雷瑞瑞，周栩平，王新華，李晶晶，周 靜

1.駐馬店市中心醫(yī)院 新生兒及NICU 科，河南 駐馬店 463000

2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 新生兒科，河南 鄭州 450002

3.駐馬店市中心醫(yī)院 臨床藥學(xué)室，河南 駐馬店 463000

新 生 兒 高 膽 紅 素 血 癥（neonatal hyperbilirubinemia，NH）又稱新生兒黃疸，是指由于膽紅素代謝異常使血中膽紅素水平升高，導(dǎo)致皮膚、黏膜及鞏膜黃染的病癥[1-2]。NH 是新生兒常見病癥，可導(dǎo)致新生兒急慢性腦病、臟器損害、神經(jīng)毒性及聽力下降，甚至死亡等，嚴(yán)重危害新生兒生命健康[3-4]。聽覺中樞更易受膽紅素毒性損害，據(jù)流行病學(xué)分析，超過70%的NH 患者可出現(xiàn)腦干聽覺核團(tuán)、前庭核、下丘核等特定中樞核團(tuán)的功能損害癥狀[5-6]。然而雖然學(xué)術(shù)界認(rèn)同NH 容易導(dǎo)致聽覺損傷，但其聽覺損害及中樞神經(jīng)毒性機(jī)制還不甚明確，這使得臨床仍缺乏特異性、有效性的防治藥物。近來研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酶C（phospholipase C，PLC）/三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）通路可介導(dǎo)腦組織神經(jīng)元凋亡發(fā)揮腦神經(jīng)保護(hù)作用[7]，且能觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放，促進(jìn)新生大鼠耳蝸血管紋緣細(xì)胞釋放三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），調(diào)節(jié)聲轉(zhuǎn)導(dǎo)、聽敏度等生理活動[8]。故研究PLC/IP3通路在NH 病理過程中的調(diào)控機(jī)制，對闡明聽覺損害及中樞神經(jīng)毒性機(jī)制具有潛在臨床價值。傳統(tǒng)中藥巖黃連Corydalis saxicolaBunting 富含生物堿，臨床上常用于治療急慢性肝炎、病毒性肝炎、高膽紅素血癥、肝癌及其他腫瘤的輔助治療[9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，巖黃連可減輕NH 的程度和持續(xù)時間及NH 用藥過程中的不良反應(yīng)，對NH 有較好的治療效果[10]。但巖黃連治療NH 的具體機(jī)制及對聽覺損害的影響還未見報道，本研究建立NH 大鼠模型，給予巖黃連治療，探究巖黃連對NH 大鼠PLC/IP3通路及聽覺損傷的影響，以期闡明巖黃連治療NH的作用機(jī)制，為其臨床合理用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 7 d 齡清潔級SD 大鼠50 只，體質(zhì)量15～20 g，雌雄不限，動物均無耳毒性藥物使用及強(qiáng)噪聲暴露史，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2018-0002。所有大鼠于本院動物房中飼養(yǎng)，自然光照，自由飲食、飲水，溫度25 ℃，相對濕度50%，噪音低于80 dB，保持動物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。本實驗經(jīng)駐馬店市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號ZMD-20200109 0034），實驗動物符合3R 原則。

1.1.2 主要試劑及儀器 巖黃連對照藥材（貨號A-121416-1g）購自上海信帆生物科技有限公司，經(jīng)駐馬店市中心醫(yī)院周靜藥師鑒定為巖黃連C.saxicolaBunting；膽紅素（貨號QN0823-PFQ，橙色至暗紅棕色結(jié)晶體）購自北京百奧萊博科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（貨號G1120）購自北京索萊寶科技有限公司；大鼠總膽紅素酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（貨號DIBR-180）購自北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司；鈣素（calcium，CaM）、磷酸化PLC（p-PLC）、IP3 抗體（貨號分別為ab181052、ab68148、ab252536），均購自美國Abcam 公司；BCA 蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶（貨號分別為P0768、P0231），均購自美國Pierce 公司。

RM2125RTS 型手動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國Leica公司）；SMZ745 光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）；1659001 型蛋白電泳儀、Trans-Blot SD 半干轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司）；GIS-500 凝膠成像儀（杭州米歐儀器有限公司）；CHARTR EP/ASSR 腦干誘發(fā)電位儀、TDH-39 氣導(dǎo)耳機(jī)（丹麥Interacoustics 公司）。

