強(qiáng)婷婷，李益萍，王肖龍*

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 國(guó)家中醫(yī)心血管病臨床醫(yī)學(xué)研究中心分中心，上海 201203

2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 心血管病研究所，上海 201203

隨著中藥應(yīng)用日益廣泛，由中藥-西藥聯(lián)合使用產(chǎn)生的代謝性藥物相互作用和不良反應(yīng)事件也隨之增加，因此，中藥與西藥聯(lián)合應(yīng)用的安全性和合理性受到廣泛關(guān)注。肝臟是藥物代謝的主要場(chǎng)所，主要包括I 階段細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）酶系參與的氧化、還原、水解反應(yīng)[1]。CYP450 酶系是由許多同工酶組成的超基因大家族，其在肝臟含量最高，對(duì)大量結(jié)構(gòu)各異的藥物的生物轉(zhuǎn)化起著決定性作用[2]。藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄過(guò)程非常復(fù)雜，除了肝臟的代謝轉(zhuǎn)化外，膜轉(zhuǎn)運(yùn)體可以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)藥物進(jìn)出細(xì)胞，平衡細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，膜轉(zhuǎn)運(yùn)體在改變藥物代謝方面顯示出巨大的潛力[3]。目前國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的學(xué)者通過(guò)預(yù)測(cè)中藥對(duì)CYP450 酶及轉(zhuǎn)運(yùn)體活性影響，進(jìn)而評(píng)估藥物聯(lián)用時(shí)發(fā)生藥物相互作用的風(fēng)險(xiǎn)[4-6]，研究發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸在體外對(duì)人源CYP2B6、CYP2C9 以及有機(jī)陰離子 1B1（organic anion transporting polypeptide 1B1，OATP1B1）具有抑制作用，可能導(dǎo)致與其他藥物聯(lián)用時(shí)發(fā)生藥物相互作用[7]。

生脈注射液源于古方生脈散，由紅參、麥冬、五味子組成，具有益氣固脫、養(yǎng)陰生津的功效，用于治療氣陰兩虧、脈虛欲脫的心悸、氣短、四肢厥冷、汗出、脈欲絕及心肌梗死、心源性休克等癥狀。生脈注射液具有抗缺血缺氧及再灌注損傷、抑制心肌細(xì)胞凋亡及心肌纖維化等作用[8-9]。生脈注射液與常規(guī)西藥聯(lián)合使用時(shí)，不僅可以改善心力衰竭和冠心病心絞痛患者的臨床療效[10-12]，并且可以降低急性心肌梗死患者的死亡率[13]。但是，生脈注射液與心血管疾病常用藥物如CYP2C9 底物華法林、CYP2D6 底物美托洛爾、CYP3A 底物辛伐他汀、多藥耐藥蛋白1（multidrug resistance proteins 1，MDR1）底物地高辛、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）與OATP1B1 底物瑞舒伐他汀、OATP1B1 底物替米沙坦等的代謝性相互作用的研究較少，存在用藥安全隱患。

美國(guó)食品和藥品管理局（FDA）發(fā)布的《藥物相互作用研究指導(dǎo)原則（2017）》[14]以及我國(guó)頒布的《藥物相互作用研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》[15]中，主要包括7 種酶以及9 種轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制作用的研究，與心血管藥物代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)體主要有MDR1、BCRP 與OATP1B1。因此，根據(jù)國(guó)內(nèi)外的指導(dǎo)原則，在有無(wú)生脈注射液的人肝微粒體、MDR1以及BCRP 囊泡和人胚胎腎細(xì)胞HEK293 中，培養(yǎng)CYP450 酶與轉(zhuǎn)運(yùn)體的探針底物，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）及酶標(biāo)儀檢測(cè)探針底物代謝產(chǎn)物的生成量或探針底物量，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度（50% concentration of inhibition，IC50）值，從而進(jìn)一步評(píng)估生脈注射液對(duì)CYP450 酶主要亞型以及轉(zhuǎn)運(yùn)體MDR1、BCRP 與OATP1B1 的抑制作用，以期為生脈注射液與其他藥物臨床上安全、有效的聯(lián)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 人肝微粒體、囊泡和細(xì)胞

