劉苓嫻，李海波，石丹楓，王振中，姚新生，肖 偉*，于 洋*

1.暨南大學(xué)中藥及天然藥物研究所，廣東 廣州 510632

2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001

金紅片（Jinhong Tablets）是原中藥3 類新藥，源于金元四大家之首劉完素的《素問·病機(jī)氣宜保命集》中的金鈴子散（川楝子、延胡索）化裁而來的中藥復(fù)方創(chuàng)新藥物。由川楝子、延胡索（醋制）、川木香及紅花八角葉4 味中藥組成，具有疏肝解郁、理氣活血、和胃止痛的功效[1-3]。方中以川楝子為君藥，延胡索為臣藥，紅花八角葉與木香為佐使，川楝子用以清肝火，延胡索用以理氣，川木香用以行氣止痛，紅花八角葉用以散瘀行氣，組方精煉，諸藥合用共奏疏肝解郁、利氣活血、和中止痛之功。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金紅片可以使胃液分泌量和總酸排出量降低，抑制胃蛋白酶的分泌、延緩胃排空；還具有鎮(zhèn)痛、解痙、抗炎以及抗胃潰瘍、促進(jìn)潰瘍愈合等藥效[3]。臨床上在治療慢性淺表性胃炎的同時(shí)還可改善患者情緒狀態(tài)、通暢血脈、消散瘀滯，標(biāo)本兼治。

金紅片臨床應(yīng)用廣泛，但其在質(zhì)量控制方面，僅對(duì)莽草酸進(jìn)行限量以及對(duì)延胡索乙素進(jìn)行含量測定，未建立其與功效相關(guān)聯(lián)的多指標(biāo)成分的整體質(zhì)量控制方法。有文獻(xiàn)報(bào)道，川楝子、延胡索、木香和紅花八角葉的主要有效成分分別為楝烷型三萜類化合物[4]、生物堿類化合物[5]、倍半萜類化合物[6]以及黃酮類化合物[7-9]。另由于方中君藥川楝子具肝毒性[10]、致肌無力[11]、呼吸抑制[12]、妊娠毒性[13]。因此，需對(duì)其功效成分同時(shí)也是毒性成分川楝素進(jìn)行限量，提升產(chǎn)品的科學(xué)內(nèi)涵和安全性。本研究采用UPLC-TQ-MS 技術(shù)，選取覆蓋組方4 個(gè)單味藥的特征性成分以及活性成分（莽草酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸C、普洛托品、別隱品堿、延胡索乙素、紫堇堿、巴馬汀、槲皮素、異川楝素和川楝素）為指標(biāo)成分，建立與功效相關(guān)聯(lián)的多指標(biāo)成分含量測定方法，并對(duì)毒性成分川楝素進(jìn)行限量，為金紅片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升奠定一定的基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用（UPLCTQ-XS-MS）系統(tǒng)，包括Waters AcquityTMI-Class超高效液相色譜儀（含二元梯度泵–自動(dòng)進(jìn)樣器–柱溫箱）、Waters Xevo TQ-XS Triple Quadrupole Mass Spectrometry 三重四極桿質(zhì)譜，Waters 公司；KQ-250D 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司；XS205 型十萬分之一天平，Mettler Toledo公司；Sigma 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)3K-15，德國Sigma 公司；QL-861 渦旋儀，海門市其林貝爾儀器有限公司。

質(zhì)譜級(jí)乙腈及質(zhì)譜級(jí)甲醇，美國賽默飛世爾科技公司；質(zhì)譜級(jí)甲酸，美國西格瑪奧德里奇公司；質(zhì)譜用水，北京屈臣氏蒸餾水有限公司。

對(duì)照品：莽草酸（批號(hào)PRF10080721，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、綠原酸（批號(hào)PRF20051641，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、普洛托品（批號(hào)PRF10051621，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、別隱品堿（批號(hào)PRF20030227，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、延胡索乙素（批號(hào)PRF10031241，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、紫堇堿（批號(hào)PRF10022126，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、巴馬?。ㄅ?hào)PRF10030643，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%）、異川楝素（批號(hào)PRF10120625，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、川楝素（批號(hào)PRF10062524，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）均購于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；異綠原酸B（批號(hào)ST06590120，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）購于上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；異綠原酸 C（批號(hào)111894-201102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.1%）購于中國食品藥品檢定研究院；槲皮素（批號(hào)170813，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%）購于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。

