張婷婷，孔祥清，付 瑩，單鳳君，宋 晨，袁 丹

（1.遼寧工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，遼寧 錦州 121001；2.錦州富世博新材料科技有限公司，遼寧 錦州 121000；3.華飛（遼寧）資源環(huán)境科技有限公司，遼寧 錦州 121000）

天然水體中的過氧化氫（H2O2）與水體中的光化學(xué)反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)有著密切的關(guān)系，還影響著水體生物正常的生長代謝[1]。H2O2也是人體代謝產(chǎn)物中的一種，但是水體等介質(zhì)中的外源性H2O2一旦進入人體，將會對人們的健康帶來相當(dāng)大的危害。H2O2進入人體后會分解產(chǎn)生羥基自由基，造成細(xì)胞的氧化損傷，從而可能在細(xì)胞分化的過程中誘導(dǎo)細(xì)胞基因突變，導(dǎo)致體細(xì)胞癌變，進一步引發(fā)癌癥[2]。若基因突變發(fā)生在生殖細(xì)胞當(dāng)中，則可能引發(fā)遺傳毒性[3]。H2O2分解產(chǎn)生的羥基自由基也會加速人體衰老，誘發(fā)心血管疾病等相關(guān)病癥[4-5]。雖然水體中H2O2含量較低，但微量的H2O2就可能給人體健康帶來嚴(yán)重的危害，因此，水體中H2O2的快速、靈敏的檢測已成為研究人員關(guān)注的主要問題。在過氧化物酶的催化下，H2O2能夠氧化3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)發(fā)生顯色反應(yīng)[6]，利用該反應(yīng)可以通過分光光度法檢測H2O2。傳統(tǒng)的過氧化物酶是天然酶，例如，辣根過氧化物酶，天然酶的特點是催化效率高、特異性好[7]，但天然酶的作用環(huán)境及保存條件嚴(yán)格，且價格較高，極大地提高了檢測成本。近年來研究發(fā)現(xiàn)，許多人工制備的材料具有模擬酶的特性，比如，金屬納米顆粒、石墨烯等[8-9]。

碳量子點（CQDs）是一種零維碳納米材料，引其優(yōu)良的光致發(fā)光特性、光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移和良好的生物相容性等特點，被廣泛的應(yīng)用于傳感檢測、醫(yī)學(xué)成像、光電元件和催化等領(lǐng)域[10]。本課題組之前報道過利用城市污泥成功制備出了CQDs，本研究利用所制備出的城市污泥基CQDs 具有過氧化物酶的特性，催化H2O2氧化TMB 發(fā)生顯色反應(yīng)，開發(fā)了一種以CQDs 為模擬酶的H2O2檢測方法，實現(xiàn)了H2O2靈敏、特異性檢測。

1 實驗

1.1 實驗儀器與試劑

紫外-可見分光光度計（UV-2450），北京京科瑞達(dá)科技有限公司；機械超聲波清洗機（410T），深圳市潔拓超聲波清洗設(shè)備有限公司；離心機（TG16-WS），上海浦東物理光學(xué)儀器廠；電子天平（JM2002），余姚紀(jì)銘稱重校驗設(shè)備有限公司；傅立葉變換紅外光譜儀（FT-IR，TNZ1-IR200），美國賽默飛世爾公司。醋酸、醋酸鈉、TMB 和無水乙醇均為分析純，H2O2（30%），以上化學(xué)試劑購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司。透析袋1000 Da，購自上海葉緣生物科技有限公司。實驗所用城市污泥取自錦州北控污水處理有限公司。

1.2 CQDs 的制備

將城市污泥碳化污泥在500 ℃下高溫碳化2 h，得到的黑色固體。取0.6 g 黑色固體于250 mL圓底燒瓶中，加入40 mL 醋酸和80 mL H2O2，超聲60 min，110 ℃下加熱回流12 h，冷卻。過濾，除去大顆粒雜質(zhì)和未反應(yīng)完全的碳顆粒。1 2000 r/min 轉(zhuǎn)數(shù)下離心20 min，上清液透析24 h,即得到所用的CQDs。