人肝微粒體（批號(hào)IHG，質(zhì)量濃度為20 mg/mL）購(gòu)自美國(guó)體外技術(shù)公司；人源MDR1 囊泡（批號(hào)KKA4G23，質(zhì)量濃度為5 mg/mL）、BCRP 囊泡（批號(hào)QSHTG03，質(zhì)量濃度為5 mg/mL）、穩(wěn)定表達(dá)人源 OATP1B1 轉(zhuǎn)運(yùn)體的 HEK293 細(xì)胞系HEK293-OATP1B1、轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因HEK293 細(xì)胞系 HEK293-MOCK 均購(gòu)自日本GenoMembrane 公司。

1.2 藥品與試劑

生脈注射液（批號(hào)2018120503）購(gòu)自上海和黃藥業(yè)；對(duì)照品非那西汀（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)77440）、阿莫地喹（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥100%，批號(hào)A2799）、雙氯芬酸鈉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)D6899）、α-萘磺酮（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)N5757）、槲皮素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)Q4951）、噻氯匹定（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%，批號(hào)T6654）、4-羥基雙氯芬酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)H-3661）、N-去乙基阿莫地喹（純質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)705349）、右啡烷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào) UC205）、熒光黃（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥100%，批號(hào)L0259）、N-甲基奎尼?。ㄙ|(zhì)量分?jǐn)?shù)≥100%，批號(hào)SBNMQ）、新生霉素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥93%，批號(hào)74675）、17β-葡萄糖苷-雌二醇（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)E1127）、利福平（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%，批號(hào)R3501）、G418 鹽酸鹽（批號(hào)A1720）、丁螺環(huán)酮（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥100%，批號(hào)B7148）、甲苯磺丁脲（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%，批號(hào)T0891）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；對(duì)照品安非他酮（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)B3649）、酮康唑（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)K0045）、對(duì)乙酰氨基酚（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)H0190）購(gòu)自日本東京化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社；對(duì)照品塞替派（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥100%，批號(hào)20101110）、4-羥基美芬妥英（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥100%，批號(hào)H-3661）購(gòu)自常州化工科技有限公司；羥基安非他酮對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.6%，批號(hào)BUP-16-007）購(gòu)自加拿大Acanthus 公司；6β-羥基睪酮對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥100%，批號(hào)ZC-24060）購(gòu)自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；甲醇購(gòu)自美國(guó)Merck 公司；β-還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，β-NADPH，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥100%，批號(hào)10041939）購(gòu)自瑞士Roche 公司；S-美芬妥英對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)7098-4-7）購(gòu)自上海相輝醫(yī)藥科技公司；睪酮對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.28%，批號(hào)DRE-C17322500）購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司；右美沙芬對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥100%，批號(hào)75469A）購(gòu)自上海Damas-beta 公司；磺胺苯吡唑?qū)φ掌罚ㄙ|(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%，批號(hào)178125）購(gòu)自百靈威科技有限公司；奎尼丁對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥100%，批號(hào)Q685000）購(gòu)自加拿大TRC 公司；轉(zhuǎn)運(yùn)體囊泡試劑盒（批號(hào)GM3010）購(gòu)自日本GenoMembrane公司；DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)11885-084）、胰酶（批號(hào)25300-062）、青霉素鏈霉素混合液溶液（批號(hào)15140-122）、胎牛血清（批號(hào)10099-141）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號(hào)23227）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；24 孔賴氨酸包被培養(yǎng)板（批號(hào)354414）購(gòu)自美國(guó)Corning 公司。

1.3 儀器

XW-80A 型漩渦儀（其林貝爾實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司）；DK-S24 型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；AL204 型天平（德國(guó)梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；VELOCITY18R 離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；HTS PAL 自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)（瑞士思特斯分析儀器股份公司）；LC20液相色譜儀（日本島津公司）；API4000 質(zhì)譜儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司）。

2 方法

2.1 生脈注射液的劑量設(shè)定依據(jù)