15 批金紅片，規(guī)格0.45 g/片，批號(hào)分別為180502、190304、190305、190306、190401、190402、190403、190404、190405、190406、190407、200701、200702、201101、201102，均由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC 分析條件

色譜柱為Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫35 ℃，體積流量0.3 mL/min；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），洗脫梯度：0～1.5 min，2%～20% B；1.5～6.0 min，20%～22% B；6.0～10.0 min，22%～30%B；10.0～13.0 min，30%～60% B；13.0～14.0 min，60%～100% B；14.0～15.0 min，100% B；15.0～16.0 min，100%～2% B；16.0～17.0 min，2% B；進(jìn)樣量2 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子化電離源（ESI），毛細(xì)管電壓為2.5 kV（正/負(fù)離子模式）。離子源溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度550 ℃，反吹氣體積流量50 L/h，脫溶劑氣體積流量1000 L/h，碰撞氣為氬氣。數(shù)據(jù)采集模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，數(shù)據(jù)采集模式為棒狀圖（centriod）。各定量成分的參數(shù)設(shè)定見表1。12個(gè)化合物的MRM 疊加色譜圖見圖1。

表1 12 個(gè)化合物的多反應(yīng)監(jiān)測模式信息Table 1 MRM information of 12 analytes

圖1 12 個(gè)化合物(A～L)的MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 12 analytes(A—L)

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液的制備 取金紅片（去除包衣，研磨，過50 目篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入80%甲醇10 mL，超聲處理30 min，取出，放冷，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，稀釋質(zhì)量濃度至100 μg/mL，15 521×g離心10 min，取上清液即為供試品溶液。

2.3.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 分別精密稱取12 個(gè)對(duì)照品適量，以甲醇稀釋溶解，分別得到質(zhì)量濃度為莽草酸（A1）160 μg/mL、綠原酸（B1）146 μg/mL、異綠原酸B（C1）131 μg/mL、異綠原酸C（D1）100 μg/mL、普洛托品（E1）145 μg/mL、別隱品堿（F1）120 μg/mL、延胡索乙素（G1）120 μg/mL、紫堇堿（H1）125 μg/mL、巴馬?。↖1）100 μg/mL、槲皮素（J1）100 μg/mL、異川楝素（K1）93 μg/mL以及川楝素（L1）139 μg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸C、普洛托品、別隱品堿、紫堇堿、巴馬汀、異川楝素以及川楝素的對(duì)照品儲(chǔ)備液各500 μL 分別置于5 mL 量瓶中，加80%甲醇至刻度線，搖勻，得到分別稀釋了10 倍的對(duì)照品（B2、C2、D2、E2、F2、H2、I2、K2、L2）儲(chǔ)備液，對(duì)照品溶液均置于4 ℃冰箱放置，備用。

2.3.3 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密移取各對(duì)照品儲(chǔ)備液莽草酸（A1）400 μL、綠原酸（B2）200 μL、異綠原酸B（C2）80 μL、異綠原酸C（D2）200 μL、普洛托品（E2）80 μL、別隱品堿（F2）100 μL、延胡索乙素（G1）100 μL、紫堇堿（H2）300 μL、巴馬?。↖2）160 μL、槲皮素（J1）400 μL、異川楝素（K2）130 μL 及川楝素（L2）130 μL，置于10 mL量瓶中，加80%甲醇至刻度線，搖勻，得到S1 混合對(duì)照品溶液。以80%甲醇依次倍半稀釋得S2～S8混合對(duì)照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察 分別取金紅片供試品溶液（批號(hào)190401）、混合對(duì)照品溶液（S5）以及空白溶液（80%甲醇），按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下分析測試條件分別進(jìn)行檢測，色譜圖見圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白溶劑在MRM 分析窗口對(duì)供試品溶液的測試不存在干擾，表明所建立的液質(zhì)方法專屬性良好。

