黃 強(qiáng)，常金霞，鄭 碩，牛少輝，曹 乾，方毅娜，曹建春，張東萍

糖尿病足是糖尿病患者的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，可伴有腎病、神經(jīng)病變、酮癥酸中毒和(或)心肌病[1]。糖尿病足年發(fā)病率在2%左右，在糖尿病患者中發(fā)病率為4.5%～10.0%，其中約66%的糖尿病足患者需要住院治療[2]。糖尿病足會直接導(dǎo)致患者生活能力下降，使生活質(zhì)量惡化，并給醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。因此，開發(fā)促進(jìn)糖尿病足創(chuàng)面快速愈合的治療藥物具有重要經(jīng)濟(jì)及社會價(jià)值。據(jù)報(bào)道顯示，糖尿病患者創(chuàng)面愈合緩慢，與炎性細(xì)胞浸潤并產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、IL-1β等炎性細(xì)胞因子密切相關(guān)[4-5]。此外，持續(xù)高血糖抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)活性，從而降低血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)含量，導(dǎo)致糖尿病創(chuàng)面愈合延遲[6]。因此，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面血管生成將是治療糖尿病足的方向之一。當(dāng)歸補(bǔ)血湯的主要功效為補(bǔ)氣生血，對產(chǎn)后血脫、勞傷血虛及瘡瘍潰后膿血過多等疾病具有良好的治療效果[7-8]。因此，本研究應(yīng)用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病足大鼠模型，探究當(dāng)歸補(bǔ)血湯能否通過抑制炎癥反應(yīng)和促進(jìn)血管生成加快糖尿病足創(chuàng)面的愈合。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 選取體質(zhì)量250～280 g的成年健康清潔級SD大鼠50只，均為雄性。飼養(yǎng)在溫度為(24±1)℃、相對濕度為45%～55%、12 h明暗周期環(huán)境中，自由飲水和進(jìn)食。SD大鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(京)2016-0011。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 鏈脲佐菌素(S8050，索萊寶)，血糖試紙(HEA-STP30，歐姆龍)，大鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒(ab236712，Abcam)，大鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒(ab234570，Abcam)，大鼠IL-1β ELISA檢測試劑盒(ab255730，Abcam)，大鼠VEGF ELISA檢測試劑盒(ab100786，Abcam)，Trizol試劑(15596-026，Invitrogen)，TIANScript RT KIT (KR104-02，天根生物)，SuperReal PreMix Plus (FP205，天根生物)；根據(jù)《內(nèi)外傷辨惑論》，取黃芪30 g和當(dāng)歸6 g，研磨后加水熬制成湯劑備用，即為當(dāng)歸補(bǔ)血湯[9-10]。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 血糖儀(HGM-114，歐姆龍)，多功能酶標(biāo)儀(Varioskan LUX，ThermoFisher)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器(HM-PCR，恒美)。

1.4方法

1.4.1糖尿病足模型制備：大鼠常規(guī)喂養(yǎng)1周后，更換為高脂飼料繼續(xù)喂養(yǎng)1個(gè)月，禁食1 d，腹腔注射含1%鏈脲佐菌素的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(pH=4.2，0.1 mol/L)[1]，注射劑量根據(jù)55 mg/kg計(jì)算，對照組注射同等體積的緩沖液。于第3天和第5天尾靜脈取血，檢測空腹血糖，若血糖值均>16.7 mmol/L則造模成功[6]。選取40只造模成功的糖尿病大鼠模型和10只對照大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉，注射劑量根據(jù)0.3 ml/100 g計(jì)算，于右側(cè)足部背面造3 mm×3 mm矩形創(chuàng)口。

1.4.2分組與給藥：造模成功的糖尿病足大鼠模型隨機(jī)分為模型組、低劑量組(生藥濃度2 g/kg)、中劑量組(生藥濃度4 g/kg)、高劑量組(生藥濃度8 g/kg)，每組10只。當(dāng)歸補(bǔ)血湯給藥方式為灌胃，每天1次，給藥量以1 ml/100 g計(jì)算。中劑量組給藥劑量(生藥濃度4 g/kg)是根據(jù)人使用量等劑量轉(zhuǎn)換，以此劑量為基礎(chǔ)，低劑量組減少50%，高劑量組增加1倍，觀察治療效果是否有劑量依賴效應(yīng)。對照組和模型組的灌胃藥物替換為生理鹽水。給藥1周后處死動物，檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.4.3足部創(chuàng)面面積計(jì)算：在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)對創(chuàng)面愈合情況進(jìn)行拍照，應(yīng)用IPP 6.0軟件測量并計(jì)算創(chuàng)面面積[3]。

