胡 璇，王鴻發(fā)，于福來*，元 超，黃 梅，張影波，陳振夏，王 丹，龐玉新

1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所 海南省艾納香工程技術(shù)研究中心，海南 ?？?571101

2.廣東藥科大學(xué)中藥資源學(xué)院，廣東 云浮 527300

3.寧夏泰益欣生物科技有限公司，寧夏 銀川 750001

艾納香Blumea balsamifera(L.)DC.是菊科艾納香屬多年生草本植物，在黎族、苗族等少數(shù)民族藥用歷史悠久，具有祛風(fēng)除濕、清熱解毒、調(diào)經(jīng)、鎮(zhèn)痛等功效[1]。艾納香含有豐富的揮發(fā)油成分，包括L-龍腦、β-石竹烯、樟腦、α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬醇等[2]，這些化學(xué)成分是艾納香發(fā)揮修復(fù)皮膚黏膜損傷[3]、抗炎[4]、抑菌[5]等作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)；艾納香中還含有大量黃酮類成分，包括黃酮醇類、二氫黃酮類、查耳酮類等化合物[6]，是艾納香抗氧化[7]、保肝[8]、止血凝血[8]、抗腫瘤[9]等作用的主要有效成分。

隨著艾納香在醫(yī)藥、日化用品等領(lǐng)域應(yīng)用日益廣泛，其需求量不斷攀升，其藥材從野生到栽培分布區(qū)域也日趨擴(kuò)大分散，從主產(chǎn)區(qū)貴州輻射周邊熱帶地區(qū)，包括海南、廣東、廣西、云南等地區(qū)均有艾納香資源的分布[10]，而因?yàn)橥寥?、光照、水分、CO2濃度等因素的不同造成的地域差異性也成為艾納香整體質(zhì)量評(píng)價(jià)需要考慮的因素。目前大部分的文獻(xiàn)資料顯示艾納香多以揮發(fā)油類成分或黃酮類成分艾納香素[11-12]，或者以單一粗提物總黃酮或總揮發(fā)油進(jìn)行藥材的整體質(zhì)量控制[13-14]，缺乏多手段多指標(biāo)成分的系統(tǒng)性研究。本研究采用高效液相色譜法，建立艾納香的HPLC 指紋圖譜獲得化學(xué)數(shù)據(jù)，從艾納香指紋圖譜特征成分的角度，結(jié)合聚類分析（HCA)、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）等化學(xué)模式識(shí)別方法分析比較不同產(chǎn)區(qū)艾納香質(zhì)量差異。在課題組前期提取分離得到的艾納香單體成分基礎(chǔ)上[15]，指認(rèn)并測(cè)定了5 個(gè)黃酮類成分的含量，通過多成分含量測(cè)定進(jìn)一步尋找產(chǎn)區(qū)差異性成分，為全面、系統(tǒng)地評(píng)價(jià)艾納香藥材質(zhì)量提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

34 批不同產(chǎn)區(qū)的艾納香藥材收集于廣東、廣西、貴州和海南4 個(gè)省份，經(jīng)中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所于福來副研究員鑒定為艾納香Blumea balsamifera(L.)DC.，藥材來源信息見表1。本研究所需5 個(gè)二氫黃酮對(duì)照品均來自作者所在課題組前期通過制備色譜從艾納香中系統(tǒng)分離純化獲得的單體化合物[15]，分別為3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮、圣草酚、3,3′,5-三羥基-4′,7-二甲氧基二氫黃酮、艾納香素、sakuranrtin。乙腈、甲醇為色譜純（賽默飛世爾科技有限公司），水為超純水，其他試劑均為分析純。