圖2 空白溶劑(a)、12 個(gè)成分混合對(duì)照品(b)及金紅片樣品(c)的MRM 色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of blank sample(a),mixed reference substances of 12 components(b)and JHT sample(c)

2.4.2 線性范圍及定量下限考察 取“2.3.3”項(xiàng)下方法配制的系列不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的混合對(duì)照品溶液，平行3 份，按照“2.1”和“2.2”項(xiàng)下UPLC-TQ-MS條件分別進(jìn)樣分析并記錄上述12 個(gè)定量成分的峰面積，以各對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），對(duì)定量成分進(jìn)行線性回歸計(jì)算。結(jié)果表明12 個(gè)定量成分在線性范圍內(nèi)線性良好（表2），符合分析測試要求。

表2 12 個(gè)化合物的線性范圍考察結(jié)果Table 2 Results of liner regression of 12 components

2.4.3 重復(fù)性考察 按“2.3.1”項(xiàng)下方法平行制備6 份金紅片供試品溶液（批號(hào)190401），并按照“2.1”和“2.2”項(xiàng)下分析條件依次進(jìn)行測定，隨行當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線，記錄統(tǒng)計(jì)12 個(gè)定量成分的含量，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)及RSD 值，作為方法重復(fù)性結(jié)果。結(jié)果顯示，12 個(gè)定量成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為15.00、0.30、0.12、0.18、0.13、0.13、2.39、0.41、0.12、2.09、0.05、0.04 mg/g，RSD 值分別為0.7%、0.9%、1.8%、1.1%、1.2%、0.9%、1.0%、1.5%、1.2%、1.6%、1.1%、2.5%。結(jié)果表明，各定量成分的重復(fù)性良好，滿足分析測定要求。

2.4.4 精密度考察 取同一批金紅片樣品（批號(hào)190401），按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行3 份，并按照“2.1”和“2.2”項(xiàng)下分析測試條件進(jìn)行測定，隨行當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線，記錄統(tǒng)計(jì)12 個(gè)定量成分的峰面積并計(jì)算其RSD 值，所得結(jié)果作為日內(nèi)精密度考察結(jié)果。連續(xù)操作3 d，計(jì)算定量成分的峰面積及其RSD 值，作為方法日間精密度結(jié)果。各定量成分日內(nèi)精密度RSD 分別為1.0%、1.1%、0.9%、0.9%、1.2%、1.2%、0.4%、2.0%、0.8%、1.2%、1.1%、0.0%；日間精密度RSD 分別為1.1%、1.4%、1.4%、3.0%、1.0%、0.8%、1.5%、1.5%、1.9%、1.7%、1.9%、1.8%。12 個(gè)定量成分日內(nèi)及日間精密度的RSD 分別小于2.0%、3.0%，結(jié)果表明該方法日內(nèi)、日間精密度良好。

2.4.5 加樣回收率考察 取同一批金紅片樣品（批號(hào)190401，去除包衣，研磨，過50 目篩）約1.0 g，精密稱定，平行6 份。采用“2.3.2”項(xiàng)下所得各對(duì)照品溶液配制混合對(duì)照品溶液，使加入后的各成分含量分別為金紅片中相應(yīng)成分的含量。

供試品溶液并按照“2.1”和“2.2”項(xiàng)下定量測試條件進(jìn)樣分析，利用當(dāng)日隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各定量成分的含量，12 個(gè)定量成分的平均回收率分別為101.9%、101.2%、97.9%、96.8%、100.8%、100.1%、108.7%、100.0%、99.2%、102.0%、99.0%、103.2%，RSD 值分別為2.9%、2.4%、3.1%、3.8%、1.1%、1.9%、1.6%、3.0%、0.9%、2.4%、3.8%、2.6%。結(jié)果顯示，12 個(gè)化合物的加樣回收率為96.8%～108.7%，RSD 值不大于3.8%，表明該方法準(zhǔn)確度滿足測試要求。