1.2 方法

1.2.1 巖黃連藥液的制備 參照文獻(xiàn)方法[11]，巖黃連藥材用蒸餾水煎煮，取水提液濃縮干燥（每克干燥物中含生藥量8 g），取干燥物用生理鹽水配制成0.5、1.0、2.0 mg/mL（相當(dāng)于生藥量4.0、8.0、16.0 mg/mL）的溶液（其中含巖黃連總生物堿0.28～1.12 mg/mL）。

1.2.2 NH 大鼠模型建立及分組與給藥 出生后7 d的SD 大鼠50 只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組及巖黃連低、中、高劑量（40、80、160 mg/kg）組，每組10 只；除對照組外，其余各組新生大鼠均參照文獻(xiàn)方法[12]按200 μg/g的劑量ip膽紅素溶液（20 mg 晶體膽紅素溶于1 mL 0.05 mol/L 氫氧化鈉溶液中，加入蒸餾水9 mL，用0.05 mol/L 的鹽酸調(diào)節(jié)pH 8.5，終質(zhì)量濃度為2 mg/mL，按1 mL/kg 劑量給藥）建立NH 模型，藥物注射后于恒溫、恒濕和避光環(huán)境中自然哺育24 h，并觀察大鼠行為活動，若大鼠出現(xiàn)煩躁、翻滾現(xiàn)象，表明造模成功。對照組大鼠ip 等量生理鹽水后置于同樣條件下哺育24 h。各組均于注射膽紅素后30 min 開始給藥，按10 mL/kg ig給予相應(yīng)劑量的巖黃連藥液，對照組及模型組按10 mL/kg ig 給予生理鹽水，各組均給藥1 d，3 次/d。

1.2.3 大鼠一般行為觀察 各組大鼠末次給藥2 h后，觀察大鼠有無煩躁、翻滾及俯伏等異常神經(jīng)行為活動，耳廓反射及對外界刺激反應(yīng)靈敏程度。

1.2.4 大鼠聽性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response，ABR）檢測 各組大鼠置于隔聲屏蔽室[本底噪聲不大于30 dB 聲壓級（sound pressure level，SPL）]中，麻醉后，用TDH-39 型氣導(dǎo)耳機(jī)給聲并緊貼大鼠外耳道口，設(shè)置腦干誘發(fā)電位儀聽覺誘發(fā)參數(shù)為帶通濾波100～3000 Hz，描時10 ms，疊加次1024 次，刺激聲為交替短聲。設(shè)置完參數(shù)，接通點擊后開始進(jìn)行測試，ABR 反應(yīng)閾的判斷以II波為標(biāo)準(zhǔn)，刺激強(qiáng)度從90 dB SPL 開始，10 dB 一檔遞減至II波不可辨別，再以80 dB 的刺激強(qiáng)度測試大鼠雙耳的各波潛伏期和波間期。數(shù)據(jù)經(jīng)測試系統(tǒng)自身的微機(jī)自動讀取、存儲。

1.2.5 大鼠血清及腦干組織標(biāo)本采集及膽紅素含量測定 各組大鼠在測完ABR 后，腹主動脈取血0.5 mL，置于室溫1 h，凝固后，置4 ℃下過夜，析出血清，3000 r/min 離心10 min 后，取上清液加于測試管中，按膽紅素ELISA 試劑盒說明書方法檢測血清膽紅素含量。將大鼠麻醉，開胸，經(jīng)左心室快速灌注生理鹽水，沖凈血液，隨后緩慢灌注多聚甲醛磷酸緩沖液，然后斷頭處死，開顱取腦干組織，剪取1 g 后備用，剩余部分迅速置于上述灌注液中固定1 周備用。從1 g 腦干組織中剪取0.5 g，加0.5 mL冰醋酸勻漿后，再加0.5 mL 丙酮混勻，于3000 r/min離心10 min 后取上清液0.2 mL，按膽紅素ELISA試劑盒說明書方法檢測血清膽紅素含量，剩余腦干組織迅速置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.6 大鼠耳蝸核標(biāo)本制作及HE、CaM 免疫組化染色檢測 取“1.2.5”項下4%多聚甲醛溶液中固定1周的腦干組織，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后，經(jīng)面神經(jīng)根平面向后做連續(xù)冠狀切片，片厚7 μm，取從耳蝸核開始出現(xiàn)至消失的切片，共2 套，一套根據(jù)HE 試劑盒說明書進(jìn)行HE 染色，并在顯微鏡下觀察組織變化，另一套用二甲苯脫蠟、3%過氧化氫消化過氧化物酶活性后，滴加1∶500 的CaM 抗體，行CaM 免疫組化染色，在共聚焦顯微鏡下觀察切片中細(xì)胞染色情況，采用Image-pro plus 定量檢測染成棕黃色細(xì)胞數(shù)數(shù)目，并計算CaM 陽性細(xì)胞表達(dá)率。耳蝸核定位參照《常用實驗動物腦立體定位圖譜》[13]和《大白鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)解剖學(xué)基礎(chǔ)》[14]進(jìn)行。

