王順民 黃露 陳橙 楊曉丹 唐路軍 姚福勝 陸朵梅 宋雪云

摘要 目的：觀察復方七芍降壓片在調節(jié)血壓時對血清炎癥介質和血管組織學的影響。方法：采用自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）為實驗對象，Wistar-kyoto大鼠（WKY）為實驗對照，以灌胃方式給予復方七芍降壓片和厄貝沙坦。使用嘌呤受體P2Y6抑制劑MRS2578干預炎癥反應信號的傳遞，檢測不同處理下大鼠的血壓，炎癥介質TNF-α、IL-6、IL-1β的表達，以及血管結構。結果：復方七芍降壓片可以顯著地降低大鼠血壓。結果表明，復方七芍降壓片可以顯著地降低血清中TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥介質的含量。HE染色結果顯示復方七芍降壓片顯著地促進血管結構恢復正常。結論：復方七芍降壓片抑制了炎癥介質的表達，促進了血管恢復。復方七芍降壓片降低血壓的功效可能與抑制炎癥反應促進血管恢復有關。

關鍵詞 復方七芍降壓片;炎癥介質;血管組織學;自發(fā)性高血壓

Effect of Fufangqishao anti-hypertension tablets on the Content of Inflammatory Factors in Serum and Vascular Histology in Spontaneously Hypertensive Rats

WANG Shunmin1，Huang Lu1，CHEN Cheng2，YANG Xiaodan3，TANG Lujun4，YAO Fusheng3，LU Dumei5，SONG Xueyun1

（1 First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410007，China; 2 Hunan Provincial Institute of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410006，China; 3 Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410208，China; 4 Hunan Aerospace Hospital，Changsha 410006，China; 5 Changsha 9th Hospital，Changsha 410018，China）

Abstract Objective：To observe the effect of Fufangqishao anti-hypertension tablets（FHT）on inflammatory factors in serum and vascular Histology.Methods：The spontaneous hypertensive rats（SHR）were used as the experimental model，Wistar Kyoto rats were used as the control.FHT and Irbesartan were given by gavage.Purinoceptor P2Y6 inhibitor MRS2578 was used to interfere with the transmission of inflammatory response signals.The blood pressure，the expression of TNF-α，IL-6，IL-1 β and the vascular histology of rats under different treatments were measured.Results：FHT can significantly reduce the blood pressure of rats under different disposal.ELISA results showed that FHT can significantly reduce the content of TNF-α，IL-6，IL-1 β in serum.HE staining showed that FHT significantly promoted the recovery of vascular structure in rats.Conclusion：FHT inhibited the expression of inflammatory factors and promote the recovery of blood vessels.The effect of FHT may be related to inhibiting inflammatory reaction and promoting vascular recovery.

Keywords Fufangqishao anti-hypertension tablets; Inflammatory Factors; Vascular Histology; Spontaneous Hypertension

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.04.009

高血壓是一種全球性慢性疾病，高血壓的防治是一項重要的課題[1-2]。中醫(yī)理論認為，“病位在肝，根源在腎”是高血壓的主要病機。復方七芍降壓片由三七、白芍等多味活血化瘀、養(yǎng)陰柔肝的中藥制備而成，有“補益肝腎，活血化瘀”之功，行“養(yǎng)陰柔肝，化瘀息風”之效。復方七芍降壓片在實驗研究和臨床應用中均能夠顯著地降低血壓[3-4]。

研究發(fā)現，高血壓與血管重塑密切相關，異常的血流動力學、血管活性物質、細胞外基質和炎癥介質等都是導致高血壓血管重構的重要因素[5-6]。前期研究顯示，復方七芍降壓片在降低血壓的同時，能夠影響血流動力學，血管緊張素II、內皮素和一氧化氮等血管活性物質以及TNF-α、IL-6等炎癥介質。炎癥介質與原發(fā)性高血壓關系密切，炎癥反應是高血壓發(fā)生和發(fā)展的重要因素[7-8]。本文重點研究復方七芍降壓片在炎癥介質抑制劑存在的條件下，對炎癥介質和血管結構的影響，探討復方七芍降壓片通過抑制炎癥反應和血管重塑達到降壓效果的可能性，為其治療自發(fā)性高血壓提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 以48只8周齡自發(fā)性高血壓大鼠（Spontaneously Hypertension Rat，SHR）為觀察組，體質量為（246.5±18.3）g;以8只8周齡Wistar-kyoto大鼠（WKY）為對照組，體質量為（238.3±19.2）g。所用大鼠均為SPF級雄性，來源于北京維通利華實驗動物有限責任公司[動物許可證號：SCXK（京）2012-0001]。飼養(yǎng)條件為室溫18～20 ℃，濕度65%～70%，自由進食飲水。本研究經醫(yī)學實驗動物管理委員會批準（倫理審批號：ZYFY20151024）。