表1 艾納香樣品信息Table 1 Sources of 34 batches of B.balsamifera samples

1.2 儀器

Agilent1260 高效液相色譜儀（G1311C 四元泵，G1316A 柱溫箱，G1329B 全自動(dòng)進(jìn)樣器，G1315D二極管陣列檢測(cè)器），Agilent ChemStation 工作站；SKQ-600DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；德國(guó)Merck Millipore/Direct-Q5 UVR 超純水系統(tǒng)（廣州市東方科苑進(jìn)出口有限公司）；ME54E電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜及含量測(cè)定色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.5%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，15%～22% A；15～21 min，22%～24% A；21～30 min，24%～30% A；30～45min，30%～33% A；45～55 min，33%～38% A；55～70 min，38%～55% A）；檢測(cè)波長(zhǎng)285 nm；柱溫35 ℃；體積流量0.9 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮、圣草酚、3,3′,5-三羥基-4′,7-二甲氧基二氫黃酮、艾納香素、sakuranrtin 適量配制成質(zhì)量濃度分別為1.02、0.241、0.203、0.205、0.016 mg/mL 的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 34 份不同產(chǎn)區(qū)艾納香葉樣品粉碎后過30 目篩，精密稱取樣品0.5 g 于具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理45 min，放至室溫，再稱定質(zhì)量，用90%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系及定量限、檢測(cè)限 精密量取3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮、圣草酚、3,3′,5-三羥基-4′,7-二甲氧基二氫黃酮、艾納香素混合對(duì)照品儲(chǔ)備液和sakuranrtin 對(duì)照品儲(chǔ)備液用倍比稀釋的方法以90%甲醇制成系列對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，所得溶液10 μL 進(jìn)樣測(cè)定其峰面積。以峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程。按“2.2.1”項(xiàng)下方法配制混合對(duì)照品溶液用90%甲醇逐級(jí)稀釋，按照信噪比（S/N）為3∶1 的對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為檢出限（LOD），以S/N為10∶1 的對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度確定為定量限（LOQ），結(jié)果見表2。

表2 5 種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍、定量限和檢測(cè)限Table 2 Calibration curves,correlation coefficients,linear ranges,limit of quantitation and detection of five constituents

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密稱取艾納香樣品（GD-1）粉末0.5 g，依照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄其指紋圖譜，以3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮為參比峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，相對(duì)保留時(shí)間的RSD 在0.06%～0.29%，各共有峰的相對(duì)峰面積的RSD 在0.04%～1.50%。精密吸取混合對(duì)照品溶液，計(jì)算3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮、圣草酚、3,3′,5-三羥基-4′,7-二甲氧基二氫黃酮、艾納香素、sakuranrtin 峰面積的RSD分別為0.11%、0.09%、0.11%、0.10%、0.20%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取艾納香樣品（GD-1）粉末，依照“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，記錄其指紋圖譜，以3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮為參比峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，相對(duì)保留時(shí)間的RSD 在0.03%～0.18%，各共有峰的相對(duì)峰面積的RSD 在0.27%～3.12%。計(jì)算3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮、圣草酚、3,3′,5-三羥基-4′,7-二甲氧基二氫黃酮、艾納香素、sakuranrtin 峰面積的RSD 分別為2.98%、2.64%、2.52%、2.46%、2.59%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取艾納香樣品（GD-1）供試品溶液，分別于供試品溶液制備后0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄其指紋圖譜，以3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮為參比峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，相對(duì)保留時(shí)間的RSD 在0.03%～0.18%，各共有峰的相對(duì)峰面積的RSD 在0.08%～2.75%。計(jì)算3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮、圣草酚、3,3′,5-三羥基-4′,7-二甲氧基二氫黃酮、艾納香素、sakuranrtin 峰面積的RSD 分別為0.28%、0.33%、0.19%、0.21%、2.32%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已測(cè)定的艾納香樣品粉末約0.5 g，置10 mL 量瓶中，分別精密加入配制好適量質(zhì)量濃度的3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮、圣草酚、3,3′,5-三羥基-4′,7-二甲氧基二氫黃酮、艾納香素、sakuranrtin 各自0.5、1.0、1.5 mL，每個(gè)體積重復(fù)3 次，加入一定量90%甲醇定容至10 mL，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算平均加樣回收率和RSD 值。結(jié)果顯示3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮、圣草酚、3,3′,5-三羥基-4′,7-二甲氧基二氫黃酮、艾納香素、sakuranrtin 平均加樣回收率分別為101.1%、100.7%、100.4%、100.9%、99.6%，RSD 分別為1.21%、2.15%、2.44%、1.47%、2.21%。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 指紋圖譜共有模式的建立及相似度評(píng)價(jià) 將4 個(gè)產(chǎn)區(qū)34 批艾納香樣品在檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm 處的色譜圖以AIA 格式導(dǎo)出并導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2004 版）軟件，以GD-1 編號(hào)樣品的指紋圖譜作為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，時(shí)間寬度為0.5 進(jìn)行多點(diǎn)校正和色譜峰匹配，得到艾納香疊加指紋圖譜（圖1）。保留時(shí)間為20.78 min 的7 號(hào)色譜峰分離良好且為所有樣品共有，故確定選取作為參照峰，其余特征峰以1、2、3……N 進(jìn)行標(biāo)定，共標(biāo)定15 個(gè)共有特征峰，見圖2-A。經(jīng)與對(duì)照品對(duì)比，其中7、8、11、13、15 號(hào)共有峰分別對(duì)應(yīng)3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮、圣草酚、3,3′,5-三羥基-4′,7-二甲氧基二氫黃酮、艾納香素、sakuranrtin，艾納香對(duì)照指紋圖譜和混合對(duì)照液的對(duì)照色譜圖分別見圖2-A 和圖2-B。