CaM 陽性細(xì)胞表達(dá)率＝染成棕黃色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)

1.2.7 Western blotting 法檢測腦干組織p-PLC、IP3蛋白相對表達(dá)量 取“1.2.5”項中-80 ℃保存的腦干組織，于4 ℃冰箱中解凍后，用組織勻漿器勻漿，離心分離后，取上清液，用蛋白提取試劑盒提取蛋白，蛋白定量BCA 試劑盒檢測蛋白總濃度后，取50 μg 蛋白上樣，進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，TBST 溶液清洗后，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，TBST溶液清洗3 次后，加入一抗[p-PLC、IP3、β-actin（內(nèi)參）]抗體，稀釋倍數(shù)分別為1∶1000、1∶1000、1∶2000），4 ℃搖床室溫孵育過夜，TBST 振洗后加入HRP 羊抗兔二抗（稀釋倍數(shù)1∶2000），37 ℃搖床室溫孵育1 h，TBST 清洗3 次后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image-J 軟件分析各組蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

以SPSS 22.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以x±s表示，多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較進(jìn)行Snk-q檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般行為

對照組大鼠行為活動正常，無煩躁、翻滾及俯伏等異常神經(jīng)行為活動，耳廓反射及對外界刺激反應(yīng)靈敏；與對照組相比，模型組大鼠出現(xiàn)煩躁、翻滾及俯伏等異常神經(jīng)行為活動，且耳廓反射及對外界刺激反應(yīng)遲鈍；與模型組相比，巖黃連低、中、高劑量組大鼠煩躁、翻滾及俯伏等異常神經(jīng)行為活動明顯減少，且耳廓反射及對外界刺激反應(yīng)遲鈍現(xiàn)象得到不同程度改善。

2.2 各組大鼠ABR 各波潛伏期及閾值

與對照組相比，模型組大鼠ABR 閾值升高（P＜0.05），I、II、III波潛伏期明顯延長（P＜0.05）；與模型組相比，巖黃連低、中、高劑量組大鼠ABR閾值降低（P＜0.05），I、II、III波潛伏期明顯縮短（P＜0.05），且?guī)r黃連各劑量組上述指標(biāo)呈劑量相關(guān)性，見表1。

表1 各組大鼠ABR 各波潛伏期及閾值(±s,n=10)Table 1 Incubation period and threshold of ABR wave in each group(±s,n=10)

表1 各組大鼠ABR 各波潛伏期及閾值(±s,n=10)Table 1 Incubation period and threshold of ABR wave in each group(±s,n=10)

與對照組比較：aP＜0.05；與模型組比較：bP＜0.05；與巖黃連低劑量組比較：cP＜0.05；與巖黃連中劑量組比較：dP＜0.05，下表同aP＜0.05 vs control group;bP＜0.05 vs model group;cP＜0.05 vs C.saxicola low-dose group;dP＜0.05 vs C.saxicola medium-dose group,same as below tables

潛伏期/ms組別 劑量/(mg·kg-1)I波 Ⅱ波 Ⅲ波 閾值/dB SPL對照 － 1.09±0.02 1.51±0.04 2.52±0.03 16.66±1.29模型 － 1.39±0.04a 2.31±0.05a 3.41±0.04a 54.23±1.51a巖黃連 40 1.31±0.03ab 2.01±0.04ab 3.11±0.03ab 40.32±1.42ab 80 1.22±0.02abc 1.77±0.03abc 2.81±0.04abc 29.67±1.36abc 160 1.11±0.02bcd 1.62±0.03bcd 2.54±0.03bcd 19.08±1.22bcd