1.1.2 實驗藥物 復方七芍降壓片（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，批號：201506），厄貝沙坦[賽諾菲（杭州）制藥有限公司，批號：5A159]。

1.1.3 試劑與儀器 MRS2578試劑（賽力克，美國，貨號：S2855）;大鼠TNF-α酶聯免疫試劑盒（欣博盛，貨號：ERC102a.96）;大鼠IL-6酶聯免疫試劑盒（欣博盛，貨號：ERC003.96）;大鼠IL-1β酶聯免疫試劑盒（欣博盛，貨號：ERC007.96）;蘇木精（國藥滬試，貨號：71020782）;伊紅Y（國藥滬試，貨號：71014544）。智能無創(chuàng)血壓計（北京軟隆生物技術有限公司，型號：BP-98A）;病理組織包埋機（常州市中威醫(yī)療儀器有限公司，型號：BMJ-1n）;倒置顯微鏡（奧林巴斯，日本，型號：CKX53）;超薄切片機（廣州市華俊醫(yī)療器械有限公司，型號：LKB-Ⅲ）;生物組織自動脫水機（湖北省孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司產品，型號：TS-12F）;多功能酶標儀（安圖斯，奧地利，型號：biocell2010）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 取8只WKY大鼠作為正常對照組（A：WKY對照組）。將SHR大鼠隨機分為6個觀察組，每組8只（B：SHR組;C：SHR+MRS2578組;D：SHR+復方七芍降壓片組;E：SHR+復方七芍降壓片組+MRS2578;F：SHR+厄貝沙坦組;G：SHR+厄貝沙坦組+MRS2578）。

1.2.2 給藥方法 適應性喂養(yǎng)1周后，各觀察組開始給藥。復方七芍降壓片和厄貝沙坦每日定點灌胃1次，連續(xù)灌胃8周，每周最后1 d測量體質量，根據體質量調整給藥量;MRS2578則采用腹腔注射給藥，隔日注射1次。復方七芍降壓片給藥量為16 g/（kg·d），厄貝沙坦給藥量為25 mg/（kg·d），MRS2578為藥量為3 mg/（kg·d）。

