王珺 張雅月 王佳 王沖 陳科 陳信義 郎海燕

摘要 目的：基于血管活性因子特性探討“從脾論治”ITP療效機(jī)制。方法：以被動型免疫造模法建立ITP小鼠模型，以強(qiáng)的松、健脾益氣方、健脾益氣攝血方、歸脾湯為干預(yù)藥物，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測模型小鼠血清ET-1、NO、NOS3、TXA2、PGI2、vWF、VCAM-1、TM含量。結(jié)果：1）升血小板療效：與正常對照組比較，注射APS后各組小鼠外周血PLT計(jì)數(shù)明顯下降（P<0.01）;與模型對照組比較，給藥第8天各組小鼠外周血PLT計(jì)數(shù)明顯升高（P<0.01）。2）止血療效：給藥前除正常對照組外，實(shí)驗(yàn)各組均有不同程度出血傾向;給藥第6天、第8天，與模型對照組比較，實(shí)驗(yàn)各組出血分級下降（P<0.01）。3）血管促凝因子：與正常組比較，各組ET-1檢測值明顯下調(diào)（P<0.01）;與正常對照組、模型對照組比較，實(shí)驗(yàn)各組TXA2檢測值明顯上調(diào)（P<0.01）;與正常組比較，實(shí)驗(yàn)各組vWF檢測值明顯下調(diào)（P<0.01）;與正常對照組比較，實(shí)驗(yàn)各組VCAM-1檢測值明顯下調(diào)（P<0.01）。4）血管抗凝因子：與正常組比較，實(shí)驗(yàn)各組NO檢測值明顯下降（P<0.01）;除歸脾湯組外，與正常對照組比較，各組NOS3檢測值顯示明顯下調(diào)（P<0.05）;與正常對照組比較，實(shí)驗(yàn)各組PGI2檢測值明顯下調(diào)（P>0.01）;與正常對照組比較，實(shí)驗(yàn)各組TM檢測值明顯下調(diào)（P>0.05）。結(jié)論：從脾論治方升高ITP模型小鼠外周血PLT計(jì)數(shù)以及有效止血與上調(diào)血管促凝因子TXA2、VCAM-1，下調(diào)PGI2、TM檢測值，平衡促凝與抗凝因子密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞 脾主統(tǒng)血;脾不統(tǒng)血證;從脾論治;健脾益氣攝血方;免疫性血小板減少癥;血管活性因子;血管促凝因子;血管抗凝因子

Hemostatic Mechanism of “Treated From Spleen” Therapy on ITP Based on the Characteristics of Vasoactive Factors

WANG Jun1，ZHANG Yayue2，WANG Jia3，WANG Chong2，CHEN Ke4，CHEN Xinyi2，LANG Haiyan5

（1 The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310006，China; 2 Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China; 3 Henan Cancer Hospital，Zhengzhou 450008，China; 4 Shunyi Hospital，Beijing Traditional Chinese Medicine Hospital，Beijing 101300，China; 5 Dongfang Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China）

Abstract Objective：To explore the ITP hemostatic mechanism of “treating from spleen” therapy based on the characteristics of vasoactive factors.Methods：The ITP mouse model was established by passive immunomodeling method.The prednisone，Jianpi Yiqi Formula，Jianpi Yiqi Shexue Formula and Guipi Decoction were used as intervention drugs.The content of serum ET-1，NO，NOS3，TXA2，PGI2，VWF，VCAM-1 and TM of the model mice were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）.Results：1）Therapeutic effect of platelet enhancement：compared with normal control group，PLT count in peripheral blood of mice in each group was significantly decreased after APS injection （P<0.01）; compared with model control group，PLT count in peripheral blood of mice in each group was significantly increased on the 8th day of injection （P<0.01）.2）Hemostasis effect：except for the normal control group，all experimental groups had bleeding tendency to a greater or lesser extent before injection; compared with model control group，the grade of bleeding in experimental groups decreased on the 6th and 8th day of administration （P<0.01）.3）Vascular coagulation factor：compared with normal group，ET-1 detection value in each group was significantly decreased （P<0.01）; compared with normal control group and model control group，TXA2 detection values in experimental groups were significantly increased （P<0.01）.Compared with normal group，VWF detection values in experimental groups were significantly down-regulated （P<0.01）.Compared with normal control group，VCAM-1 detection value in experimental groups was significantly reduced （P<0.01）.4）Vascular anticoagulant factor：compared with normal group，NO detection value in experimental groups was significantly decreased （P<0.01）; Compared with normal control group，NOS3 values in all groups were expressively reduced （P<0.05） except for Guipi Decoction group.Compared with normal control group，PGI2 detection value in experimental groups was significantly cut down （P<0.01）.Compared with normal control group，TM detection values in experimental groups were greatly reduced （P>0.05）.Conclusion：PLT count in peripheral blood of ITP model mice from the treatment of spleen theory is increased，and effectively hemostasis is taken，which has a close correlation between increasing TXA2 and VCAM-1，PGI2 and TM detection values are decreased，and balancing pro-coagulation and anticoagulation factors.