1.4.4ELISA檢測：大鼠內(nèi)眥取血，分離血清約300 μl，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格參照ELISA試劑盒說明書，分別檢測大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β和VEGF含量。

1.4.5qRT-PCR檢測：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測新生肉芽組織中的IL-6、TNF-α、IL-1β和VEGF mRNA表達(dá)水平。取大鼠足部新生肉芽組織，面積約10 mm2，于液氮中凍存，采用Trizol法提取肉芽組織總RNA。反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄參數(shù)如下：95℃預(yù)變性15 min，95℃退火10 s，58℃延伸30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，IL-6、TNF-α、IL-1β和VEGF mRNA表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法計(jì)算。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取其平均值。IL-6、TNF-α、IL-1β、VEGF和β-actin的引物序列見表1。

2 結(jié)果

2.1當(dāng)歸補(bǔ)血湯對糖尿病足大鼠足部創(chuàng)面愈合的影響 給藥1周后，各組足部創(chuàng)面愈合情況見圖1。對照組創(chuàng)面已結(jié)痂，基本愈合，創(chuàng)面面積(3.23±0.42)mm2；模型組創(chuàng)面部位紅腫，遠(yuǎn)未達(dá)到愈合狀態(tài)，創(chuàng)面面積(17.15±2.31)mm2；低、中、高劑量組創(chuàng)面面積分別為(13.62±1.26)mm2、(9.44±0.83)mm2、(5.35±0.71)mm2，紅腫程度逐漸減輕。模型組創(chuàng)面面積大于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。低、中、高劑量組創(chuàng)面面積均小于模型組，且隨著給藥劑量增大，創(chuàng)面面積逐漸變小，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見圖2。

圖1 5組大鼠足部創(chuàng)面愈合情況

圖2 5組大鼠足部創(chuàng)面面積比較

2.2當(dāng)歸補(bǔ)血湯對糖尿病足大鼠血清炎性細(xì)胞因子的影響 模型組血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。低、中、高劑量組血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量均低于模型組，高劑量組低于中、低劑量組，中劑量低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表2和圖3。

圖3 5組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量比較

表2 5組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量

2.3當(dāng)歸補(bǔ)血湯對糖尿病足大鼠血清VEGF含量的影響 對照組血清VEGF含量為(37.06±3.21)ng/L，模型組為(24.52±2.16)ng/L，低、中、高劑量組分別為(32.76±3.43)ng/L、(39.05±5.23)ng/L、(53.70±7.84)ng/L。模型組血清VEGF含量低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。低、中、高劑量組血清VEGF含量均高于模型組，高劑量組高于中、低劑量組，中劑量組高于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

圖4 5組大鼠血清VEGF含量比較

2.4當(dāng)歸補(bǔ)血湯對糖尿病足大鼠新生肉芽組織TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)的影響 模型組新生肉芽組織TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；低、中、高劑量組新生肉芽組織TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)均較模型組下降，高劑量組低于中、低劑量組，中劑量組低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表3和圖5。

圖5 5組大鼠新生肉芽組織TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)水平比較

表3 5組大鼠新生肉芽組織TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)水平

2.5當(dāng)歸補(bǔ)血湯對糖尿病足大鼠新生肉芽組織VEGF mRNA表達(dá)的影響 對照組新生肉芽組織VEGF mRNA表達(dá)為2.85±0.12，模型組為0.67±0.06，低、中、高劑量組分別為0.89±0.08、1.23±0.10、2.24±0.13。模型組新生肉芽組織VEGF mRNA表達(dá)低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；低、中、高劑量組新生肉芽組織VEGF mRNA表達(dá)均較模型組升高，高劑量組高于中、低劑量組，中劑量組高于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖6。