1.2.3 檢測指標與方法 1）血壓測定：用藥期間每周最后1 d，應用智能無創(chuàng)血壓計測量各組鼠尾血壓。2）酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測：用藥期間每周最后1 d，采集各組血液，離心后獲得血清，按照ELISA試劑盒說明書操作。3）石蠟切片及HE染色：大鼠斷頭處死后，分離腎主動脈血管組織。10%甲醛固定，石蠟包埋后制作切片。切片脫蠟至水，使用蘇木精和伊紅進行染色。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，各組間比較采用方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著差值法（LSD），以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血壓變化測定結果 各組大鼠處理前及處理后的血壓如圖1所示。WKY對照組（A組）血壓在整個實驗各時間點均比較平穩(wěn)，SHR組（B組）血壓呈現自發(fā)性升高，單處理組（C、D、F組）血壓呈現下降趨勢，雙處理組（E、G組）呈現更明顯的下降趨勢。將各組間數據進行比較得出：MRS2578可以有效抑制高血壓（C組相較于B組、E組相較于D組、G組相較于F組，第4周后P值均<0.05）;復方七芍降壓片可以有效抑制高血壓（D組相較于B組，第4周后P值均<0.05）;厄貝沙坦可以有效抑制高血壓（F組相較于B組，第4周后P值均<0.05）;雙處理組比較MRS2578或復方七芍降壓片或厄貝沙坦單獨處理，對血壓的控制效果更為顯著（E、G組相較于C組、E組相較于D組、G組相較于F組，第4周后P值均<0.05）。復方七芍降壓片組與厄貝沙坦血比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.2 炎癥介質檢測結果 在實驗的第1、4、8周最后1 d分別采集大鼠的外周血;采用ELISA法分別檢測血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量，結果如圖2所示。WKY對照組（A組）血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量在實驗各個階段均比較平穩(wěn)，SHR大鼠模型組（B組）血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量呈現升高趨勢，單處理組（C、D、F組）血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量呈現一般下降趨勢，雙處理組（E、G組）血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量呈現顯著下降趨勢。將各組間數據進行比較得出：MRS2578可以有效降低血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量（C組相較于B組、E組相較于D組、G組相較于F組，第4、8周P值均<0.05）;復方七芍降壓片可以有效降低血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量（D組相較于B組，第4、8周P值均<0.05）;厄貝沙坦可以有效降低血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量（F組相較于B組，第4、8周P值均<0.05）;雙處理組比較MRS2578或復方七芍降壓片或厄貝沙坦單獨處理，對血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量控制效果更為顯著（E、G組相較于C組、E組相較于D組、G組相較于F組，第4、8周P值均<0.05）。復方七芍降壓片組與厄貝沙坦組比較，血清中炎癥介質含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.3 動脈組織學觀測結果 分離各組大鼠腎主動脈血管組織，甲醛固定后制作石蠟切片，HE染色后觀測，結果如圖3所示。WKY大鼠正常組（A組）：動脈內膜光滑、管壁厚度較均勻;可見主動脈膜中VSMC排列均勻而有序;主動脈中層彈性膜厚薄均一，分層清晰且完整;隨實驗的進程，組織結構無明顯變化。SHR大鼠模型組（B組）與正常組（A組）比較：動脈內膜粗糙不平，管壁明顯增厚;主動脈膜中VSMC分布不均勻，且數目明顯增多;主動脈中層彈性膜厚薄不一，分層不明顯，且少數出現斷層的現象;隨實驗的進程，到第4、8周組織結構更加惡化，一些部位出現明顯的腫大。單處理組（C、D、F組）與模型組（B組）比較，隨著實驗的進程，到第4周主動脈組織結構有明顯的改觀，到第8周主動脈組織結構恢復的更加正常，但與正常組（A組）比較還存在較大的差異。雙處理組（E、G組）與單處理組（C、D、F組）比較，主動脈組織結構又有比較明顯的改觀，到第8周主動脈組織結構基本恢復到正常狀態(tài)，正常組（A組）比較，差異不明顯。復方七芍降壓片組與厄貝沙坦血比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

將HE染色的結果應用計算機圖像分析系統(tǒng)，在同一位置測量主動脈血管中膜厚度和管腔直徑，以二者比值計算WT值（Wall Thickness），結果如圖4所示。WKY大鼠正常組（A組）在整個實驗階段均比較平穩(wěn);SHR大鼠模型組（B組）呈現升高趨勢;單處理組（C、D、F組）第1周WT值與SHR大鼠模型組（B組）差異無統(tǒng)計學意義，第4、8周呈現下降趨勢;雙處理組（E、G組）第1周與SHR大鼠模型組（B組）差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），第4、8周后呈現下降趨勢，與單處理組比較下降趨勢更明顯。將各組間數據進行比較得出：MRS2578可以有效降低WT值（C組相較于B組、E組相較于D組、G組相較于F組，第4、8周P值均<0.05）;復方七芍降壓片可以有效降低WT值（D組相較于B組，第4、8周P值均<0.05）;厄貝沙坦可以有效降低WT值（F組相較于B組，第4、8周P值均<0.05）;雙處理組比較MRS2578或復方七芍降壓片或厄貝沙坦單獨處理，對血管WT值控制效果更為顯著（E、G組相較于C組、E組相較于D組、G組相較于F組，第4、8周P值均<0.05）。復方七芍降壓片組與厄貝沙坦血比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

