李卓倫，楊彥濤，孫 志，師瑩瑩，高一喬，賈雪冬，康 建，周 霖，賈清泉，張曉堅(jiān)*

1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450052

2.河南省精準(zhǔn)臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052

燈盞生脈膠囊由燈盞細(xì)辛、麥冬、人參和五味子4 味藥材提取加工制成[1]，具有益氣養(yǎng)陰、活血健腦的功效，臨床上常用于治療中風(fēng)后遺癥、高脂血癥、冠心病心絞痛、缺血性心腦血管疾病等病癥[2-4]。但燈盞生脈膠囊藥效物質(zhì)的相關(guān)研究匱乏，嚴(yán)重限制了對(duì)其在臨床上精準(zhǔn)用藥的指導(dǎo)。因此亟需建立一種高通量、高分辨率、高靈敏度且能科學(xué)預(yù)測(cè)其在人體內(nèi)作用靶點(diǎn)的方法對(duì)燈盞生脈膠囊藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行分析。

超高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）因其優(yōu)異的分辨能力、良好的質(zhì)量準(zhǔn)確度和靈敏度，可在一個(gè)分析周期內(nèi)獲得大量高精度的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息，現(xiàn)已逐步成為中藥藥效成分快速準(zhǔn)確鑒定的重要手段。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)，其融合系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、計(jì)算生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容，進(jìn)行“疾病-表型-基因-藥物”多層次網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，從整體的角度探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)，指導(dǎo)合理用藥[5-6]。

本實(shí)驗(yàn)利用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 技術(shù)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)燈盞生脈膠囊中化合物成分構(gòu)成及其相關(guān)靶點(diǎn)、疾病進(jìn)行了鑒定分析。通過(guò)利用高分辨質(zhì)譜獲得的精確相對(duì)分子質(zhì)量、保留時(shí)間及碎片離子信息，共獲得黃酮類、木脂素類、酚酸類、皂苷類和其他類共5 類30 種化合物，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析心絞痛相關(guān)的靶點(diǎn)，構(gòu)建燈盞生脈膠囊“化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，最終獲得對(duì)治療心絞痛起藥效作用的化合物。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步明確燈盞生脈膠囊藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和指導(dǎo)臨床合理用藥奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

UHPLC-Q-Orbitrap 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)：Ultimate 3000 超高效液相色譜（Dionex 公司，美國(guó)）串聯(lián) Q-Exactive 型高分辨質(zhì)譜（Thermo FisherScientific 公司，美國(guó)）；WatersACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters 公司，美國(guó)）；Master-E 型超純水機(jī)（上海和泰儀器有限公司）；New Classic MS 型十萬(wàn)分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo 上海有限公司）；MDS-6G 型多通量微波消解/萃取系統(tǒng)（上海新儀微波化學(xué)科技有限公司）。

1.2 試劑

燈盞生脈膠囊（云南生物谷藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)Z20026439）；對(duì)照品琥珀酸（批號(hào)MUST-17030502）、原兒茶酸（批號(hào)MUST-16032112）、綠原酸（批號(hào)MUST-16031610）、原兒茶醛（批號(hào)MUST-15091608）、咖啡酸（批號(hào)MUST-15090803）、阿魏酸（批號(hào)MUST-15091605）、木犀草素（批號(hào)MUST-16011015）、芹菜素（批號(hào)MUST-16061301）、山柰酚（批號(hào)MUST-16032801）、戈米辛D（批號(hào)MUST-17120902）、戈 米 辛 J（批 號(hào)MUST-17102802）、人參皂苷Rg3（批號(hào)MUST-17030711）、五味子酚（批號(hào)MUST-17040209）、五味子甲素（批號(hào)MUST-17022401）、五味子乙素（批號(hào) MUST-17031606）、五味子丙素（批號(hào)MUST-17031816）均購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司；以上對(duì)照品經(jīng)峰面積歸一化質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于99%。甲酸、甲醇及乙腈為色譜純級(jí)，美國(guó)Fisher 公司；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱為 Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫：0～1 min，5% A；1～5 min，5%～35% A；5～15 min，35%～40% A；15～25 min，40%～50% A；25～32 min，50%～65% A；32～42 min，65%～100%A；42～47 min，100% A；47～47.1 min，100%～5% A；47.1～50 min，5% A；體積流量為0.2 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；柱溫40 ℃。