根據(jù)藥品說(shuō)明書(shū)，生脈注射液靜脈滴注，20～60 mL/次；以標(biāo)準(zhǔn)成人65 kg 體質(zhì)量計(jì)算，循環(huán)血液總量約為5 L，故使用臨床常用劑量時(shí)的理論最大血藥濃度為1.2%（體積分?jǐn)?shù)），考慮到肝臟內(nèi)濃度可能會(huì)高于血藥濃度，因此提高體外實(shí)驗(yàn)的濃度上限至30.0%（體積分?jǐn)?shù)）。在確定最高濃度后，設(shè)計(jì)的濃度范圍盡量包括臨床血藥濃度，但要滿足在1 個(gè)lg 內(nèi)需要有1 個(gè)濃度，否則在出現(xiàn)抑制作用時(shí)，無(wú)法準(zhǔn)確擬合IC50，因此在設(shè)置梯度濃度時(shí)可以2～5 倍交叉梯度稀釋。

2.2 生脈注射液對(duì)CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 和CYP3A4 的體外抑制作用

陰性對(duì)照組：人肝微粒體（終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL）與空白緩沖液預(yù)孵育15 min 后，加入相應(yīng)的探針底物溶液：非那西?。?0 μmol/L，CYP1A2）、安非他酮（100 μmol/L，CYP2B6）、阿莫地喹（1.5 μmol/L，CYP2C8）、雙氯芬酸（25 μmol/L，CYP2C9）、S-美芬妥英（50 μmol/L，CYP2C19）、右美沙芬（8 μmol/L，CYP2D6）和睪酮（100 μmol/L，CYP3A4），再加入β-NADPH，37 ℃孵育30 min。

陽(yáng)性對(duì)照組：人肝微粒體（終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL）分別與各亞酶的選擇性抑制劑：α-萘磺酮（30 μmol/L，CYP1A2）、塞替派（200 μmol/L，CYP2B6）、槲皮素（100 μmol/L，CYP2C8）、磺胺苯吡唑（10 μmol/L，CYP2C9）、噻氯匹定（5 μmol/L，CYP2C19）、奎尼?。?0 μmol/L，CYP2D6）和酮康唑（5 μmol/L，CYP3A4）于37 ℃預(yù)孵育15 min后，加入各亞酶的探針底物和β-NADPH，于37 ℃孵育30 min。

生脈注射液組：人肝微粒體（終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL）分別與不同體積分?jǐn)?shù)（0.1%、0.5%、3.0%、10.0%、30.0%）生脈注射液預(yù)孵育15 min后，加入各亞酶的探針底物和β-NADPH，于37 ℃孵育30 min。

各組加入預(yù)冷的甲醇終止反應(yīng)，4000 r/min 離心5 min，取上清液，采用LC-MS/MS 方法測(cè)定各探針底物的代謝產(chǎn)物生成量，并計(jì)算CYP450 亞酶的相對(duì)活性。

CYP450 亞酶的相對(duì)活性＝給藥組或陽(yáng)性對(duì)照組代謝產(chǎn)物生成量/陰性對(duì)照組代謝產(chǎn)物生成量

2.3 生脈注射液對(duì)MDR1與BCRP的體外抑制作用

陰性對(duì)照組：Buffer A2 與人源 MDR1（5 mg/mL）和BCRP 囊泡（5 mg/mL）于37 ℃預(yù)孵育5 min，分別加入Reagent C2 和探針底物：N-甲基奎尼?。? μmol/L，MDR1）或熒光黃（10 μmol/L，BCRP），在有ATP 或AMP 的條件下，于37 ℃孵育5 min。

陽(yáng)性對(duì)照組：酮康唑、新生霉素作為MDR1 與BCRP 的選擇性抑制劑，與人源性MDR1 及BCRP囊泡于37 ℃預(yù)孵育5 min，加入Reagent C2、熒光黃或N-甲基奎尼丁，在有ATP 或AMP 的條件下，于37 ℃孵育5 min。