3 討論

炎癥介質是自發(fā)性高血壓的重要因素之一。研究發(fā)現，TNF-α，IL-6等炎癥介質在高血壓患者中的表達量較正常人高[9-10]。嘌呤受體P2Y6是傳遞炎癥反應信號的關鍵蛋白[11-12]，被認為與高血壓的調控密切相關[13]。在本研究中，使用MRS2578作為P2Y6的抑制劑[13-14]，抑制炎癥反應信號的傳遞。研究結果顯示，所有SHR模型組中IL-6、IL-1β、TNF-α均呈現高水平表達，說明SHR體內促炎-抗炎平衡體系已經打破，血壓增高導致的內皮功能障礙可產生大規(guī)模、高強度、持續(xù)性的炎癥反應，進而打破炎癥反應穩(wěn)態(tài)平衡。隨著時間的推移，SHR模型組（B組）中IL-6、IL-1β、TNF-α均呈現升高趨勢。復方七芍降壓片降低了血壓，下調了IL-6、IL-1β和TNF-α的表達水平，與MRS2578處理組和厄貝沙坦處理組一致。已有研究表明，多種降壓藥物在降壓的同時能夠下調炎癥介質的表達[15-16]。因此推測抑制這些藥物可能是通過抑制炎癥反應來發(fā)揮降壓功能，而復方七芍降壓片很可能也是通過抑制炎癥反應，達到降壓的效果。

研究表明，高血壓與血管重塑密切相關[17-18]。WT值為血管壁比血管腔，比值升高則血管內阻力增加，是評判小動脈血管重塑的一個指標。本研究結果顯示，復方七芍降壓片可以顯著改善自發(fā)性高血壓造成的動脈內膜粗糙不平，管壁增厚;促使主動脈膜中血管平滑肌細胞（VSMC）分布均勻，數目逐漸恢復到正常水平;優(yōu)化主動脈中層彈性膜，使其逐步恢復成厚薄均一，分層明顯;逐步下調血管壁厚度，直至恢復正常水平。血管異常增生使高血壓發(fā)展過程中的血管切應力增加，炎癥介質刺激血管內皮引起細胞損傷，從而導致VSMC的異常增生和遷移，最終使得組織纖維化直至血管結構改變。因此，內皮細胞的炎癥反應可能是血管異常增生發(fā)生的始動因素。復方七芍降壓片從消除炎癥反應開始，在抑制血管異常增生中起到很好的療效，這是其治療高血壓的病理學機制。

動物機體內有促炎系統(tǒng)和抗炎系統(tǒng)，其持續(xù)時間及反應程度決定了組織損傷修復的結果，二者保持平衡狀態(tài)，才能維持機體正常的炎癥反應穩(wěn)態(tài)[19-20]。研究發(fā)現，短時間和輕度的炎癥反應對損傷修復有利，長時間和強烈的炎癥反應對損傷修復不利甚至導致壞死，而持續(xù)的中等強度的炎癥反應則易引起組織纖維化，導致血管結構變化[21]。在高血壓狀態(tài)下，各炎癥介質沒有處在正常水平，炎癥反應反復發(fā)生或被過度放大，內皮細胞不斷分泌炎癥介質，使炎癥介質維持在較高水平，機體難以維持炎癥反應穩(wěn)態(tài)，最終造成血管組織損傷、血管異常增生甚至血管重塑。本研究中復方七芍降壓片對干預炎癥反應具有良好的效果，顯著降低炎癥介質表達水平，維系了機體正常的炎癥反應穩(wěn)態(tài)。中醫(yī)防治高血壓講究“整體條理，辨證施治”，從多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點進行調節(jié)，具有療效持久穩(wěn)定、不良反應小的特點。因此，把握高血壓的中醫(yī)病理，依理法方藥進行機制研究，對高血壓的預防、治療和轉歸均具有十分重要的臨床意義和科學價值。

參考文獻

[1]Samuels J A，Zavala A S，Kinney J M，et al.Hypertension in Children and Adolescents[J].Adv Chronic Kidney Dis，2019，26（2）：146-150.

[2]Chia R，Pandey A，Vongpatanasin W.Resistant hypertension-defining the scope of the problem[J].Prog Cardiovasc Dis，2020，63（1）：46-50.

[3]陳偶英，張穩(wěn)，簡偉雄，等.復方七芍降壓片合替米沙坦治療高血壓左心室肥厚肝腎陰虛、瘀血生風證及改善舒張功能的臨床觀察[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2014，34（6）：26-30.