2.1.2 質(zhì)譜條件 UHPLC-Q Exactive 液質(zhì)聯(lián)用儀離子源采用HESI 源（heated ESI），輔助氣體積流量為10 arb，輔助氣溫度為300 ℃，離子傳輸管溫度320 ℃；正離子模式下：鞘氣體積流量為40 arb，噴霧電壓為3.50 kV；負(fù)離子模式下：鞘氣體積流量為38 arb，噴霧電壓為2.80 kV。掃描方式為正、負(fù)離子Full MS/dd-MS2 模式，其中包括1 次一級(jí)全掃描（分辨率為70 000 FWHM）和1 次數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)掃描（分辨率為17 500 FWHM）2 個(gè)事件，質(zhì)荷比窗口寬度設(shè)置為2，碰撞能梯度為20、50、100 eV，掃描范圍m/z80～1200。

2.2 供試品溶液的制備

取燈盞生脈膠囊3 粒，去殼后，取內(nèi)容物約1.0 g，精密稱定后，置于具塞錐形瓶中，精密量取并加入純甲醇50 mL，密塞并稱定質(zhì)量，微波萃取（功率600 W）17 min，搖勻后經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得樣品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

取各對(duì)照品約1.0 mg，精密稱定后，分別置于10 mL 量瓶中，加入純甲醉溶解并稀釋至刻度，搖勻，最終制備成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液；分別精密量取上述單一對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，將其混合后加入甲醇稀釋，最終制備成各對(duì)照品質(zhì)量濃度均為1 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.4 化合物結(jié)構(gòu)分析

依照“2.1”項(xiàng)下優(yōu)化后的色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣后，根據(jù)高分辨質(zhì)譜提供的準(zhǔn)分子離子和加荷離子等信息推測(cè)并得到各成分的精確相對(duì)分子質(zhì)量，經(jīng)Xcalibar 3.0 軟件擬合分子式，并與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，以對(duì)各色譜峰進(jìn)行初步推測(cè)，再依據(jù)對(duì)照品、Mass Frontier 軟件或參考文獻(xiàn)、Mass Bank、Chemical Book等數(shù)據(jù)庫(kù)提供的保留時(shí)間及高能碰撞下產(chǎn)生的多級(jí)碎片離子信息，進(jìn)一步準(zhǔn)確識(shí)別化學(xué)成分。

2.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.5.1 燈盞生脈膠囊成分-靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 本研究以藥物成分含量高低、是否為入血成分和文獻(xiàn)報(bào)道有重要藥理作用為依據(jù)進(jìn)行生物活性成分篩選，通過(guò)ChemBioDraw Ultra 12.0 繪制各成分的結(jié)構(gòu)并得到各化合物的Smile 號(hào)、InChIkey 號(hào)等相關(guān)信息，利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)、STITCH 數(shù)據(jù)庫(kù)查找各成分對(duì)應(yīng)的相關(guān)靶點(diǎn)，并剔除無(wú)相關(guān)靶點(diǎn)的成分。由于不同數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)命名存在不規(guī)范性，故借助Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將所有靶點(diǎn)名稱統(tǒng)一為官方基因名（official gene symbol）。最后借助Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建“燈盞生脈膠囊”活性成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，以節(jié)點(diǎn)（node）表示成分和作用靶點(diǎn)，以邊（edge）表示成分與靶點(diǎn)間的相互作用[7-9]。