生脈注射液組：不同體積分?jǐn)?shù)（0.1%、0.5%、2%、5%、20%）生脈注射液與人源MDR1 和BCRP囊泡于37 ℃預(yù)孵育5 min，分別加入Reagent C2、N-甲基奎尼丁或熒光黃，在有ATP 或AMP 的條件下，于37 ℃孵育5 min。

各組加入預(yù)冷的Buffer B2 終止孵育，轉(zhuǎn)移至96 孔濾板，用真空泵抽濾，棄去濾液；加入0.2 mL預(yù)冷的Buffer B2 反復(fù)洗滌5 次；加入50 μL 80%甲醇溶解濾板上的囊泡，2000 r/min 離心2 min，離心2 次，收集濾液；合并2 次濾液，混勻，加入等體積0.05 mol/L H2SO4（N-甲基奎尼?。┗虻润w積DMSO（熒光黃），配制N-甲基奎尼丁或熒光黃標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)樣本中N-甲基奎尼丁或熒光黃含量。N-甲基奎尼丁的激發(fā)光為355 nm，發(fā)射光為460 nm；熒光黃的激發(fā)光為428 nm，發(fā)射光為536 nm，其熒光強(qiáng)度與N-甲基奎尼丁或熒光黃水平成正比。計(jì)算底物被轉(zhuǎn)運(yùn)到囊泡內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)速率、相對(duì)活性和攝取率。

轉(zhuǎn)運(yùn)速率＝(底物在ATP 驅(qū)動(dòng)下的轉(zhuǎn)運(yùn)量－底物在AMP驅(qū)動(dòng)下的轉(zhuǎn)運(yùn)量)/孵育時(shí)間×囊泡蛋白質(zhì)量

相對(duì)活性＝給藥組或陽(yáng)性對(duì)照組代謝產(chǎn)物生成量/陰性對(duì)照組代謝產(chǎn)物生成量

攝取率＝陰性對(duì)照組或ATP 組探針底物轉(zhuǎn)運(yùn)量/AMP 組探針底物轉(zhuǎn)運(yùn)量

2.4 生脈注射液對(duì)OATP1B1 的體外抑制作用

2.4.1 HEK293 細(xì)胞培養(yǎng) 將人源HEK293-MOCK細(xì)胞作為HEK293-OATP1B1 細(xì)胞的陰性對(duì)照。細(xì)胞用含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（0.1 mg/mL）和遺傳霉素（0.5 mg/mL）的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以4×105/孔接種于24孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

2.4.2 轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn) 棄去培養(yǎng)基，用預(yù)溫的轉(zhuǎn)移緩沖液（pH 7.4）清洗2 次，將第2 次緩沖液留置在板孔內(nèi)，于37 ℃靜置5 min，棄去緩沖液。設(shè)置陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和生脈注射液（0.1%、0.5%、2%、5%、20%）組，陰性對(duì)照組加入預(yù)溫的含17β-葡萄糖苷-雌二醇（20 μmol/L）的空白緩沖液，陽(yáng)性對(duì)照組加入預(yù)溫的含17β-葡萄糖苷-雌二醇（20 μmol/L）的利福平（100 μmol/L）溶液，生脈注射液組加入預(yù)溫的含 17β-葡萄糖苷-雌二醇（20 μmol/L）的生脈注射液，孵育10 min。棄去培養(yǎng)基，用4 ℃預(yù)冷的緩沖液洗滌3 次，棄去板內(nèi)殘余溶液；加入0.3 mL 蒸餾水，用液氮反復(fù)凍融3 次，使細(xì)胞完全裂解；取100 μL 細(xì)胞裂解液與含內(nèi)標(biāo)甲醇按1∶4 沉淀，4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，取上清，采用LC-MS/MS 方法檢測(cè)上清中的探針底物水平。取25 μL 細(xì)胞裂解液，用BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)量濃度。計(jì)算底物攝取速率、底物凈攝取速率、相對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)活性和攝取率。

底物攝取速率＝細(xì)胞裂解液中被轉(zhuǎn)運(yùn)的底物量/細(xì)胞蛋白質(zhì)量×孵育時(shí)間

底物凈攝取速率＝底物攝取速率－陰性對(duì)照組底物攝取速率

相對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)活性＝給藥組或陽(yáng)性對(duì)照組凈攝取速率/陰性對(duì)照組凈攝取速率