2.3 各組大鼠血清及腦干組織膽紅素含量

與對照組相比，模型組大鼠血清及腦干組織膽紅素含量升高（P＜0.05）；與模型組相比，巖黃連低、中、高劑量組大鼠血清及腦干組織膽紅素含量降低（P＜0.05），且?guī)r黃連各劑量組血清及腦干組織膽紅素含量呈劑量相關(guān)性，見表2。

表2 各組大鼠血清及腦干組織膽紅素含量(±s,n=10)Table 2 Content of bilirubin in serum and brain stem tissue of rats in each group(±s,n=10)

表2 各組大鼠血清及腦干組織膽紅素含量(±s,n=10)Table 2 Content of bilirubin in serum and brain stem tissue of rats in each group(±s,n=10)

組別 劑量/(mg·kg-1)血清膽紅素/(μmmol·L-1)腦干組織膽紅素/(nmmol·L-1)對照 － 15.09±1.92 0.00±0.00模型 － 511.39±10.24a 4.01±0.15a巖黃連 40 301.31±9.93ab 3.21±0.14ab 80 102.22±8.02abc 1.07±0.03abc 160 17.11±2.02bcd 0.09±0.03bcd

2.4 各組大鼠耳蝸核組織HE 染色

對照組大鼠耳蝸核組織正常，染色均勻。與對照組相比，模型組大鼠耳蝸核組織可見膽紅素沉積，各亞核神經(jīng)細(xì)胞腫脹、數(shù)目減少，胞漿皺縮且有空泡形成，脂褐素沉積增多，尼氏體減少等病理現(xiàn)象嚴(yán)重。巖黃連低、中、高劑量組上述病理損傷得到不同程度改善。見圖1。

圖1 各組大鼠耳蝸核組織HE 染色圖(×400)Fig.1 HE staining of cochlea nucleus tissue of rats in each group(× 400)

2.5 各組大鼠耳蝸核組織CaM 免疫組化染色

對照組大鼠耳蝸核組織細(xì)胞染色正常，無棕黃色顆粒沉積。與對照組相比，模型組大鼠耳蝸核組織細(xì)胞核染色較淺，棕黃色或棕色顆粒增多，CaM陽性表達(dá)率增高（P＜0.05）；與模型組相比，巖黃連各劑量組棕黃色或棕色顆粒明顯減少，且CaM 陽性表達(dá)率呈劑量相關(guān)性降低（P＜0.05）。見圖2 和表3。

表3 各組大鼠耳蝸核組織CaM 陽性表達(dá)率(±s,n=10)Table 3 Positive expression rate of CaM in cochlea nucleus of rats in each group(±s,n=10)

表3 各組大鼠耳蝸核組織CaM 陽性表達(dá)率(±s,n=10)Table 3 Positive expression rate of CaM in cochlea nucleus of rats in each group(±s,n=10)

組別 劑量/(mg·kg-1)CaM 陽性表達(dá)率/%對照 － 10.07±1.96模型 － 90.19±4.09a巖黃連 40 60.87±3.04ab 80 35.64±2.92bc 160 13.73±2.03bcd

圖2 各組大鼠CaM 免疫組化染色圖(×400)Fig.2 CAM immunohistochemical staining of rats in each group(× 400)

2.6 各組大鼠腦干組織p-PLC、IP3 蛋白表達(dá)量

與對照組相比，模型組大鼠腦干組織p-PLC、IP3 蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05）；與模型組相比，巖黃連低、中、高劑量大鼠腦干組織p-PLC、IP3 蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05），且?guī)r黃連各劑量組大鼠腦干組織p-PLC、IP3 蛋白表達(dá)量呈劑量相關(guān)性，見圖3 和表4。

圖3 各組大鼠腦干組織p-PLC、IP3 蛋白表達(dá)免疫印跡圖Fig.3 Western blotting of p-PLC and IP3 protein expression in brain stem tissues of rats in each group