2.5.2 心絞痛相關(guān)靶點(diǎn)的收集 以“angina”為檢索詞，通過(guò)OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)、TDD 數(shù)據(jù)庫(kù)、GAD 數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)、DigSee 數(shù)據(jù)庫(kù)和DisGenet數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)心絞痛相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，刪除重復(fù)得到心絞痛相關(guān)的疾病靶點(diǎn)[7-9]。

2.5.3 基于藥物和疾病靶點(diǎn)交集網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

（1）蛋白互作（protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建：通過(guò)借助Cytoscape 3.6.1 軟件中BisoGenet 3.0.0 插件所包含的 Database of Interacting Proteins（DIP）、Biological General Respository for Interaction Datasets（BIOGRID）、Human Protein Reference Database（HPRD）、IntAct Molecular Interaction Database（INTACT）、Molecular Interaction Database（MINT）、Biomolecular Interaction Network Database（BIND）等6 種蛋白相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)，燈盞生脈膠囊“活性成分-靶點(diǎn)”的PPI 網(wǎng)絡(luò)和“疾病-靶點(diǎn)”的PPI 網(wǎng)絡(luò)得以構(gòu)建。相關(guān)參數(shù)設(shè)置為：Organism：Homo sapiens（Human）；Map input identifiers list to：Gene identifiers only；Data settings:Protein Protein Interaction，勾選DIP/BIOGRID/HRPD/INTACT/MINT/BIN[7-9]。

（2）關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選：利用Cytoscape 軟件中的Merge 功能將兩個(gè)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行整合提取其交集網(wǎng)絡(luò)，并采用NetworkAnalyzer 功能對(duì)網(wǎng)絡(luò)做拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，得到的網(wǎng)絡(luò)連接度（Degree）值越高，表明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要；選擇Degree 大于其中位數(shù)值兩倍以上的節(jié)點(diǎn)作為關(guān)鍵候選靶點(diǎn)，然后基于CytoNCA插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的6個(gè)拓?fù)涮卣髦刀戎行男裕╠egree centrality，DC）、介度中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closenesscentrality，CC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（network centrality，NC）和局部邊連通性（localaverage connectivity，LAC）提取分析這些候選節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，這6 個(gè)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征值越大，在網(wǎng)絡(luò)中越重要，選擇以上6 個(gè)特征值均大于其相應(yīng)中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)[7-9]。

3 結(jié)果

本研究鑒定得到黃酮類、木脂素類、酚酸類、皂苷類和其他類共5 類30 種化合物，供試品溶液的總離子流圖見(jiàn)圖1，化合物質(zhì)譜信息見(jiàn)表1。

圖1 供試品溶液總離子流圖Fig.1 Total ion chromatography of test solution

表1 燈盞生脈膠囊鑒定的成分Table 1 Chemical components of Dengzhan Shengmai Capsules

續(xù)表1

續(xù)表1

3.1 黃酮類

黃酮類化合物廣泛分布于自然界的植物中，是一類具有C6-C3-C6 基本骨架、以2-苯基色原酮為基本骨架衍生而來(lái)的化合物，其在質(zhì)譜條件下的裂解通常圍繞三碳鏈進(jìn)行，具有相似的裂解規(guī)律。本實(shí)驗(yàn)共鑒定得到黃酮類化合物5 種，包括野黃芩苷（11）、木犀草素（16）、芹菜素（18）、山柰酚（19）及甲基麥冬黃酮B（26）。

以總離子流圖中16 號(hào)峰為例，該化合物在正離子模式下獲得分子離子峰287.05，經(jīng)Xcalibur 軟件擬合得到其對(duì)應(yīng)分子式C15H10O6。通過(guò)分析其二級(jí)質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)得到269.04、153.02、135.04、117.03、89.03 等多個(gè)擁有較好響應(yīng)的碎片離子峰，分別對(duì)應(yīng)[M＋H－H2O]+、[M＋H－C8H6O2]+、[M＋HC7H7O4]+、[M＋H－C7H7O4－H2O]+和[M＋HC7H7O4－H2O－CO]+。經(jīng)與對(duì)照品保留時(shí)間及二級(jí)碎片離子信息進(jìn)行對(duì)比，并結(jié)合對(duì)應(yīng)對(duì)照品化合物結(jié)構(gòu)式進(jìn)行驗(yàn)證，最終確定16 號(hào)峰對(duì)應(yīng)化合物為木犀草素。木犀草素裂解途徑見(jiàn)圖2。