[4]陳橙，段吾磊，周騫，等.復方七芍降壓片對高血壓前期患者的防治研究[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2017，15（11）：1330-1333.

[5]Jaminon A，Reesink K，Kroon A，et al.The Role of Vascular Smooth Muscle Cells in Arterial Remodeling：Focus on Calcification-Related Processes[J].Int J Mol Sci，2019，20（22）：5694.

[6]Zhang CJ，Shi YN，Liao DF，et al.Molecular mechanism of vascular remodeling in hypertension and Chinese medicine intervention[J].Acta physiol Sin，2019，71（2）：235-247.

[7]Pioli MR，de Faria AP.Pro-inflammatory Cytokines and Resistant Hypertension：Potential for Novel Treatments？[J].Curr Hypertens Rep，2019，21（12）：95.

[8]Czesnikiewicz-Guzik M，Osmenda G，Siedlinski M，et al.Causal association between periodontitis and hypertension：evidence from Mendelian randomization and a randomized controlled trial of non-surgical periodontal therapy[J].Eur Heart J，2019，40（42）：3459-3470.

[9]Verma MK，Jaiswal A，Sharma P，et al.Oxidative stress and biomarker of TNF-α，MDA and FRAP in hypertension[J].J Med Life，2019，12（3）：253-259.

[10]Toshner M，Rothman A.IL-6 in pulmonary hypertension：why novel is not always best[J].Eur Respir J，2020，55（4）：2000314.

[11]Nagai J，Balestrieri B，Fanning LB，et al.P2Y6 signaling in alveolar macrophages prevents leukotriene-dependent type 2 allergic lung inflammation[J].J Clin Invest，2019，129（12）：5169-5186.

[12]Salem M，El Azreq MA，Pelletier J，et al.Exacerbated intestinal inflammation in P2Y6 deficient mice is associated with Th17 activation[J].Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis，2019，1865（10）：2595-2605.

[13]Du X，Zhang S，Xiang Q，et al.The Role of a Selective P2Y6 Receptor Antagonist，MRS2578，on the Formation of Angiotensin II-Induced Abdominal Aortic Aneurysms[J].Biomed Res Int，2020，2020：1983940.

[14]Du X，Zhang S，Xiang Q，et al.Erratum to “The Role of a Selective P2Y6 Receptor Antagonist，MRS2578，on the Formation of Angiotensin II-Induced Abdominal Aortic Aneurysms”[J].Biomed Res Int，2020，2020：8569421.

[15]Zhong Y，Tang R，Lu Y，et al.Irbesartan may relieve renal injury by suppressing Th22 cells chemotaxis and infiltration in Ang II-induced hypertension[J].Int Immunopharmacol，2020，87：106789.

[16]Zhao J V，Schooling C M，Leung G M.Using genetics to understand the role of antihypertensive drugs modulating angiotensin-converting enzyme in immune function and inflammation[J].Br J Clin Pharmacol，2020，6：10.1111/bcp.14572.

[17]Xiao L，Tong X.Advances in molecular mechanism of vascular remodeling in pulmonary arterial hypertension[J].Journal of Zhejiang University（Medical Sciences），2019，48（1）：102-110.

[18]Sun X，Sun BL，Babicheva A，et al.Direct Extracellular NAMPT Involvement in Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling.Transcriptional Regulation by SOX and HIF-2α[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2020，63（1）：92-103.

[19]Pozzo E D，Tremolanti C，Costa B，et al.Microglial Pro-Inflammatory and Anti-Inflammatory Phenotypes Are Modulated by Translocator Protein Activation[J].Int J Mol Sci，2019，20（18）：4467.

[20]Liu W，Taso O，Wang R，et al.Trem2 promotes anti-inflammatory responses in microglia and is suppressed under pro-inflammatory conditions[J].Hum Mol Genet，2020，29（19）：3224-3248.

[21]Li WX，Qi F，Liu JQ，et al.Different impairment of immune and inflammation functions in short and long-term after ischemic stroke[J].Am J Transl Res，2017，9（2）：736-745.

（2019-10-30收稿 責任編輯：王明）