Keywords Spleen governing blood; Splenic failure in controlling blood; Treating from spleen therapy; Jianpi Yiqi Shexue Decoction; Immune thrombocytopenia; Vasoactive factor; Vascular coagulation factor; Vascular anticoagulant factor

中圖分類號：R242;R558+.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.03.003

免疫性血小板減少癥（Immune Thrombocytopenia，ITP）是臨床常見的血液系統(tǒng)出血性疾病，主要臨床表現(xiàn)為皮膚、黏膜、牙齦、鼻黏膜出血，尿血、便血或月經(jīng)過多，或月經(jīng)期長。嚴(yán)重者可有內(nèi)臟出血。目前，對ITP發(fā)病機(jī)制尚不完全清晰，公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制是多因素導(dǎo)致的自身免疫功能紊亂[1-2]。按照中醫(yī)理論，結(jié)合慢性ITP臨床特征，其發(fā)病是由于脾氣虛弱，不能統(tǒng)攝血液而致[3]。因此，“從脾論治”是ITP的基本原則[4-5]。我們在前期臨床與實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，采用被動免疫造模法復(fù)制了ITP動物模型[6-8]，以模型小鼠外周血血小板（Platelet，PLT）計(jì)數(shù)、出血程度分級與血清內(nèi)皮素-1（Endothelin-1，ET-1）、血栓素A2（Thromboxane A2，TXA2）、一氧化氮（Nitric Oxide，NO）、一氧化氮合酶NOS3（Nitric Oxide Synthase 3，NOS3）、前列環(huán)素（Prostacyclin，PGI2）、血栓調(diào)節(jié)蛋白（Thrombomodulin，TM）、血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞血管細(xì)胞黏附分子1（Vascular Cell Adhesion Molecule1，VCAM1）為檢測指標(biāo)。試圖從血管活性因子特性角度探索“從脾論治”治療ITP出血效應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 豚鼠，100只，雌雄各半，體質(zhì)量250 g，許可證號：SCXK（陜）2012-001，購于陜西省興平市天瑞實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場，普通環(huán)境飼養(yǎng)，室溫20～25 ℃，相對濕度50%～60%;BALB/c小鼠，280只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，許可證號：SCXK（陜）2014-002，購于中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，SPF級動物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，室溫20～25 ℃，相對濕度50%～60%。其中，160只用于APS制備，120只用于造模并進(jìn)行療效機(jī)制研究（倫理審批號：XYLS2019069）。

1.1.2 藥物 實(shí)驗(yàn)用中藥浸膏由西安星華藥物研究所按照中藥新藥藥學(xué)標(biāo)準(zhǔn)制備并提供，包括：健脾益氣攝血浸膏（黃芪、黨參、茯苓、白術(shù)、阿膠、茜草、炙甘草）;健脾益氣浸膏（黃芪、黨參、茯苓、白術(shù)、炙甘草）;歸脾湯浸膏（人參、白術(shù)、當(dāng)歸、茯苓、黃芪、龍眼肉、遠(yuǎn)志、炒酸棗仁、木香、炙甘草）。強(qiáng)的松（上海晶純生化科技股份有限公司，貨號：P116562）。