圖2 木犀草素裂解途徑Fig.2 Fragmentation pathway of luteolin

3.2 木脂素類

藥材五味子中富含木脂素類化合物，此類木脂素通常具有聯(lián)苯環(huán)辛二烯結(jié)構(gòu)，可在人體內(nèi)發(fā)揮肝保護(hù)和抗氧化作用。本實(shí)驗(yàn)共鑒定出木脂素類化合物6 種，包括戈米辛D（22）、戈米辛J（23）、五味子酚（27）、五味子甲素（28）、五味子乙素（29）、五味子丙素（30）。

以總離子流圖中28 號(hào)峰為例，該化合物在正離子模式下獲得分子離子峰417.23，經(jīng)Xcalibur 軟件擬合得到其對(duì)應(yīng)分子式C24H32O6。通過(guò)分析其二級(jí)質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)得到402.20、386.21、347.15、316.13、301.11、285.11 等多個(gè)擁有較好響應(yīng)的碎片離子峰，分別對(duì)應(yīng)[M＋H－CH3]+、[M＋H－CH3O]+、[M＋H－C5H10]+、[M＋H－C5H10－CH3O]+、[M＋HC5H10－CH3O－CH3]+、[M＋H－C5H10－CH3OCH3O]+。經(jīng)與對(duì)照品保留時(shí)間及二級(jí)碎片離子信息進(jìn)行對(duì)比，并結(jié)合對(duì)應(yīng)對(duì)照品化合物結(jié)構(gòu)式進(jìn)行驗(yàn)證，最終確定28 號(hào)峰對(duì)應(yīng)化合物為五味子甲素。五味子甲素裂解途徑見(jiàn)圖3。

圖3 五味子甲素裂解途徑Fig.3 Fragmentation pathway of schizandrin A

3.3 酚酸類

酚酸類化合物是在一個(gè)苯環(huán)上有多個(gè)酚羥基取代的芳香羧酸類化合物，其具有很強(qiáng)的抗氧化、抗菌消炎和調(diào)血脂等藥理作用。本實(shí)驗(yàn)共鑒定出酚酸類化合物6 種，包括龍膽酸（5）、原兒茶酸（6）、綠原酸（7）、咖啡酸（10）、阿魏酸（12）、水楊酸（15）。

以總離子流圖中7 號(hào)峰為例，該化合物在負(fù)離子模式下獲得分子離子峰353.09，經(jīng)Xcalibur 軟件擬合得到其對(duì)應(yīng)分子式C16H18O9。通過(guò)分析其二級(jí)質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)得到191.06、173.04、161.02、135.04、109.03 等多個(gè)擁有較好響應(yīng)的碎片離子峰，分別對(duì)應(yīng)[M－H－C9H6O3]-、[M－H－C9H6O3－H2O]-、[M－H－C7H12O6]-、[M－H－C7H10O6－CO]-、[MH－C7H10O6－CO－C2H2]-。經(jīng)與對(duì)照品保留時(shí)間及二級(jí)碎片離子信息進(jìn)行對(duì)比，并結(jié)合對(duì)應(yīng)對(duì)照品化合物結(jié)構(gòu)式進(jìn)行驗(yàn)證，最終確定7 號(hào)峰對(duì)應(yīng)化合物為綠原酸。綠原酸的裂解途徑見(jiàn)圖4。