表4 各組大鼠腦干組織p-PLC、IP3蛋白表達(dá)量(±s,n=10)Table 4 Expression levels of p-PLC and IP3 protein in brain stem tissues of rats in each group(±s,n=10)

表4 各組大鼠腦干組織p-PLC、IP3蛋白表達(dá)量(±s,n=10)Table 4 Expression levels of p-PLC and IP3 protein in brain stem tissues of rats in each group(±s,n=10)

組別 劑量/(mg·kg-1)p-PLC/β-actin IP3/β-actin對照 － 1.06±0.13 1.07±0.11模型 － 0.15±0.10a 0.13±0.14a巖黃連 40 0.46±0.12ab 0.45±0.13ab 80 0.76±0.11abc 0.72±0.12aabc 160 1.02±0.10bcd 1.01±0.15bcd

3 討論

NH 是新生兒常見病癥，NH 并發(fā)腦病可在急性期導(dǎo)致新生兒死亡，即使患兒幸存也常遺留神經(jīng)系統(tǒng)疾病，尤其以神經(jīng)系統(tǒng)損傷最為常見[13]。目前對膽紅素的神經(jīng)毒性如何作用于腦干聽覺核團(tuán)導(dǎo)致聽力損傷的機(jī)制尚不明確[14]。腦干聽覺核團(tuán)包括耳蝸核、上橄欖核復(fù)合體、外側(cè)丘系核和下丘，是聲音傳導(dǎo)的重要通路之一[15]。ABR 是應(yīng)用于臨床的聽生理測試技術(shù)，可全面準(zhǔn)確地記錄聲刺激后聽覺系統(tǒng)所產(chǎn)生的一系列電位反應(yīng)，可以判斷聽力損傷發(fā)生的部位及程度[16]。膽紅素是水溶液中溶解度極低的極性分子，其陰離子可通過血腦屏障進(jìn)入腦組織，并與神經(jīng)細(xì)胞極性基團(tuán)結(jié)合，并沉積在神經(jīng)細(xì)胞膜，影響并抑制神經(jīng)細(xì)胞能量代謝水平、神經(jīng)末梢突觸膜去極化反應(yīng)、神經(jīng)對沖動反應(yīng)而使神經(jīng)元化學(xué)傳遞作用及神經(jīng)的電傳導(dǎo)功能受損[17]。李克方[12]發(fā)現(xiàn)7 d 齡大鼠 ip 200 μg/g 的膽紅素24 h，可使大鼠血清和腦組織膽紅素含量增加，耳蝸核組織HE染色可見神經(jīng)細(xì)胞損傷，免疫組化反應(yīng)可見CaM 陽性表達(dá)增加，推測膽紅素沉積于耳蝸核的神經(jīng)細(xì)胞突觸膜，使細(xì)胞膜Ca2+內(nèi)流超載，Ca2+與CaM 結(jié)合后形成Ca2+-CaM 復(fù)合物，發(fā)揮毒性作用，導(dǎo)致耳蝸核信息的傳入功能受到影響及ABR 閾值升高、各波的潛伏期及聽覺傳導(dǎo)時間延長。本研究用200 μg/g 膽紅素ip 7 d 齡大鼠24 h 后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組大鼠出現(xiàn)煩躁、翻滾、耳廓反射遲鈍或消失，對外界刺激反應(yīng)遲鈍或無逃避反應(yīng)，耳蝸核組織各亞核神經(jīng)細(xì)胞體積腫脹、神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目及尼氏體減少、胞質(zhì)內(nèi)空泡較多等病理現(xiàn)象，ABR 反應(yīng)閾明顯升高且I、II、III波潛伏期明顯延長，血清及腦干組織膽紅素含量升高，耳蝸核組織中CaM 陽性率增高[11]，提示造模成功。