攝取率＝陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)運(yùn)體細(xì)胞的底物攝取速率/陰性對(duì)照組底物攝取速率

2.5 LC-MS/MS 測(cè)定 CYP450 酶以及轉(zhuǎn)運(yùn)體OATP1B1 活力

2.5.1 色譜條件 DikmaInspire C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，5 μm）、Phenomenex SynergiTMHydro-RP 80 A 色譜柱（30 mm×2 mm，4 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫：0～0.70 min，90%～30% A；0.70～0.71 min，30%～5% A；0.71～1.20 min，5% A；1.20～1.21 min，5%～90% A；1.21～1.50 min，90% A；1.50～1.70 min，90%～30% A；1.70～2.01 min，30% A；2.01～2.30 min，30%～80% A。柱溫為45 ℃；進(jìn)樣量為5 μL；體積流量為0.45 mL/min。

2.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源（ESI），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式。ESI＋模式下，碰撞氣壓力為41.37 kPa，氣簾氣壓力為137.90 kPa，霧化氣壓力為344.75 kPa，輔助氣壓力為344.75 kPa，離子電壓為5000 V，離子噴射溫度為500 ℃。ESI-模式下，碰撞氣壓力為55.16 kPa，氣簾氣壓力為137.90 kPa，霧化氣壓力為344.75 kPa；輔助氣壓力為344.75 kPa，離子電壓為-4500 V，離子噴射溫度為500 ℃。目標(biāo)代謝產(chǎn)物質(zhì)譜條件及其離子見(jiàn)表1。

表1 目標(biāo)代謝產(chǎn)物質(zhì)譜條件及其離子Table 1 Mass spectrometric parameters for target metabolites and their ions

2.5.3 對(duì)照品溶液的配制 取對(duì)乙酰氨基酚、羥基安非他酮、6β-羥基睪酮、4-羥基雙氯芬酸、4-羥基美芬妥英、右啡烷、N-去乙基阿莫地喹和17-β-葡萄糖苷-雌二醇對(duì)照品適量，溶于甲醇溶液，分別配制成10 mmol/L 的對(duì)乙酰氨基酚、羥基安非他酮、6β-羥基睪酮、4-羥基雙氯芬酸、4-羥基美芬妥英、右啡烷的對(duì)照品儲(chǔ)備液，以及1 mg/mL 的N-去乙基阿莫地喹、17-β-葡萄糖苷-雌二醇的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取丁螺環(huán)酮、維拉帕米、甲苯磺丁脲、特非那定對(duì)照品適量，溶于甲醇溶液，分別配制成10 mmol/L的丁螺環(huán)酮、甲苯磺丁脲、特非那定內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，以及1 mg/mL 的維拉帕米內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。

2.5.4 樣品處理 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品、質(zhì)控樣品和測(cè)試樣品加入樣品50 μL，對(duì)空白樣品和空白質(zhì)控樣品加入空白基質(zhì)50 μL，對(duì)定量上限樣品加入不含內(nèi)標(biāo)的樣品50 μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品、質(zhì)控樣品，空白質(zhì)控樣品和測(cè)試樣品中加入200 μL 內(nèi)標(biāo)工作溶液（丁螺環(huán)酮10.0 nmol/L、維拉帕米0.400 ng/mL、甲苯磺丁脲20.0 nmol/L、特非那定10.0 nmol/L），向空白樣品和定量上限樣品加入200 μL 甲醇，室溫渦旋混勻10 min，4 ℃、4000 r/min 離心10 min，吸取200 μL 上清液至96 孔聚丙烯板中，進(jìn)樣測(cè)定。