1.1.3 試劑與儀器 對硝基苯磷酸二鈉（上海晶純生化科技股份有限公司，貨號：P118471）;完全弗氏佐劑（Sigma-Aldrich，美國，批號：SLBF2619V）、不完全弗氏佐劑（Sigma-Aldrich，美國，批號：SLBH7317V）;凍干酶聯(lián)A蛋白（博士德生物，批號：BST07A19B80）;疊氮化鈉（派尼化學(xué)試劑廠，批號：20140515）;明膠、吐溫（科昊生物工程有限責(zé)任公司，批號：201409）;小鼠血清ET-1、NO、NOS3、TXA2、PGI2、vWF、VCAM-1、TM試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，批號：201411）。微量高速離心機(jī)（長沙湘儀，H1650-W型）;全波長酶標(biāo)儀（Thermo Fisher，美國，型號：Multiskan GO型）;全自動動物血液分析儀（普朗，型號：XFA6130型）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 從120只小鼠尾靜脈取血，用全自動血液分析儀檢測血小板計(jì)數(shù)，并隨機(jī)分為6組，每組20只，分別為正常組、模型組、強(qiáng)的松組、歸脾湯組、健脾益氣組和健脾攝血組。按照經(jīng)典被動免疫造模法制備抗小鼠血小板血清。制備步驟如下：160只BALB/c小鼠麻醉取抗凝全血，梯度離心（1 100 r/min，10 min;3 000 r/min，10 min，離心半徑：6 cm）得到血小板，用PBS洗滌2次，重懸，計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度至2.5×106/mL，與等量完全弗式佐劑和不完全弗式佐劑分別混合均勻做抗原。含完全弗式佐劑抗原于0周注射于豚鼠足掌、背及皮下，共5點(diǎn)，合計(jì)1 mL;含不完全弗式佐劑抗原分別于1、2、4周按上述相同部位、點(diǎn)數(shù)、劑量注射。第5周從豚鼠心臟取不抗凝全血，靜置后，離心分離獲得豚鼠抗小鼠血小板血清（GP-APS）。置于56 ℃水浴30 min滅活，紅細(xì)胞吸附，用生理鹽水稀釋成1∶4濃度備用。分離所得小鼠血小板用PBS洗滌3次，并調(diào)整濃度至6×104/μL。取50 μL血小板懸液加入酶標(biāo)孔中，以560×g離心13 min。加入緩沖液（0.2%明膠，0.1%疊氮化鈉，0.5%吐溫，0.15 mol/LPBS）于4 ℃孵育過夜，洗滌。加入50 μL待測血清，37 ℃孵育1 h，洗滌。加入100 μL酶聯(lián)A蛋白，于22 ℃孵育45 min，洗滌4次，加入200 μL對硝基苯磷酸二鈉（溶于二乙醇胺緩沖液中，濃度1.5 mg/mL），于37 ℃孵育30 min，加入50 μL的1N氫氧化鈉中止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在405 nm波長下測定OD值。

1.2.2 給藥方法 除正常組按100 μL/20 g生理鹽水腹腔注射外，實(shí)驗(yàn)各組按100 μL/20 g劑量注射APS，1次/d至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。注射APS第8天，除模型組外，其余各組均按照0.1 mL/10 g體積灌胃給藥，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

外周血PLT計(jì)數(shù)檢測：注射APS前、注射后48 h、第8天（開始給藥）、第12天、第15天，分別從造模小鼠尾靜脈取血，用全自動血液分析儀檢測模型小鼠外周血血小板計(jì)數(shù)。

出血程度分級觀察：參照2010年衛(wèi)生部醫(yī)政司發(fā)布的《免疫性血小板減少性紫癜臨床路徑》[9]，結(jié)合動物實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)，將出血程度分4級。1）0級：無出血現(xiàn)象。2）Ⅰ級：注射部位輕度出血，其他部位有散在出血點(diǎn)。3）Ⅱ級：注射部位明顯出血，并見有其他部位瘀斑、瘀點(diǎn)。4）Ⅲ級：注射部位嚴(yán)重出血，皮膚大量瘀斑、瘀點(diǎn)，或皮膚發(fā)黑或破潰。注意在觀察出血程度時，要以出血面積與出血點(diǎn)密集程度描述，并關(guān)注出血部位、出血開始時間、止血時間、出血色澤、形狀等。觀察時間點(diǎn)為注射GP-APS第8天（用藥前）、注射GP-APS第14天（用藥第6天）、注射GP-APS第16天（實(shí)驗(yàn)結(jié)束）3個時間點(diǎn)動態(tài)觀察出血分級變化。