圖1 34 批不同產(chǎn)區(qū)艾納香樣品的HPLC 疊加指紋圖譜Fig.1 Superposition HPLC fingerprints of 34 batches of B.balsamifera samples from different regions

圖2 艾納香對(duì)照指紋圖譜(A)和混合對(duì)照品溶液的HPLC圖(B)Fig.2 HPLC comparison fingerprint(A)and mixed reference substances(B)of B.balsamifera

將4 個(gè)產(chǎn)區(qū)34 批不同產(chǎn)區(qū)艾納香藥材圖譜與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，相似度結(jié)果見表3。與對(duì)照指紋圖譜相比，廣東和廣西相似度比較高，除了樣品GD-2、GX-2、GX-10 相似度低于0.90，其他樣品相似度結(jié)果均大于0.90，而貴州和海南具有較低的相似度，除了樣品GZ-1 和GZ-7 其他貴州產(chǎn)樣品相似度結(jié)果均低于0.90，海南相似度在0.433～0.894。結(jié)果表明不同產(chǎn)區(qū)的艾納香樣品藥材質(zhì)量是存在一定地域差異性。廣東和廣西化學(xué)組分特征更為相似，貴州和海南的化學(xué)組分特征較為相似，這幾個(gè)產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)出的組分差異集中在21～29 min 和34～38 min，每個(gè)樣品的圖譜中貴州和海南0～40 min 段化學(xué)組分色譜峰信息量顯著多于廣東和廣西，且不同產(chǎn)區(qū)色譜峰面積大小上也是存在差異，廣東和廣西在50～70 min 段化學(xué)組分14 號(hào)峰峰面積顯著高于貴州和海南，而貴州和海南部分樣品在20～30 min段化學(xué)組分7號(hào)（3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮）和8 號(hào)峰（圣草酚）峰面積顯著高于廣東和廣西。

表3 34 批艾納香樣品指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)Table 3 Similarity evaluation of 34 batches of B.balsamifera samples

2.4.2 聚類分析（HCA） 將艾納香各個(gè)共有峰的峰面積相對(duì)于參照峰7 號(hào)（3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮）峰面積進(jìn)行量化，得到15×34 階數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入IBM SPSS 19.0 軟件中，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行聚類分析，采用Ward 聯(lián)結(jié)法，歐式距離平方和作為樣本測(cè)度，聚類樹狀圖見圖3。根據(jù)聚類結(jié)果可以看出，當(dāng)判別距離為10 時(shí)，34 批艾納香樣品大致樣品可以分成3 類，I 類（9 份廣西、8 份貴州和6 份海南），II 類（4 份廣東、3 份廣西和1份貴州），III 類（3 份海南），這些產(chǎn)區(qū)依舊存在個(gè)體差異較大的樣品。當(dāng)聚類距離為5 時(shí)，34 批樣品可以劃分為5 大類，I 類（8 份貴州，7 份廣西和1份海南樣品），II 類（5 份海南和2 份廣西），III 類（4 份廣東，3 份廣西和1 份貴州），Ⅳ類（2 份海南），V（1 份海南），4 個(gè)產(chǎn)區(qū)的艾納香樣品依舊比較分散，但是2 次結(jié)果的第I 類仍能將大部分的貴州和廣西樣品聚為一類，說明貴州和廣西的大部分樣品具有一定的相似性，相對(duì)于其他產(chǎn)區(qū)樣品海南產(chǎn)樣品自身存在較大差異。