2.4.6 穩(wěn)定性考察 按“2.3.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備金紅片供試品溶液（批號(hào)190401）作為穩(wěn)定性考察樣品，在15 ℃存放0、2、4、8、12、24 h 后按照“2.1”和“2.2”項(xiàng)下測試條件依次進(jìn)行測定，記錄統(tǒng)計(jì)12 個(gè)分析物的峰面積變化情況，以峰面積RSD 表示。結(jié)果顯示，12 個(gè)定量成分峰面積的RSD 分別為3.2%、2.7%、2.6%、3.4%、2.2%、2.0%、3.7%、3.3%、1.6%、1.9%、2.8%、3.0%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 樣品定量測定

取批號(hào)為180502、190304、190305、190306、190401、190402、190403、190404、190405、190406、190407、200701、200702、201101、201102 的金紅片，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”和“2.2”項(xiàng)下UPLC-TQ-MS 分析測試條件依次進(jìn)行測定，隨行當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定15 個(gè)批次金紅片12 個(gè)定量成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10.11～22.72 mg/g、0.16～0.43 mg/g、0.06～0.23 mg/g、0.13～0.42 mg/g、0.08～0.26 mg/g、0.08～0.25 mg/g、1.94～2.59 mg/g、0.20～0.96 mg/g、0.07～0.30 mg/g、1.72～2.14 mg/g、0.03～0.06 mg/g、0.03～0.06 mg/g。結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 檢測方法的選擇

川楝子為金紅片中的君藥，而川楝素被認(rèn)為是川楝子的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，但也可能是其主要毒性成分[4]。川楝素具有肝毒性[10,14-16]及生殖毒性[17]，小鼠口服急性毒性實(shí)驗(yàn)顯示，異川楝素的毒性遠(yuǎn)高于川楝素[18]?！吨袊幍洹?020年版一部[19]，川楝子的含量測定項(xiàng)下以川楝素為質(zhì)控指標(biāo)成分，采用了LC-MS 方法進(jìn)行定量分析。為提高金紅片產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，需對(duì)其中的毒性成分進(jìn)行含量限定，而HPLC 難以對(duì)微量成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量。目前，UPLCTQ-MS 技術(shù)的高靈敏、高選擇性、MRM 等特性在中藥質(zhì)量控制中具有廣闊的應(yīng)用前景[20]，故采用UPLC-TQ-MS 對(duì)復(fù)方進(jìn)行含量分析方法的建立。

表4 15 批次金紅片樣品中12 個(gè)成分的含量測定結(jié)果Table 4 Contents of 12 analytes in 15 batches of JHT

3.2 前處理方法及分析條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行了考察，考察了多種提取溶劑（純水、30%甲醇、60%甲醇、80%甲醇和純甲醇）以及不同超聲時(shí)間（15、30、45 min）對(duì)金紅片中12 個(gè)定量成分的影響。根據(jù)在不同條件下的各色譜峰的分離度及峰面積比較，最終選擇以80%甲醇作為提取溶劑，超聲提取30 min，做為金紅片樣品前處理?xiàng)l件。此外，本實(shí)驗(yàn)前期采用了正、負(fù)離子掃描模式對(duì)單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜響應(yīng)進(jìn)行初步探索，以選擇最佳離子監(jiān)測模式。結(jié)果顯示，莽草酸在負(fù)離子模式下靈敏度高，其他各成分在正離子模式下靈敏度高。最終按照各化合物在不同條件下的質(zhì)譜響應(yīng)結(jié)果，選擇了最佳的離子掃描模式以及最佳離子對(duì)，以使各目標(biāo)化合物均具有最好的質(zhì)譜響應(yīng)，確保能夠滿足準(zhǔn)確、快速的定性定量要求。

3.3 指標(biāo)性成分的選擇

中藥復(fù)方化學(xué)成分復(fù)雜，是由多成分共同作用于多靶點(diǎn)、多途徑而產(chǎn)生藥效[21]，故而對(duì)其產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制不能局限于單一指標(biāo)成分。作為一個(gè)有機(jī)的整體，其質(zhì)量控制方法的建立應(yīng)選擇多指標(biāo)成分且與功效成分或毒性成分相關(guān)聯(lián)。