血管活性因子檢測：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組隨機(jī)取12只小鼠斷頸處死，腹主動脈血，靜置后離心，收集血清，按照酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒說明書方法進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測。其中，6只小鼠血清用于血管促凝活性因子（ET-1、TXA2、vWF、VCAM-1）檢測;6只小鼠血清用于血管抗凝活性因子（NO、NOS3、PGI2、TM）檢測。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中計(jì)數(shù)資料以（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗血清效價測定

用酶標(biāo)儀在405 nm波長下測定OD值，APS血清組OD值平均為0.300，空白孔OD值平均為0.163，相差約2倍（P<0.01），證明血清效價正常[4]。

2.2 外周血小板檢測

分別從120只小鼠尾靜脈取血，按比例稀釋后，用全自動動物血液分析儀檢測外周血小板計(jì)數(shù)，結(jié)果見表1。

從表1可以看出：1）注射APS前，各組小鼠外周血PLT計(jì)數(shù)組間比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。2）注射APS后48 h至第8天，實(shí)驗(yàn)各組小鼠外周血PLT計(jì)數(shù)與正常組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。表明已經(jīng)成功建立血小板減少模型。3）注射APS第8天（開始給藥）到12天，實(shí)驗(yàn)各組小鼠外周血PLT計(jì)數(shù)與正常組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。證明實(shí)驗(yàn)小鼠外周血PLT計(jì)數(shù)依然處于低水平。4）注射后第15天（給藥第8天），模型組小鼠外周PLT計(jì)數(shù)與正常組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），仍處于低水平。給藥各組小鼠外周PLT與正常組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），證明實(shí)驗(yàn)藥物可明顯提高實(shí)驗(yàn)小鼠外周PLT計(jì)數(shù)。其中，強(qiáng)的松對照、健脾攝血組與歸脾湯對照組、健脾益氣組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。表明強(qiáng)的松對照、健脾攝血組提升造模小鼠外周血PLT具有明顯優(yōu)勢。

2.3 出血程度分級觀察

按照觀測時間點(diǎn)，以出血分級標(biāo)準(zhǔn)，每組隨機(jī)觀察10只小鼠出血分級變化，結(jié)果見表2。

對表2進(jìn)一步分析表明：1）注射APS第8天，除正常對照組外，實(shí)驗(yàn)各組出血程度組間比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，P=0.998，具有可比性。說明注射GP-APS后各組小鼠均有不同程度出血傾向。2）注射APS第8天開始給藥，藥物干預(yù)第6天，各組出血等級明顯下降，與模型對照組比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.014）。下降幅度從大到小依次為強(qiáng)的松組（P=0.002）、健脾益氣攝血組（P=0.003）、歸脾湯對照組（P=0.003）、健脾益氣組（P=0.021）。藥物干預(yù)各組組間比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。3）藥物干預(yù)第8天，各組出血等級明顯下降，與模型對照組比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。出血等級下降幅度從大到小依次為強(qiáng)的松組（P=0.000）、健脾攝血組（P=0.000）、歸脾湯對照組（P=0.001）、健脾益氣組（P=0.001）。藥物干預(yù)各組組間比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 血管促凝活性因子檢測

血管促凝活性因子包括血管收縮與促凝血因子，檢測結(jié)果見表3。

對表3結(jié)果分析如下：1）ET-1：實(shí)驗(yàn)各組與正常組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），顯示檢測值明顯下降。2）TXA2：實(shí)驗(yàn)各組與正常對照組、模型對照組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;組間比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。3）vWF：實(shí)驗(yàn)各組與正常組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），顯示檢測值明顯下降。4）VCAM-1：實(shí)驗(yàn)各組與正常對照組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;從脾論治各組強(qiáng)的松組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;組間比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.5 血管抗凝活性因子檢測