2.5.5 方法學(xué)考察

（1）檢出限、定量限、線性范圍和基質(zhì)效應(yīng) 在選擇的樣品處理、色譜與質(zhì)譜條件下，8 種目標(biāo)代謝物在低、中、高3 個(gè)濃度水平上的絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)；分別以10 倍信噪比計(jì)算目標(biāo)代謝物的定量限和檢出限。以各代謝產(chǎn)物濃度為橫坐標(biāo)（X），各代謝產(chǎn)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），建立線性回歸方程。如表2所示，8 種目標(biāo)代謝物的線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.994，定量限為10 mmol/L，檢出限為10 mmol/L。

表2 8 種目標(biāo)代謝產(chǎn)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Linear equations,correlation coefficients,limits of detection,limits of quantitation and matrix effects of eight target metabolites

（2）精密度 通過(guò)計(jì)算低、中、高濃度（1.2、40、80 mmol/L）質(zhì)控樣品間的RSD 變化來(lái)考察精密度，最低濃度質(zhì)控樣品的RSD 在20%以內(nèi)，低、中、高濃度質(zhì)控樣品RSD 在15%以內(nèi)，可以認(rèn)為精密度良好。結(jié)果見(jiàn)表3。

（3）提取回收率 通過(guò)比較樣品經(jīng)過(guò)提取后的色譜峰面積與未經(jīng)提取的色譜峰面積之間的比值來(lái)考察樣品前處理過(guò)程中的提取回收率。低、中、高濃度（1.2、40、80 mmol/L）質(zhì)控樣品提取回收率的RSD 在15%以內(nèi)，可以認(rèn)為不同濃度下，樣品前處理過(guò)程中的提取回收率是一致的。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 8 種目標(biāo)代謝產(chǎn)物的提取回收率和精密度(n=6)Table 3 Spiked recoveries and precisions of eight target metabolites(n=6)

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 生脈注射液對(duì)CYP450 酶的抑制作用

如表4所示，生脈注射液（0.1%、0.5%、3.0%、10.0%、30.0%）對(duì)人肝微粒體中CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 和CYP3A4 酶活性均存在劑量相關(guān)性的抑制作用，IC50值分別為6.12%、2.72%、14.31%、12.96%、12.26%、3.72%；對(duì)人肝微粒體中CYP2C8 酶活性也存在抑制作用，其IC50值為10.00%～30.00%。

表4 生脈注射液對(duì)CYP450 酶相對(duì)活性的影響Table 4 Effect of Shengmai Injection on relative activity of CYP450

表4 生脈注射液對(duì)CYP450 酶相對(duì)活性的影響Table 4 Effect of Shengmai Injection on relative activity of CYP450

NA 表示未獲得NA means it has not obtained

組別 劑量/% 相對(duì)活性/%CYP1A2 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 CYP3A4陰性對(duì)照 — 100.00±1.04 100.00±9.15 100.00±17.81 100.00±0.98 100.00±24.88 100.00±11.39 100.00±13.14陽(yáng)性對(duì)照 — 14.41±0.69 15.22±0.46 34.34±1.84 15.59±0.52 30.13±5.23 9.13±0.29 3.86±1.96生脈注射液 0.1 101.65±4.29 110.18±3.51 97.48±7.49 98.79±1.34 113.26±19.49 102.42±2.54 112.13±31.07 0.5 100.69±6.86 87.40±4.48 126.73±14.46 100.00±1.96 119.26±1.14 104.83±2.74 96.13±NA 3.0 74.86±4.98 46.27±0.91 163.36±11.99 83.00±2.75 94.20±1.14 78.84±10.30 61.27±NA 10.0 29.34±2.94 15.27±0.52 163.99±4.25 57.91±1.32 52.46±9.72 57.39±2.72 21.44±1.44 30.0 15.00±1.33 14.69±0.81 46.23±1.23 32.68±1.46 21.01±4.99 25.65±0.63 2.93±0.42

3.2 生脈注射液對(duì)MDR1 與BCRP 的抑制作用

陰性對(duì)照組探針底物N-甲基奎尼丁和熒光黃的攝取率分別為14.2 和20.4，選擇性抑制劑分別抑制了MDR1 和BCRP 98.5%、97.1%的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，表明測(cè)試系統(tǒng)適合于本實(shí)驗(yàn)。如表5所示，生脈注射射液（0.1%、0.5%、2.0%、5.0%、20.0%）抑制BCRP轉(zhuǎn)運(yùn)熒光黃和MDR1 轉(zhuǎn)運(yùn)N-甲基奎尼丁，呈劑量相關(guān)性，其IC50值分別為0.75%、0.15%。