在金紅片前期物質(zhì)基礎(chǔ)的研究中，采用UPLCQ/TOF-MS 技術(shù)及MassLynx V4.1、MetabolynxTM數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)金紅片全方及ig 給藥大鼠后生物樣本中的體內(nèi)外源物進(jìn)行檢識(shí)分析，表征金紅片的體外化學(xué)輪廓及體內(nèi)代謝輪廓，共檢識(shí)得到96 個(gè)化學(xué)成分以及163 個(gè)大鼠體內(nèi)外源物[22]。而后構(gòu)建了金紅片治療慢性淺表性胃炎的精細(xì)的藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測潛在活性成分，研究發(fā)現(xiàn)發(fā)揮藥效活性的成分主要為生物堿類、有機(jī)酸類和黃酮類[23]。

基于以上研究結(jié)果，定量成分的選擇主要依據(jù)以下原則：①金紅片化學(xué)成分研究中主含成分且涵蓋4 個(gè)組方藥味代表性結(jié)構(gòu)類型的成分（川楝素、延胡索乙素和槲皮素）；②金紅片體內(nèi)代謝研究中吸收入血的原型成分，且其代謝產(chǎn)物較豐富的成分（普洛托品、別隱品堿、延胡索乙素、紫堇堿和巴馬?。?；③金紅片網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中預(yù)測具有治療慢性淺表性胃炎的潛在活性成分（綠原酸、異綠原酸B 和異綠原酸C）；④《中國藥典》2020年版[14]規(guī)定各單味藥質(zhì)控指標(biāo)性成分、文獻(xiàn)報(bào)道具有相關(guān)活性的成分及毒性成分（川楝素、異川楝素、延胡索乙素和莽草酸）。綜上，選擇12 個(gè)成分作為指標(biāo)成分，建立多指標(biāo)成分含量測定研究方法，同時(shí)進(jìn)一步考察這些成分在多批次產(chǎn)品中的含量變化，為建立現(xiàn)代化金紅片產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

3.4 定量測定結(jié)果分析

依據(jù)現(xiàn)行《中國藥典》2020年版[19]對(duì)于川楝子所含毒性成分川楝素的規(guī)定（0.06%～0.20%），川楝子的用法與用量（5～10 g/d）以及金紅的日用量（1 次5 片，3 次/d）。據(jù)此，金紅片所含川楝素（C30H38O11）不超過2.96 mg/g 時(shí)處于安全劑量水平。定量分析所測定15 批次的金紅片每片所含川楝素平均值為40 μg/g，均不超過0.06 mg/g（批號(hào)190306），結(jié)果顯示多批次川楝素的含量均處于所規(guī)定的安全劑量范圍。

根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局–國家藥品標(biāo)準(zhǔn)頒布件CXZB0500279 蘇中的規(guī)定，本品每片含紅花八角葉以莽草酸（C7H10O5）計(jì)，不得超過50.00 mg，本次實(shí)驗(yàn)所測定15 批次的金紅片每片所含莽草酸平均值為6.48 mg，所含莽草酸含量最高的批次為200702，該批次金紅片每片所含莽草酸為10.22 mg。CXZB0500279 蘇中的規(guī)定顯示，金紅片每片含延胡索以延胡索乙素（C21H25NO4）計(jì)，不得少于0.20 mg。本次實(shí)驗(yàn)所測定15 批次的金紅片每片所含延胡索乙素平均值為1.01 mg，所含延胡索乙素最低含量為0.87 mg（批號(hào)180502）。依據(jù)本次實(shí)驗(yàn)測量數(shù)據(jù)對(duì)各批次金紅片所含莽草酸以及延胡索乙素含量分析顯示，所測定的15 批次金紅片含莽草酸均不超過50 mg，含延胡索均不少于0.20 mg，均符合CXZB0500279 蘇下對(duì)金紅片的質(zhì)量控制規(guī)定。

3.5 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)首次采用UPLC-TQ-MS 技術(shù)對(duì)不同批次金紅片質(zhì)量進(jìn)行了深入探索。綜合考慮組方藥味的主含特征成分及活性、毒性成分，建立了包含莽草酸、延胡索乙素等12 個(gè)代表性成分的同時(shí)定量方法，對(duì)15 批市售制劑進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。上述建立的UPLC-TQ-MS 定性定量方法為進(jìn)一步提升制劑整體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了重要證據(jù)，為金紅片進(jìn)一步的藥效評(píng)價(jià)，藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升奠定了一定的基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突