血管抗凝活性因子包括血管舒張與抗凝血因子，檢測結(jié)果見表4。

對表4結(jié)果分析如下：1）NO：實(shí)驗(yàn)各組與正常組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），顯示檢測值下降;組間比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。2）NOS3：除歸脾湯組外，各組檢測值與正常對照組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），顯示檢測值下降;組間比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。3）PGI2：健脾

各組與正常對照組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.01）;組間比較結(jié)果顯示，健脾益氣攝血組與模型對照組、強(qiáng)的松對照組、健脾益氣組、歸脾湯組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。4）TM：實(shí)驗(yàn)各組與正常對照組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。健脾益氣組、健脾益氣攝血組與模型對照組、強(qiáng)的松對照組歸脾湯對照組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

從骨髓巨核細(xì)胞分化產(chǎn)生的血小板具有凝血/止血與修復(fù)破損的血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種功能。血小板表面糖衣能吸附血漿蛋白和凝血因子Ⅲ，血小板內(nèi)顆粒內(nèi)含有與凝血相關(guān)的物質(zhì)。當(dāng)血管受損害或破裂時，就會刺激血小板由靜止相變?yōu)闄C(jī)能相，急速發(fā)生變形，表面黏度增大，凝聚成團(tuán)。同時，在血小板表面第Ⅲ因子作用下，使血漿內(nèi)凝血酶原變?yōu)槟?，又催化纖維蛋白原變成絲狀纖維蛋白，與血細(xì)胞共同形成凝血塊以止血。同時，血小板顆粒物質(zhì)釋放，則進(jìn)一步促進(jìn)凝血/止血。血小板具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、參與內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)等功效。因此，當(dāng)患者外周血小板計(jì)數(shù)低于50×109/L則有出血發(fā)生的風(fēng)險[10]。說明ITP出血與患者外周血PLT數(shù)量及其質(zhì)量密切相關(guān)。在臨床實(shí)際中，許多ITP特別是慢性ITP患者，雖然外周血PLT計(jì)數(shù)低于50×109/L，甚至低于安全水平（30×109/L），但出血傾向并不明顯。有些患者經(jīng)相關(guān)治療后外周血PLT依然處于較低水平，可出血癥狀并不明顯。顯然ITP患者外周血PLT減少并不是出血的唯一因素。很可能是參與凝血機(jī)制多個環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果。其中，血管及其血管分泌的活性因子發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[11]。血管是生物體運(yùn)送血液的管道，除維持血液與組織間物質(zhì)交換外，正常血管中存在大量的活性物質(zhì)，以控制血管生理狀態(tài)。特別是血管內(nèi)皮細(xì)胞是分泌、合成和釋放血管活性物質(zhì)的重要場所，這些活性物質(zhì)具有舒縮血管、調(diào)控血管張力與促進(jìn)血液凝固的多重效果。

舒張血管活性因子與抗凝機(jī)制關(guān)系密切，主要包括：1）前列腺素：前列腺素（Prosta Glandin，PG）及其代謝后的衍生物如前列環(huán)素（Prostaglandin，PGI2）。其對血液凝固作用主要是導(dǎo)致血管舒張，抑制血小板聚集與調(diào)節(jié)血小板活化[12]。2）一氧化氮與一氧化氮合酶3：一氧化氮（Nitric Oxide，NO）與一氧化氮合酶3（Nitric Oxide Synthase-3，NOS3）主要作用于平滑肌細(xì)胞，使其松弛，擴(kuò)張血管，并會很快滲透出細(xì)胞膜擴(kuò)散進(jìn)入血液，作用于血小板細(xì)胞，并降低血小板活性，抑制其凝集和向血管內(nèi)皮黏附[13]。3）血栓調(diào)節(jié)蛋白：血栓調(diào)節(jié)蛋白（Thrombomodulin，TM）是使凝血酶由促凝轉(zhuǎn)向抗凝的重要血管內(nèi)凝血抑制因子，主要是調(diào)節(jié)機(jī)體凝血與抗凝血動態(tài)平衡[14]。