圖4 綠原酸裂解途徑Fig.4 Fragmentation pathway of chlorogenic acid

3.4 皂苷類

皂苷類化合物是苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷，其主要分布于陸地高等植物中，具有廣泛的藥理活性[14]。本實(shí)驗(yàn)共鑒定出皂苷類化合物3 種，包括人參皂苷Ro（20）、人參皂苷Rg3（24）、人參皂苷Rg2（25）。

以總離子流圖中24 號(hào)峰為例，該化合物在負(fù)離子模式下獲得分子離子峰783.49，經(jīng)Xcalibur 軟件擬合得到其對(duì)應(yīng)分子式C42H72O13。通過(guò)分析其二級(jí)質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)得到621.44、459.39、375.29、161.04等多個(gè)擁有較好響應(yīng)的碎片離子峰，分別對(duì)應(yīng)[MH－C6H10O5]-、[M－H－C6H10O5－C6H10O5]-、[MH －C6H10O5－C6H10O5－C6H12]-、[M－H －C36H62O8]-。經(jīng)與對(duì)照品保留時(shí)間及二級(jí)碎片離子信息進(jìn)行對(duì)比，并結(jié)合對(duì)應(yīng)對(duì)照品化合物結(jié)構(gòu)式進(jìn)行驗(yàn)證，最終確定24 號(hào)峰對(duì)應(yīng)化合物為人參皂苷Rg3。人參皂苷Rg3的裂解途徑見(jiàn)圖5。

圖5 人參皂苷Rg3 裂解途徑Fig.5 Fragmentation pathway of ginsenoside Rg3

3.5 其他類

此外，本實(shí)驗(yàn)還從燈盞生脈膠囊中檢測(cè)出葡萄糖醛酸、蘋(píng)果酸、枸櫞酸、琥珀酸、原兒茶醛、鄰苯二甲酸、咖啡酸甲酯、咖啡酸、燈盞甲素、乙酸松油酯等，相關(guān)信息見(jiàn)表1。

3.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

3.6.1 燈盞生脈膠囊入血成分相關(guān)靶點(diǎn) 通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)、STITCH 數(shù)據(jù)庫(kù)及SwissTarget Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)燈盞生脈膠囊所含成分及相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，共得到16 個(gè)入血成分（琥珀酸、原兒茶酸、綠原酸、原兒茶醛、咖啡酸、阿魏酸、木犀草素、芹菜素、山柰酚、戈米辛D、戈米辛J、人參皂苷Rg3、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素）及其相關(guān)255 個(gè)作用靶點(diǎn)，并依此構(gòu)建了燈盞生脈膠囊的“成分-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖6）。該網(wǎng)絡(luò)包含271 個(gè)節(jié)點(diǎn)和500 條邊，其中紅色三角形代表16 個(gè)入血成分，綠色矩形代表255 個(gè)作用靶點(diǎn)。3.6.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

圖6 燈盞生脈膠囊入血成分“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 “Compound-Target” network of ingredients of Dengzhan Shengmai Capsules in blood

（1）燈盞生脈膠囊“入血成分-靶點(diǎn)”P(pán)PI 網(wǎng)絡(luò)：燈盞生脈膠囊入血成分靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中包含6787 個(gè)節(jié)點(diǎn)和164 190 條邊，表明有6787 個(gè)相互作用蛋白及164 190 種相互作用關(guān)系。

（2）心絞痛相關(guān)“疾病-靶點(diǎn)”P(pán)PI 網(wǎng)絡(luò)：利用OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)、TDD 數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)、Disgenet 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)心絞痛相關(guān)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，刪除重復(fù)后共得到251 個(gè)作用靶點(diǎn)，并依此構(gòu)建疾病靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。在心絞痛相關(guān)靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中有6643 個(gè)相互作用蛋白和147 457 條相互作用關(guān)系。