NH 所致聽力神經(jīng)損傷在早期具有可逆性，一旦發(fā)生不可逆的聽覺損傷，患兒只能用助聽器及耳蝸植入等方式進(jìn)行治療，因此在NH 早期及時進(jìn)行治療具有一定意義[18]。近來研究發(fā)現(xiàn)，巖黃連對NH 有較好的治療效果，可減輕NH 的程度和持續(xù)時間，劉馨燭等[19]發(fā)現(xiàn)巖黃連可促進(jìn)膽汁轉(zhuǎn)運體表達(dá)，降低大鼠急性肝內(nèi)膽汁瘀積，防止膽汁逆流入血，而出現(xiàn)血清膽紅素升高。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，巖黃連低、中、高劑量組大鼠煩躁、翻滾、耳廓及對外界刺激反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象明顯改善，耳蝸核組織病理損傷明顯減輕，ABR 反應(yīng)閾降低且I、II、III波潛伏期縮短，血清及腦干組織膽紅素含量降低，耳蝸核組織CaM 陽性表達(dá)降低，且上述指標(biāo)呈劑量相關(guān)性，表明巖黃連可降低新生NH 大鼠血清及腦組織膽紅素沉積，減少耳蝸核組織CaM 表達(dá)，緩解膽紅素對耳蝸核聽力神經(jīng)系統(tǒng)的毒害作用。然而其具體分子機(jī)制還不甚明確。

Ca2+是神經(jīng)系統(tǒng)正?；顒雍蜕窠?jīng)突觸傳導(dǎo)的重要信使，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載，可誘導(dǎo)線粒體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并激活大量蛋白水解酶，導(dǎo)致大量神經(jīng)元和少突角質(zhì)細(xì)胞大量死亡[20]，可能是膽紅素沉積于耳蝸核的神經(jīng)細(xì)胞突觸膜，使細(xì)胞膜Ca2+內(nèi)流超載，是導(dǎo)致神經(jīng)毒性的原因之一[11]。故促進(jìn)胞內(nèi)Ca2+釋放，抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載引起的神經(jīng)壞死，可能是緩解膽紅素對耳蝸核聽力神經(jīng)系統(tǒng)的毒害作用的主要機(jī)制之一。而PLC/IP3 通路介導(dǎo)的內(nèi)網(wǎng)鈣庫釋放，參與神經(jīng)突觸間傳導(dǎo)和神經(jīng)元可塑性調(diào)節(jié)，Melo 等[21]發(fā)現(xiàn)多巴胺受體可與G 蛋白偶聯(lián)并激活PLC，活化后的PLC 可促進(jìn)IP3 的釋放，引起胞內(nèi)內(nèi)鈣釋放，發(fā)揮調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長、分化、生存的生理效應(yīng)。劉斌等[22]發(fā)現(xiàn)在新生大鼠耳蝸血管紋緣細(xì)胞中，細(xì)胞外ATP 在無鈣離子的環(huán)境中，可以通過PLC-IP3 途徑觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放，促進(jìn)溶酶體的胞吐作用，從而將ATP 以囊泡形式釋放到胞膜外，調(diào)節(jié)聲轉(zhuǎn)導(dǎo)、聽敏度、耳蝸內(nèi)電位、耳蝸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等神經(jīng)信號傳導(dǎo)。Luo 等[7]發(fā)現(xiàn)褪黑素可激活 PLC/IP3/Ca2+途徑升高腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）水平，抵抗高膽紅素引起的海馬神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)毒性作用，而PLC/IP3 通路阻滯劑可拮抗褪黑素對NH 所致神經(jīng)毒性的抵抗作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組大鼠腦干組織中p-PLC、IP3 蛋白表達(dá)降低，提示NH 大鼠腦干組織PLC/IP3 通路被抑制，可能抑制胞內(nèi)Ca2+釋放，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣超載引起神經(jīng)毒性。而與模型組大鼠相比，巖黃連低、中、高劑量組p-PLC、IP3 蛋白表達(dá)呈劑量相關(guān)性升高，表明巖黃連可能通過激活PLC/IP3 通路，促進(jìn)胞內(nèi)鈣釋放，進(jìn)而減輕膽紅素沉積引起的胞內(nèi)鈣超載，改善腦干中神經(jīng)損傷。

綜上所述，巖黃連可激活NH 大鼠耳蝸核組織PLC/IP3 通路蛋白表達(dá)，緩解膽紅素對耳蝸核聽力神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，可能為闡明巖黃連改善高膽紅素沉積所致聽力神經(jīng)毒性作用機(jī)制提供一定參考，但高膽紅素沉積所致神經(jīng)毒性機(jī)制復(fù)雜，可能涉及其他通路，巖黃連的具體生物學(xué)機(jī)制仍需深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突