收縮血管活性因子與凝血機(jī)制密切相關(guān)，主要包括：1）血管內(nèi)皮素：血管內(nèi)皮素（Endothelin，ET）是調(diào)節(jié)心血管功能的重要因子，對維持血管張力與心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)起重要作用。其中，血管內(nèi)皮素1（Endothelin-1，ET-1）是迄今為止發(fā)現(xiàn)作用最強(qiáng)的縮血管因子，可引起的血管特別是微小血管收縮有利于血液凝固和止血[15]。2）血栓素A2：血栓素A2（Thromboxane，TXA2）是一強(qiáng)血管收縮因子，可以激活血小板、使其聚集，有利于修復(fù)組織損傷和止血[16]。3）血管性血友病因子：血管性血友病因子：（von Willebrand Factor，vWF）是一種有黏附性的多聚體糖蛋白。與血小板膜GPⅠb-Ⅸ復(fù)合物及細(xì)胞內(nèi)皮下膠原結(jié)合，介導(dǎo)血小板在血管損傷部位黏附以及與因子凝血因子Ⅷ結(jié)合來有效止血[17]。此外，vWF也能結(jié)合GPⅡb-Ⅲa，參與血小板聚集過程。4）血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1：血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（Vascular Cell Adhesion Molecule1，VCAM1）是一種細(xì)胞黏附分子，主要參與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用。其活性降低會導(dǎo)致血管通透性增加，組織缺血與缺氧，增加血液外滲[18]。

控制血管張力的舒縮活性因子是一對矛盾的統(tǒng)一體。一般認(rèn)為，血管舒張活性因子具有抗凝效應(yīng)，既是預(yù)防血栓形成的關(guān)鍵因子，也是影響血液凝固/止血的重要物質(zhì);血管收縮活性因子具有促進(jìn)凝血效應(yīng)，既是血栓形成的危險因素，也是促進(jìn)血液凝固/止血的關(guān)鍵。二者的動態(tài)平衡在不同的疾病中擔(dān)當(dāng)不同角色。當(dāng)機(jī)體發(fā)生血小板減少特別是免疫性血小板減少癥，紊亂的免疫機(jī)制可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血管分泌、合成和釋放血管活性因子比例失調(diào)，直接或間接影響了血管舒縮與凝血功能。因此，有效的調(diào)節(jié)血管舒縮活性因子，能在ITP患者低血小板數(shù)值情況下，預(yù)防出血風(fēng)險或達(dá)到止血效果。有基于此，我們在臨床實(shí)踐中，確立了“從脾論治”ITP的重要治則[19]，擬定了“從脾論治”的健脾益氣攝血方。前期臨床試驗(yàn)證明，該方可明顯提升ITP患者外周血PLT計(jì)數(shù)，改善出血與相關(guān)臨床癥狀[20-21]。動物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，該方能夠提升模型小鼠外周血PLT計(jì)數(shù)與良好的止血效果[22-25]，并明確了部分效應(yīng)機(jī)制[26-28]。為進(jìn)一步探討“從脾論治”ITP療效機(jī)制，我們以健脾益氣攝血方（四君子湯加炙黃芪、阿膠、茜草）為標(biāo)準(zhǔn)觀察藥物，選擇健脾益氣方（四君子湯加炙黃芪）、歸脾湯原方為“從脾論治”方，觀察三方對ITP動物模型外周血PLT計(jì)數(shù)、出血程度分級與血管活性因子影響。研究結(jié)果顯示：1）升血小板療效：注射APS后48 h至第8天（給藥時間點(diǎn)），與正常對照組比較，實(shí)驗(yàn)各組小鼠外周血PLT計(jì)數(shù)明顯下降，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;給藥第8天與模型對照組比較，實(shí)驗(yàn)各組小鼠外周血PLT計(jì)數(shù)明顯升高，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。其中，強(qiáng)的松對照、健脾攝血組與歸脾對照、健脾益氣組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。證明強(qiáng)的松對照、健脾攝血組提升造模小鼠外周血PLT具有明顯優(yōu)勢。2）止血療效：注射APS第8天（給藥時間點(diǎn)），除正常對照組外，實(shí)驗(yàn)各組均有不同程度出血傾向;藥物干預(yù)第6天、第8天，與模型對照組比較，實(shí)驗(yàn)各組出血分級明顯下降，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.014、P=0.000）。下降幅度從大到小依次為強(qiáng)的松組（P=0.002、0.000）、健脾益氣攝血組（P=0.003、0.000）、歸脾湯對照組（P=0.003、0.001）、健脾益氣組（P=0.021、0.001）。各組組間比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。3）血管促凝因子：ET-1：實(shí)驗(yàn)各組ET-1檢測值與正常組比較明顯下調(diào)，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;TXA2檢測值與正常對照組、模型對照組比較明顯上調(diào)，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;vWF檢測值與正常組比較明顯下調(diào)，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;VCAM-1檢測值與正常對照組比較明顯下調(diào)，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），從脾論治各組與強(qiáng)的松對照組、模型對照組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明從脾論治各組有提升VCAM-1優(yōu)勢。4）血管抗凝因子：實(shí)驗(yàn)各組NO檢測值與正常組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），顯示檢測值下降;組間比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;除歸脾湯組外，各組NOS3檢測值與正常對照組比較顯示明顯下調(diào)，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），組間比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;健脾各組PGI2檢測值與正常對照組比較明顯下調(diào)，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.01）;組間比較結(jié)果顯示，健脾益氣攝血組與模型對照組、強(qiáng)的松對照組、健脾益氣組、歸脾湯組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;TM檢測值與正常對照組比較明顯下調(diào)，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。健脾益氣組、健脾益氣攝血組與模型對照組、強(qiáng)的松對照組、歸脾湯對照組比較下降明顯，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論認(rèn)為，“從脾論治”方除具有升高ITP模型小鼠外周血PLT計(jì)數(shù)、降低出血分級效果外，上調(diào)血管促凝因子TXA2、VCAM-1，下調(diào)下調(diào)PGI2、TM檢測值，平衡促凝與抗凝活性因子的動態(tài)平衡可能是有效止血機(jī)制之一。