3.6.3 核心靶點(diǎn)篩選 為了揭示燈盞生脈膠囊治療心絞痛的藥理學(xué)機(jī)制，本研究將251 個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)與255 個(gè)成分相關(guān)作用靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，共得到36個(gè)燈盞生脈膠囊治療心絞痛的潛在直接作用靶點(diǎn)，包括MAPT、ADRB1、PLAU、TNF、SELP、NOS3、SLC6A2、AR、AKT1、VEGFA、MMP9、IL10、IL6、TP53、MMP1、PPARG、HMOX1、ICAM1、IL2、IFNG、SLC2A4、CD40LG、MMP3、ESR1、SCN5A、F10、F7、SERPINE1、INS、NOS2、F2、SELE、VCAM1、NR3C2、HTR1B 和KCNH2。

此外，將燈盞生脈膠囊“入血成分-靶點(diǎn)”的PPI網(wǎng)絡(luò)與心絞痛“疾病-靶點(diǎn)”的PPI 網(wǎng)絡(luò)整合取交集，交集網(wǎng)絡(luò)中共包含4456 個(gè)節(jié)點(diǎn)和120 926 條邊；對(duì)交集網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，degree 值的中位數(shù)為33，故選擇degree≥66（2 倍中位數(shù)值）的節(jié)點(diǎn)作為候選靶點(diǎn)，最終共篩選得到1089 個(gè)候選靶點(diǎn)；對(duì)候選靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行提取分析，并以“BC、CC、EC、LAC、NC”分別大于其相應(yīng)中位數(shù)為篩選條件，即BC≥439.461、CC≥0.51、EC≥0.019 3、LAC≥17.961、NC≥19.786，進(jìn)一步篩選核心靶點(diǎn)，最終得到燈盞生脈膠囊治療心絞痛的核心靶點(diǎn)共368 個(gè)。

3.6.4 燈盞生脈膠囊治療心絞痛預(yù)測(cè)靶點(diǎn)富集分析通過(guò)DAVID 對(duì)燈盞生脈膠囊治療心絞痛的368 個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路分析。圖7～9 顯示了在生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組件中排名前20 的條目。KEGG 富集分析得到燈盞生脈膠囊對(duì)心絞痛有顯著影響的通路，表2 列出了P＜0.05 的30 條顯著富集的通路，結(jié)果表明，燈盞生脈膠囊治療心絞痛的通路主要有MAPK 信號(hào)通路、p53 信號(hào)通路等[21-23]。

圖7 燈盞生脈膠囊治療心絞痛的核心靶點(diǎn)的生物過(guò)程GO 分析Fig.7 Gene Ontology(GO)biological process analysis on key targets of Dengzhan Shengmai Capsules against angina

圖8 燈盞生脈膠囊治療心絞痛的核心靶點(diǎn)的細(xì)胞組件GO 分析Fig.8 Gene Ontology(GO)cellular components analysis on key targets of Dengzhan Shengmai Capsules against angina

圖9 燈盞生脈膠囊治療心絞痛的核心靶點(diǎn)的分子功能GO 分析Fig.9 Gene Ontology(GO)molecular function analysis on key targets of Dengzhan Shengmai Capsules against angina

表2 KEGG 富集分析Table 2 KEGG enrichment analysis

續(xù)表2

4 討論

燈盞生脈膠囊對(duì)心絞痛療效確切，但對(duì)其藥效物質(zhì)的相關(guān)研究匱乏，限制了對(duì)其在臨床上精準(zhǔn)用藥的指導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)燈盞生脈膠囊進(jìn)行定性分析，共鑒定得到31 種化合物，包括黃酮類化合物5種、木脂素類化合物6 種、酚酸類化合物6 種、皂苷類化合物3 種和其他類10 種。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)其中16 個(gè)入血成分進(jìn)行分析，共得到燈盞生脈膠囊治療心絞痛的368 個(gè)核心靶點(diǎn)及MAPK 信號(hào)通路和p53 信號(hào)通路等主要通路，充分體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用發(fā)揮治療效果的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)為探索燈盞生脈膠囊藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了新的思路，并為指導(dǎo)臨床合理用藥提供了科學(xué)的理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突