圖3 艾納香樣品聚類分析樹狀圖Fig.3 Custer analysis of B.balsamifera samples

2.4.3 主成分分析（PCA）[16]進(jìn)一步探討4 個(gè)產(chǎn)區(qū)艾納香化學(xué)成分之間的差異，將上述15×34 階矩陣導(dǎo)入SIMCA-P＋14.1 軟件中，以15 個(gè)共有色譜峰的相對(duì)峰面積值作為變量，采用非監(jiān)督模式識(shí)別方法PCA 來觀察不同產(chǎn)區(qū)34 份艾納香樣品的自然聚集。模型擬合選擇4 個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率為82.90%，模型擬合能力良好，34 批艾納香樣品的三維PCA 矩陣圖見圖4。可以看出海南產(chǎn)區(qū)艾納香樣品化學(xué)成分的量上與其他產(chǎn)區(qū)樣品具有明顯差異，基本能與其他產(chǎn)區(qū)區(qū)分，海南樣品的分散性與聚類的結(jié)果基本一致，其中HN-6 單獨(dú)一類，HN-4 和HN-3 一類，HN-5、HN-1、HN-9、HN-2 一類，但是其他產(chǎn)區(qū)樣品并不能很好的區(qū)分開來。除了GZ-9、GZ-2、GX-6、GX-1、GX-5，大部分貴州、廣西以及廣東樣品具有交叉，化學(xué)成分含量上具有一定的相似性。

圖4 34 批艾納香樣品的PCA 得分圖Fig.4 PCA scores plots of B.balsamifera samples

2.4.4 偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）[17]在PCA 的基礎(chǔ)上進(jìn)一步選擇有監(jiān)督模式的OPLS-DA對(duì)不同產(chǎn)區(qū)34 份艾納香樣品進(jìn)行分析，篩選出對(duì)引起組間差異貢獻(xiàn)率較大的成分。在建立的OPLS-DA 模型中，累計(jì)解釋能力參數(shù)R2X和R2Y分別為0.893 和0.665，預(yù)測(cè)能力參數(shù)（Q2）為0.446，提示本實(shí)驗(yàn)所建立OPLS-DA 模型的穩(wěn)定性及預(yù)測(cè)能力較好[18]。由OPLS-DA 得分圖可知（圖5），4個(gè)產(chǎn)區(qū)的艾納香藥材基本上可以分為4 類，8 份海南樣品單獨(dú)可以分為一類，4 份廣東樣品和1 份廣西樣品可聚為一類，9 份貴州樣品、7 份廣西樣品和1 份海南樣品聚為一類，3 份廣西樣品單獨(dú)聚為一類。每個(gè)產(chǎn)區(qū)大部分樣品各自分布于不同的象限，不同產(chǎn)區(qū)之間有交叉樣品，主要表現(xiàn)在大部分的貴州和廣西的樣品可聚為一類，這與聚類分析的結(jié)果基本一致。每個(gè)產(chǎn)區(qū)樣品之間的離散程度較大，結(jié)果提示每個(gè)產(chǎn)區(qū)的樣品本身質(zhì)量就存在較大差異，尤其是海南和廣西樣品。