參考文獻(xiàn)

[1]熊婷婷，謝曉恬.免疫性血小板減少癥的細(xì)胞免疫致病機(jī)制研究最新進(jìn)展[J].中國小兒血液與腫瘤雜志，2019，24（6）：321-327.

[2]Kühne T，Berchtold W，Michaels LA，et al.Newly diagnosed immune thrombocytopenia in children and adults：a comparative prospective observational registry of the intercontinental cooperative immune thrombocytopenia study group[J].Haematologica，2011，96（12）：1831-1837.

[3]劉元梅，周延峰.中醫(yī)治療原發(fā)免疫性血小板減少癥研究進(jìn)展[J].中國民族民間醫(yī)藥，2018，27（1）：57-59.

[4]吳玉霞，袁忠，馬西虎，等.從脾論治慢性原發(fā)性免疫性血小板減少性癥臨床療效觀察[J].世界中醫(yī)藥，2016，11（9）：1782-1785.

[5]李天天，侯麗，張雅月，等.從脾論治免疫性血小板減少性紫癜的理論基礎(chǔ)與臨床實(shí)踐[J].北京中醫(yī)藥，2015，34（4）：304-306.

[6]王浩瀾，劉寶山.免疫性血小板減少性紫癜動物模型建立的研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2018，26（1）：273-277.

[7]郎海燕，褚雨霆，馬薇，等.免疫性血小板減少癥病證結(jié)合動物模型研究[J].中醫(yī)藥信息，2017，34（1）：39-43.

[8]何昊，徐玥，秦蓓，等.免疫性血小板減少性紫癜動物模型建立方法與應(yīng)用評價[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，16（10）：1971-1974.

[9]陳銳.免疫性血小板減少性紫癜臨床路徑（2010年版）[J].中國社區(qū)醫(yī)師，2011，27（11）：17.

[10]余鋼成.22例ITP臨床出血風(fēng)險的分析[J].江西醫(yī)藥，2010，45（8）：801-802.