表5 生脈注射液對(duì)MDR1 與BCRP 相對(duì)活性的影響Table 5 Effect of Shengmai Injection on relative activity of MDR1 and BCRP

表5 生脈注射液對(duì)MDR1 與BCRP 相對(duì)活性的影響Table 5 Effect of Shengmai Injection on relative activity of MDR1 and BCRP

組別 劑量/% 相對(duì)活性/%MDR1 BCRP陰性對(duì)照 — 100.00±3.82 100.00±7.53陽(yáng)性對(duì)照 — 1.48±0.27 2.90±2.51生脈注射液 0.1 66.48±6.68 95.04±3.51 0.5 17.22±2.32 60.93±3.51 2.0 0.08±0.14 26.20±1.30 5.0 0.99±1.17 7.15±0.30 20.0 0 0.60±0.36

3.3 生脈注射液對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)體OATP1B1 的抑制作用

陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)運(yùn)體OATP1B1 介導(dǎo)的探針底物的攝取率為23.9，陽(yáng)性對(duì)照組加入選擇性抑制劑后，底物的轉(zhuǎn)運(yùn)活性降低至陰性對(duì)照組的0.889%，表明轉(zhuǎn)運(yùn)體的測(cè)試系統(tǒng)適合于本實(shí)驗(yàn)。如表6所示，生脈注射液（0.1%、0.5%、2.0%、5.0%、20.0%）抑制OATP1B1 轉(zhuǎn)運(yùn)活性，呈劑量相關(guān)性，其IC50值為2.03%。

表6 生脈注射液對(duì) OATP1B1 相對(duì)活性的影響Table 6 Effect of Shengmai Injection on relative activity of OATP1B1

表6 生脈注射液對(duì) OATP1B1 相對(duì)活性的影響Table 6 Effect of Shengmai Injection on relative activity of OATP1B1

組別劑量/% 相對(duì)活性/%陰性對(duì)照 — 99.90±2.04陽(yáng)性對(duì)照 — 0.90±1.54生脈注射液 0.1 99.51±0.84 0.5 99.27±2.08 2.0 61.51±0.77 5.0 2.64±0.16 20.0 2.10±0.30

4 討論

隨著臨床藥物聯(lián)用的日益普遍，藥物相互作用已成為現(xiàn)今臨床醫(yī)療中不可回避的實(shí)際問(wèn)題。目前臨床上藥物相互作用問(wèn)題主要表現(xiàn)在代謝性藥物相互作用方面。據(jù)統(tǒng)計(jì)，臨床90%以上的代謝性藥物相互作用均由CYP450 酶活性的改變引起。1980—1998年，由于嚴(yán)重不良反應(yīng)的陸續(xù)發(fā)生，F(xiàn)DA 先后將其批準(zhǔn)問(wèn)世的13 種新藥從市場(chǎng)上撤出，其中有5 種藥物與CYP450 介導(dǎo)的代謝性藥物相互作用相關(guān)[16-18]。CYP3A4 的抑制劑酮康唑與特非那定聯(lián)合使用時(shí)，酮康唑抑制了特非那定的代謝，使特非那定積累到高水平，導(dǎo)致RR 間期和QT 間期顯著延長(zhǎng)，最終可能造成尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過(guò)速[19]。因此，當(dāng)聯(lián)用藥物共同為CYP450 酶系的底物、抑制劑或激動(dòng)劑時(shí)，容易出現(xiàn)藥物相互作用的可能，導(dǎo)致活性代謝產(chǎn)物或毒性代謝產(chǎn)物生成增多，從而減少藥效或增加不良反應(yīng)，影響藥物聯(lián)用的安全性或有效性[20-21]。在臨床診治過(guò)程中，為了使患者獲得更好的療效，中藥與西藥一般結(jié)合使用[22-24]，但大部分中藥無(wú)論以何種形式使用，在體內(nèi)均以化合物形式發(fā)揮其藥理作用，在代謝過(guò)程中，均可能與西藥發(fā)生作用，從而改變藥物的藥理學(xué)特性，產(chǎn)生代謝性藥物相互作用[25]。生脈注射液的應(yīng)用極為廣泛，不僅可以用于心力衰竭、冠心病心絞痛與心肌梗死等疾病的治療，而且還具有抗休克、輔助治療腫瘤等作用。Meta 分析顯示，較單純使用常規(guī)西藥相比，生脈注射液與常規(guī)西藥聯(lián)合使用時(shí)，不僅提高了心衰患者的臨床療效，而且對(duì)左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）和心功能分級(jí)（New York heart association classification，NYHA）心功能也有明顯改善[26]。但是，基于CYP450 酶與轉(zhuǎn)運(yùn)體的代謝性藥物相互作用的相關(guān)研究幾乎空白，因此，無(wú)法評(píng)估生脈注射液與其他西藥聯(lián)用時(shí)的有效性和安全性。