圖5 34 批艾納香樣品的OPLS-DA 得分圖Fig.5 OPLS-DA scores plots of B.balsamifera samples

對(duì)4 組數(shù)據(jù)的差異性進(jìn)行整體分析，得到變量權(quán)重重要性排序（variable importance in projection，VIP）預(yù)測(cè)值，在0.95 的置信區(qū)間內(nèi)。OPLS-DA模型中14 個(gè)色譜峰的VIP 見圖6，VIP 越大，表明該色譜峰對(duì)于不同產(chǎn)區(qū)艾納香的分類貢獻(xiàn)越大，也即為最能導(dǎo)4 個(gè)產(chǎn)區(qū)艾納香樣品相區(qū)分的差異成分，選取VIP＞1 的5 個(gè)化合物作為差異性標(biāo)志物，按VIP 大小排序依次為14 號(hào)峰＞8 號(hào)峰（圣草酚）＞12 號(hào)峰＞2 號(hào)峰＞10 號(hào)峰，這些成分在區(qū)分不同產(chǎn)區(qū)間艾納香起到重要作用，是其差異的主要標(biāo)志。

圖6 艾納香樣品OPLS-DA 模型中14 個(gè)色譜峰的VIPFig.6 VIP of 14 chromatographic peak in OPLS-DA model of B.balsamifera samples

2.4.5 綜合質(zhì)量評(píng)分[19]以上述4 個(gè)主成分對(duì)不同產(chǎn)區(qū)34 批艾納香樣品質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)分，由15 個(gè)共有峰因子的載荷向量及特征值計(jì)算得到15 個(gè)因子的特征向量，以特征向量為系數(shù)構(gòu)建4 個(gè)主成分的線性方程F1＝0.286X1＋0.314X2＋0.291X3＋0.301X4＋0.350X5＋0.290X6－0.090X7－0.005X8＋0.254X9＋0.283X10＋0.290X11＋0.268X12＋0.268X13＋0.017X14＋0.237X15；F2＝-0.320X1＋0.01X2－0.312X3－0.294X4－0.136X5－0.316X6－0.163X7＋0.264X8＋0.366X9＋0.104X10＋0.246X11＋0.059X12＋0.365X13＋0.151X14＋0.366X15；F3＝0.022X1－0.267X2－0.023X3－0.025X4－0.001X5＋0.096X6＋0.543X7－0.064X8＋0.211X9－0.180X10＋0.151X11－0.155X12＋0.180X13－0.636X14＋0.240X15；F4＝0.154X1＋0.147X2＋0.030X3＋0.090X4＋0.161X5＋0.190X6＋0.028X7＋0.503X8＋0.120X9－0.395X10－0.234X11－0.540X12＋0.028X13＋0.258X14＋0.211X15。X1～X15為指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積，根據(jù)特征值λ1＝6.769，λ2＝2.939，λ3＝1.397，λ4＝1.330，得綜合得分評(píng)價(jià)方程F＝AF1＋BF2＋CF3＋DF4＝0.544F1＋0.236F2＋0.112F3＋0.107F4，其中A＝λ1/(λ1＋λ2＋λ3＋λ4)，B＝λ2/(λ1＋λ2＋λ3＋λ4)，C＝λ3/(λ1＋λ2＋λ3＋λ4)，D＝λ4/(λ1＋λ2＋λ3＋λ4)。綜合得分越高表示單個(gè)藥材樣品整體質(zhì)量越好，HN-6＋海南省瓊中縣營(yíng)根鎮(zhèn)＋，HN-4＋海南瓊中縣中平鎮(zhèn)＋，HN-3＋海南瓊中縣中平鎮(zhèn)＋是綜合得分前3 的樣品，也是HCA 和PCA 中成分含量差異比較大的樣品，4 份廣東產(chǎn)樣品綜合得分也比較高，列居前10位，具體綜合質(zhì)量評(píng)分情況見表4。

表4 34 批艾納香樣品主成分因子得分及排序Table 4 Main component factor score and ranking of 34 batches of B.balsamifera samples