[11]李偉，張咪娟，王琰，等.血小板活化因子和血管內(nèi)皮活性標(biāo)志物與腔隙性腦梗死的關(guān)系[J].華西醫(yī)學(xué)，2019，34（10）：1143-1147.

[12]蔡大振，張霞.當(dāng)歸對高血壓病患者中醫(yī)證候療效、血清炎性因子、血漿血栓素及前列環(huán)素水平的影響研究[J].中醫(yī)臨床研究，2019，11（32）：37-39.

[13]全守東，于亞杰，梁志霞.一氧化氮吸入聯(lián)合米力農(nóng)治療新生兒持續(xù)性肺動脈高壓的療效及對血流動力學(xué)、血小板聚集功能的影響[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2020，19（1）：89-91.

[14]徐靜，丁艷妮，楊敏，等.聯(lián)合檢測D二聚體與活化部分凝血活酶時間、凝血酶調(diào)節(jié)蛋白對乳腺癌患者術(shù)后下肢深靜脈血栓形成的價值[J].血栓與止血學(xué)，2019，25（6）：952-953.

[15]武曲星，王攀，王冬芝，等.免疫性血小板減少癥氣不攝血證小鼠模型血管內(nèi)皮活性物質(zhì)變化動態(tài)研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2019，26（12）：56-61.

[16]張穎，劉紅旭，康群甫，等.參元丹優(yōu)化方對動脈粥樣硬化小鼠胰島素抵抗及血清血栓素A2/前列環(huán)素比值和DNA甲基化水平的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2018，25（8）：53-57.

[17]常方圓，馮澤瑞，王志敏.冠心病病人血清vWF、GDF-15、PCSK-9、APN的變化特點(diǎn)及與冠狀動脈病變程度的關(guān)系[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2019，17（22）：3570-3573.

[18]朱翔鴻，丁秦超，賴尚磊，等.激活自噬改善炎性因子誘導(dǎo)的血管細(xì)胞粘附分子1的表達(dá)[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2019，46（13）：2419-2423.

[19]吳曉勇，陳廣雷，王云龍，等.基于脾統(tǒng)血論治免疫性血小板減少癥[J].遼寧中醫(yī)雜志，2017，44（3）：659-661.

[20]王珺，張?zhí)N，張玲，等.健脾益氣攝血顆粒治療免疫性血小板減少癥臨床療效觀察[J].中華中醫(yī)藥雜志，2018，33（12）：5700-5704.

[21]郎海燕，張玲，王佳，等.健脾益氣攝血顆粒影響免疫性血小板減少癥患者出血與免疫功能研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2019，48（9）：45-49.

[22]李瀟，朱長樂，趙寧，等.健脾益氣攝血方及其拆方對辛伐他汀誘導(dǎo)斑馬魚腦出血的防治作用研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，40（12）：1004-1010.

[23]張雅月，田劭丹，祁爍，等.健脾益氣攝血方及其拆方對辛伐他汀誘導(dǎo)斑馬魚心臟出血模型血流量影響研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2017，14（36）：9-12，24.

[24]褚雨霆，朱曉宇，張雅月，等.健脾益氣攝血方對辛伐他汀誘導(dǎo)斑馬魚出血模型的止血效果研究[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2017，25（3）：853-859.

[25]何昊，孫艷平，鄭蕾，等.健脾益氣攝血方對ITP模型小鼠外周血象的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2015，43（6）：22-24.

[26]陳科，戴欣媛，趙寧，等.脾不統(tǒng)血證相關(guān)疾病與血液神經(jīng)遞質(zhì)變化關(guān)系研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2018，45（2）：245-248.

[27]徐玥，何昊，鄭蕾，等.健脾攝血方對ITP小鼠血清神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)影響研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2017，12（7）：928-932.

[28]何昊，徐玥，鄭蕾，等.健脾益氣攝血方對ITP模型小鼠血清SIgA和β-EP影響研究[J].中醫(yī)藥信息，2015，32（5）：47-49.

（2021-01-05收稿 責(zé)任編輯：徐穎）