圖6 5組大鼠新生肉芽組織VEGF mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

糖尿病足是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，在全世界范圍內(nèi)，是非創(chuàng)傷性截肢的主要原因，10%～15%的患者出現(xiàn)足部潰瘍[11-12]。而大多數(shù)糖尿病足患者不能及時(shí)治愈或愈合欠佳，常導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，如皮膚、軟組織、骨骼或全身感染，甚至截肢[13-14]。造成糖尿病足創(chuàng)面愈合延遲的因素包括血糖水平高、胰島素抵抗、膠原蛋白沉積、血管生成障礙、血液供應(yīng)減少和浸潤反應(yīng)延遲等[2]。另外，創(chuàng)面部位炎性細(xì)胞浸潤、促炎細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-6、IL-1β)水平升高在糖尿病足的發(fā)展過程中起著重要作用[4-5]?；谝豁?xiàng)前瞻性臨床研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病相關(guān)的視網(wǎng)膜病變中，血清IL-1β、TNF-α和VEGF濃度對視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展具有重要影響，并且其含量與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[15]。還有研究表明，糖尿病引起的并發(fā)癥多與炎性細(xì)胞因子相關(guān)，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)或是治療糖尿病并發(fā)癥的有效手段[16]。此外，有研究觀察到在糖尿病足綜合征患者中血管生成能力不足[17]。原因是糖尿病患者持續(xù)的高血糖水平會使HIF-1α失活，抑制VEGF的產(chǎn)生，導(dǎo)致糖尿病足創(chuàng)面愈合延遲[6]。一項(xiàng)隊(duì)列研究顯示，糖尿病足患者血清VEGF的含量高于對照組，但低于糖尿病對照者，并且VEGF-A的濃度增加與糖尿病足風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)[18]。因此，抑制炎性細(xì)胞因子，增加創(chuàng)面血管的生成將是治療糖尿病足重要方法。

當(dāng)歸補(bǔ)血湯的主要作用為補(bǔ)氣生血，主要用于產(chǎn)后血脫、勞傷血虛及瘡瘍潰后膿血過多等治療。在臨床中，已有中醫(yī)學(xué)者將當(dāng)歸補(bǔ)血湯用于糖尿病足的治療，能夠促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面的修復(fù)[7-8]。在糖尿病足潰瘍大鼠模型中，黃芪可有效減小創(chuàng)面面積，抑制炎癥反應(yīng)并促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖[19]。另外一項(xiàng)研究也顯示，當(dāng)歸補(bǔ)血湯能有效改善鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病足大鼠模型肢端壞疽[20]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)歸補(bǔ)血湯能有效降低糖尿病足大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量，以及創(chuàng)面新生肉芽組織TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA的表達(dá)水平，從而抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。此外，當(dāng)歸補(bǔ)血湯在血管生成方面能夠發(fā)揮重要作用，可通過VEGF途徑促進(jìn)肝纖維化大鼠模型、心肌梗死大鼠模型和腦缺血再灌注損傷大鼠模型新生血管的生成[21-23]。但是，當(dāng)歸補(bǔ)血湯能否在糖尿病足大鼠模型中發(fā)揮同樣的促進(jìn)血管生成作用尚未證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可提高糖尿病足大鼠血清VEGF含量，并促進(jìn)新生肉芽組織VEGF mRNA表達(dá)。因此，糖尿病足大鼠創(chuàng)面愈合可能與新生血管有關(guān)。

本研究也存在一定的不足，如藥物干預(yù)時(shí)間稍短。此外，糖尿病足潰瘍形成機(jī)制非常復(fù)雜，除炎癥反應(yīng)和新生血管生成外，還可能涉及其他信號傳導(dǎo)通路。因此，針對糖尿病足潰瘍發(fā)病的機(jī)制，以及新治療手段和藥物的開發(fā)還需要深入探索。

綜上所述，當(dāng)歸補(bǔ)血湯能有效下調(diào)糖尿病足大鼠模型TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)，上調(diào)VEGF表達(dá)；通過抑制炎癥反應(yīng)和促進(jìn)新生血管生成加快糖尿病足創(chuàng)面的愈合。