%比(11.80±1.22)% ]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，圖3)。提示DCs與hUC-MSCs共培養(yǎng)后，hUC-MSCs抑制DCs的成熟和分化，導(dǎo)致以CD11bhighCD1alowCD11clow為特征的reg DCs比例增加。

圖3 DCs組(1)、hUC-MSCs+DCs組(2)、hUC-MSCs+DCs+NS398組(3)DCs各表型的百分比

四、DCs組、hUC-MSCs+DCs組細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子水平

與DCs組比較，hUC-MSCs+DCs組培養(yǎng)上清液IL-1β、INF-γ、IL-6水平下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)；而促炎因子IL-1α水平顯著下降，抗炎因子IL-10水平顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表1)。提示hUC-MSCs可能通過(guò)調(diào)控DCs增加抗炎細(xì)胞因子分泌、抑制促炎細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

表1 2組細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-1β、INF-γ、IL-6、IL-1α、IL-10水平

五、DCs組、hUC-MSCs+DCs組、hUC-MSCs+DCs+NS398組NF-κB-p65、TLR4及IKKα蛋白表達(dá)

與DCs組比較，hUC-MSCs+DCs組NF-κB-p65、TLR4蛋白表達(dá)下降，IKKα蛋白表達(dá)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表2)。與DCs組及hUC-MSCs+DCs組比較，hUC-MSCs-DCs+NS398組的NF-κB-p65、TLR4表達(dá)下降，而IKKα蛋白表達(dá)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表2、圖4)。

表2 3組細(xì)胞NF-κB-p65、TLR4、IKKα蛋白表達(dá)

圖4 DCs組(1)、hUC-MSCs+DCs組(2)、hUC-MSCs+DCs+NS398組(3)NF-κB-p65、TLR4、IKKα蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

討 論

SAP往往早期出現(xiàn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征，死亡率高達(dá)30%，因此，早期控制炎癥是治療SAP的關(guān)鍵。研究認(rèn)為，SAP引起的炎癥因子、細(xì)菌和(或)內(nèi)毒素等PAMPs或DAMPs可以被宿主DCs表面的TLR4識(shí)別并結(jié)合，促進(jìn)DCs的成熟，通過(guò)多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起DCs分泌促炎細(xì)胞因子，如TNF-ɑ、IL-8、IL-1β等，從而加重炎性反應(yīng)[8]。MSCs因其生物學(xué)特性，可通過(guò)作用于免疫系統(tǒng)包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、DCs、NKs在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞來(lái)實(shí)施免疫調(diào)節(jié)，調(diào)控炎癥反應(yīng)[9]。有研究表明，與MSCs共培養(yǎng)的DCs即使在促其成熟的脂多糖或TNF-α刺激下仍不表達(dá)CD83，且其成熟標(biāo)志物如MHCⅡ類分子、CD40或CD86表達(dá)也未上調(diào)[10]，提示MSCs可以抑制DCs的成熟與分化。

有研究報(bào)道，在對(duì)急性胰腺炎的治療中，MSCs 發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)特性，誘導(dǎo)Foxp3+輔助T細(xì)胞的產(chǎn)生，后者誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時(shí)抑制 CD3+以及CD4+T細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步降低胰腺炎相關(guān)炎性因子，如 TNF-α、γ 干擾素、IL-1β、IL-6、IL-15、IL-17、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、TGF-β等的表達(dá)，同時(shí)增加抗炎因子如 IL-4 和IL-10的表達(dá)，這些改變又降低了全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生率[11]。本研究結(jié)果顯示，MSCs誘導(dǎo)的DCs表現(xiàn)出髓系分子CD11c、提呈分子CD1a和共刺激分子CD80、CD86表達(dá)明顯下調(diào)，而CD11b的表達(dá)上調(diào)，表明MSCs誘導(dǎo)出了一種不同的DC群體，即regDCs。本研究結(jié)果還顯示，hUC-MSC+DCs共培養(yǎng)組分泌的IL-1α、IL-1β、IL-6下降，但I(xiàn)L-10的分泌增加，這也是regDC群體的一個(gè)特征。由于體外誘導(dǎo)DCs分化成熟需要IL-4和TNF-α，因此目前無(wú)法分析這兩種因子的促炎作用，但本研究結(jié)果提示MSCs可以通過(guò)調(diào)節(jié)DCs的分化進(jìn)而分泌抗炎細(xì)胞因子、抑制促炎細(xì)胞因子以行使免疫調(diào)節(jié)作用。

TLRs與炎癥反應(yīng)的關(guān)系目前已明確[12]，其中通過(guò)TLR4/IKKα/NF-κB信號(hào)通路激活作用于COX-2增加促炎細(xì)胞因子合成和釋放，被認(rèn)為在炎癥發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。而COX-2抑制劑又可以抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB或激活蛋白-1(activator protein-1， AP-1)，通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)來(lái)減弱NF-κB的表達(dá)，發(fā)揮抗炎和抗增殖作用[13]。但關(guān)于SAP時(shí)TLR4/IKKα/NF-κB信號(hào)通路對(duì)DCs成熟及分化影響的研究較少。本研究結(jié)果顯示，與hUC-MSCs共培養(yǎng)后，CD11bhighCD1alowCD11clowregDCs比例增加，NF-κB-p65與TLR4蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，IKKα由于組蛋白修飾減少而表達(dá)上調(diào)；以NS398阻斷NF-κB 下游基因COX-2表達(dá)后，NF-κB-p65與TLR4蛋白表達(dá)繼續(xù)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，而IKKα蛋白表達(dá)再次顯著上調(diào)。提示hUC-MSCs可能通過(guò)調(diào)節(jié)SAP患者DCs的成熟及分化進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響與TLR4的結(jié)合，導(dǎo)致IKKα激活減少，使得NF-κB-p65表達(dá)下調(diào)，最終阻斷NF-κB通路，減少炎癥因子的產(chǎn)生。

綜上所述，hUC-MSCs能抑制DCs的分化及成熟，產(chǎn)生regDCs進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，同時(shí)經(jīng)TLR4/IKKα/NF-κB/COX-2途徑抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，發(fā)揮抗炎作用，有效降低全身炎癥反應(yīng)程度，緩解胰腺及其他臟器的損傷，達(dá)到治療SAP的目的。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突