2.5 不同產(chǎn)地樣品含量測(cè)定

在艾納香指紋圖譜建立的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)經(jīng)上述色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，指認(rèn)的5 個(gè)色譜峰3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮、圣草酚、3,3′,5-三羥基-4′,7-二甲氧基二氫黃酮、艾納香素、sakuranrtin 色譜峰均能達(dá)到很好地分離效果。根據(jù)進(jìn)樣結(jié)果依次記錄5 個(gè)指認(rèn)峰峰面積，計(jì)算其含量。

利用IBM SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)4 個(gè)產(chǎn)區(qū)5 個(gè)成分樣本量不滿足正態(tài)性檢驗(yàn)，故采用非參數(shù)獨(dú)立樣本Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行不同產(chǎn)區(qū)含量差異分析，并借助GraphPadPrism7.0 軟件數(shù)據(jù)繪圖工具做差異分析箱式圖（圖7）。結(jié)果顯示5 個(gè)成分中3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮、圣草酚、3,3′,5-三羥基-4′,7-二甲氧基二氫黃酮和sakuranrtin 均以貴州產(chǎn)整體含量較高，艾納香素以海南產(chǎn)整體含量較高；3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮貴州產(chǎn)區(qū)與其他3 個(gè)產(chǎn)區(qū)具有一定差異（P＜0.01，0.05），3,3′,5-三羥基-4′,7-二甲氧基二氫黃酮和艾納香素貴州產(chǎn)區(qū)與廣西產(chǎn)區(qū)具有顯著性差異（P＜0.01），sakuranrtin 在4 個(gè)產(chǎn)區(qū)中沒有差異。由于在指紋圖譜分析結(jié)果中3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮（7 號(hào)峰）作為特征峰，其相對(duì)峰面積值為1，在變量權(quán)重重要性排序沒有得到體現(xiàn)[17]。根據(jù)4 個(gè)產(chǎn)區(qū)圖譜峰面積以及含量測(cè)定結(jié)果可以看出該峰是區(qū)分4 個(gè)產(chǎn)區(qū)的一個(gè)重要成分之一。

圖7 4 個(gè)產(chǎn)區(qū)艾納香樣品中5 個(gè)成分的含量比較Fig.7 Content comparison of five components in B.balsamifera samples from different regions

3 討論

本實(shí)驗(yàn)比較不同提取溶劑（乙醇、甲醇、90%甲醇、75%甲醇和50%甲醇）對(duì)艾納香樣品色譜峰的影響，結(jié)果顯示甲醇作為溶劑的色譜峰信息量多于乙醇，不同比例的甲醇提取比甲醇提取部分色譜峰響應(yīng)值更高，但因50%和75%提取的在同一方法下色譜圖中32～34 min 時(shí)基線不穩(wěn)定，最終選擇90%甲醇作為提取溶劑。采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)艾納香樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，比較了不同波長(zhǎng)下色譜圖的峰數(shù)目與分離度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用285 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)選用樣品色譜峰數(shù)目較多且分離度良好。同時(shí)對(duì)進(jìn)樣色譜條件包括梯度洗脫程序、柱溫、進(jìn)樣量、流動(dòng)相磷酸水的pH 值進(jìn)行了考察，綜合各種因素，最終梯度洗脫條件確定為：柱溫35 ℃；體積流量0.9 mL/min；進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相為0.5%磷酸水-乙腈，梯度洗脫程序見“2.1”項(xiàng)。

本研究采用高效液相色譜法，建立了34 批4個(gè)產(chǎn)區(qū)的艾納香藥材HPLC 化學(xué)指紋圖譜，結(jié)果顯示4 個(gè)產(chǎn)區(qū)藥材相似度在0.433～0.977，尤其海南相似度偏低，其次是貴州，廣東和廣西普遍具有較高相似度。4 個(gè)產(chǎn)區(qū)艾納香藥材在化學(xué)組分和含量上存在差異，如廣東4 個(gè)樣品在17～19 min 這個(gè)較短時(shí)間段完全沒有色譜峰信息，但是其他3 個(gè)產(chǎn)區(qū)在這個(gè)時(shí)間段里明顯的檢測(cè)到了色譜峰信號(hào)，且表現(xiàn)出峰面積的不同。這種差異可能是由于產(chǎn)區(qū)因素導(dǎo)致，但也有可能是其他因素如采收時(shí)間、種植技術(shù)等導(dǎo)致某些化學(xué)成分含量過低無法達(dá)到儀器檢測(cè)限而造成組分以及含量差異，或者這些因素直接導(dǎo)致某些產(chǎn)區(qū)樣品缺失了某些成分，這都有待進(jìn)一步的研究和探索，而差異和不穩(wěn)定性的存在也說明艾納香藥材有待進(jìn)一步加強(qiáng)質(zhì)量控制和優(yōu)良種質(zhì)資源育種的必要性。