本研究考察了生脈注射液對(duì)CYP450 酶系的影響，發(fā)現(xiàn)較對(duì)照組相比，生脈注射液在30%（v/v）濃度范圍內(nèi)可以抑制CYP450 酶底物非那西汀、安非他酮、阿莫地喹、雙氯芬酸鈉、S-美芬妥因、右美沙芬與睪酮分別向?qū)σ阴０被?、羥基安非他酮、N-去乙基阿莫地喹、4-羥基雙氯酚酸、4-羥基美芬妥因、右啡烷、6β-羥基睪酮的生物轉(zhuǎn)化，表明生脈注射液對(duì)CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 與CYP3A4 的活性具有抑制作用，其IC50值分別為6.12%、2.72%、10.00%～30.00%、14.31%、12.96%、12.26%、3.72%，其中對(duì)CYP2B6 的抑制作用最顯著。上述IC50值均顯著超過(guò)生脈注射液在人體內(nèi)的最大血藥濃度1.20%，表明生脈注射液在臨床常用劑量范圍內(nèi)，與上述酶底物聯(lián)用時(shí)發(fā)生藥物相互作用的可能性較小。

維拉帕米是經(jīng)FDA 批準(zhǔn)的藥物相互作用臨床研究的MDR1 的抑制劑，與MDR1 底物地高辛聯(lián)合使用時(shí)，使地高辛的清除減少，導(dǎo)致地高辛血藥濃度升高40%～80%，容易造成地高辛中毒反應(yīng)[27]。替米沙坦通常用于高血壓的治療，研究表明替米沙坦可以通過(guò)抑制腸道BCRP，使腸細(xì)胞對(duì)瑞舒伐他汀的攝取量增加2.2 倍[28]。本研究發(fā)現(xiàn)生脈注射液對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)體MDR1、BCRP、OATP1B1 均具有抑制作用，IC50值分別為0.15%、0.75%、2.03%，其中對(duì)MDR1 與BCRP 的抑制作用較顯著，其IC50值均未超過(guò)生脈注射液在人體內(nèi)的最大血藥濃度。因此，同樣作為MDR1 與BCRP 的抑制劑，生脈注射液與MDR1 及BCRP 底物結(jié)合應(yīng)用時(shí)可能存在藥物代謝性相互作用的風(fēng)險(xiǎn)，但是否會(huì)產(chǎn)生由代謝性相互作用引起的藥物不良反應(yīng)，需要進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

當(dāng)前，隨著中西聯(lián)合用藥普遍性的增加，由此產(chǎn)生的藥物相互作用和不良反應(yīng)事件也隨之增加，因此，中藥與其他藥物間的聯(lián)合應(yīng)用的安全性和合理性受到越來(lái)越多關(guān)注。目前關(guān)于中藥對(duì)CYP450酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體活性影響的研究較少，缺乏指南指導(dǎo)下的系統(tǒng)性研究。為了使臨床上合理、安全、有效地聯(lián)合使用中西藥物，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)中藥在藥物代謝方面的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突