為了進(jìn)一步尋找不同產(chǎn)區(qū)艾納香樣品的差異性成分，采用聚類分析、PCA 分析和OPLS-DA 分析等化學(xué)模式識(shí)別方法，對(duì)4 個(gè)產(chǎn)區(qū)艾納香樣品進(jìn)行分析比較。結(jié)果表明，基于指紋圖譜15 個(gè)共有峰相對(duì)峰面積數(shù)據(jù)，HCA 和PCA 分析發(fā)現(xiàn)4 個(gè)產(chǎn)區(qū)差異區(qū)分不是很明顯，但海南產(chǎn)艾納香樣品自身質(zhì)量存在較大差異。通過OPLS-DA 分析可以將海南、廣東樣品同貴州、廣西進(jìn)行一定的區(qū)分，不同產(chǎn)區(qū)樣品偏向分布不同的象限，貴州和廣西大部分樣品可以聚為一類，這和HCA 結(jié)果一致。貴州和廣西地區(qū)毗鄰，環(huán)境氣候條件具有更多的相似性，均屬于亞熱帶氣候區(qū)，廣東和廣西地區(qū)毗鄰，廣東是亞熱帶和熱帶混合氣候，而海南則與其他3 個(gè)產(chǎn)區(qū)獨(dú)立開來，完全屬于熱帶氣候，從分析結(jié)果也可以看出海南產(chǎn)區(qū)的樣品存在更大的差異性。通過變量權(quán)重要性排序及多成分含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)共有峰14、8（圣草酚）、12、2、10、7 號(hào)峰（3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮），這些成分可以作為區(qū)分和鑒別不同產(chǎn)區(qū)艾納香藥材質(zhì)量的控制指標(biāo)，4 個(gè)未知差異成分本課題組后續(xù)將利用Q-TOF/MS 對(duì)未知成分進(jìn)行定性，從而明確可識(shí)別不同產(chǎn)區(qū)艾納香藥材的差異成分，以期為評(píng)價(jià)艾納香藥材的質(zhì)量一致性提供更為全面地參考。雖然海南樣品自身存在較大差異，但是其艾納香單株樣品表現(xiàn)出了較佳的質(zhì)量評(píng)分，綜合質(zhì)量評(píng)分中前3 名為海南省瓊中縣的樣品，具備了選育出優(yōu)良艾納香單株的可能性，可為艾納香品種選育和分株擴(kuò)繁提供依據(jù)。在前期課題組提取分離艾納香單體成分的基礎(chǔ)上通過對(duì)照品指認(rèn)并定量測(cè)定了5 個(gè)二氫黃酮類單體成分，這5 個(gè)成分均是艾納香中的重要活性成分，具有抑菌[15]、抗腫瘤[20]、抗氧化[21]等藥理作用，在艾納香整體藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)中可考慮作為黃酮類指標(biāo)性成分。

綜上分析，艾納香藥材根據(jù)產(chǎn)區(qū)不同，在成分的組分上以及含量或比例關(guān)系上存在顯著差異。指紋圖譜作為一種有效的中藥質(zhì)量控制模式，在色譜峰未明確為何種成分的情況下，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)仍能給出充分、可靠的信息，再佐以多成分含量測(cè)定可用于中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)[22]。本研究所建立的HPLC 指紋圖譜及多成分定量方法具有良好的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性，簡(jiǎn)便可靠，分析結(jié)果可為艾納香藥材質(zhì)量控制和優(yōu)良種質(zhì)資源選育提供參考依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突