1.3 H2O2 的測定

在2 mL比色管中依次加入340 μL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH 7.0)、12 μL TMB 和50 μL 碳量子點，再分別加入100 μL 濃度為0.5、1、1.5、2、5、10、25、50、75、100 μmol/L 和200 μmol/L 的H2O2，靜置10～15 min，試管中溶液會由無色變?yōu)樗{(lán)色，將少許試管中溶液倒入比色皿中，用紫外可見光分光光度計在625 nm 波長處掃描得到吸光度，進行H2O2的定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 CQDs 的紅外光譜表征

圖1 為制備的城市污泥基CQDs 紅外光譜圖。從圖中可以看出，在3 750 cm-1的吸收峰，對應(yīng)的是-OH 的伸縮振動峰，3 000 cm-1左右出現(xiàn)的峰屬于-C-H 的伸縮振動峰，1 600 cm-1左右出現(xiàn)的峰屬于-C=O 的伸縮振動峰，1 400 cm-1左右出現(xiàn)的峰屬于-C=C 的伸縮振動峰，1 000 cm-1左右出現(xiàn)的峰屬于C-O-C 的伸縮振動峰。這說明制備的碳量子點表面含有大量的親水基團如羥基和羧基等基團，與傳統(tǒng)基質(zhì)制備的CQDs 性能相符[11]。

圖1 城市污泥基CQDs 紅外光譜圖

2.2 CQDs 的催化活性對顯色反應(yīng)的影響

為考察制備CQDs 的催化作用，進行對比實驗。一組只加TMB 溶液和H2O2，另一組除了加入相同濃度的TMB 溶液和H2O2還加入碳量子點溶液。用紫外-可見光分光光度計測定兩組體系在一定時間范圍吸光度（圖2）。

圖2 不同體系吸光度-時間曲線

根據(jù)圖2 所示，有CQDs 的體系明顯比沒有CQDs 的體系的吸光度大，這說明城市污泥為基質(zhì)制備的CQDs 有良好的催化作用，可以進行后續(xù)檢測利用。

2.3 檢測條件優(yōu)化

檢測過程中的CQDs 和TMB 使用濃度過低，實驗效果不明顯，反應(yīng)時間較慢，不利于檢測。相反，如果濃度過高，反應(yīng)時間過快，紫外-分光光度計可能會捕捉不到吸光度。此外，醋酸-醋酸鈉溶液pH 對顯色時間和顯色度有影響。因此，需要確定CQDs 和TMB 的最佳使用濃度，以及醋酸-醋酸鈉溶液最佳pH。

CQDs 和TMB 濃度對反應(yīng)體系吸光度影響分別為圖3(a)、(b)所示。從圖3(a)可看出，隨著CQDs濃度的升高，體系吸光度升高，另一方面，CQDs濃度的升高的同時，催化反應(yīng)發(fā)生的越快，顯色也越快。在檢測過程中要使反應(yīng)速度在合理的范圍內(nèi)，因此，檢測中選擇CQDs 溶液的濃度為150 μg/mL，此時，顯色反應(yīng)在10～15 min 之間，便于操作。由圖3(b)可知，體系吸光度值隨著TMB 濃度的升高而增大。檢測中選擇TMB 溶液濃度為35 μmol/L。

圖3 不同條件下體系吸光度曲線

不同pH 的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液與吸光度關(guān)系曲線如圖3(c)所示。由圖可知，隨著pH 升高，體系吸光度值越高，當(dāng)pH 為5 時體系吸光度最高，這與文獻報道的TMB-H2O2顯色反應(yīng)最適宜pH 一致[12]，確定檢測中醋酸-醋酸鈉溶液pH 為5。

2.4 H2O2 檢測

配置濃度分別為0.5、1、1.5、2、5、10、25、50、75、100 μmol/L 和200 μmol/L 的H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液。測定體系在625 nm 處的吸光度。在選定的檢測條件下，H2O2濃度在0.5～5 μmol/L 和10～200 μmol/L 范圍內(nèi)，吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系圖4(a)、(b)。H2O2濃度在0.5～5 μmol/L 時，線性方程為y=0.00177x+0.3922，擬合后的直線R2=0.99849。H2O2濃度在10～200 μmol/L 時，線性方程為y=（2.77×10-5）x+0.39033，擬合后直線R2=0.99307。

圖4 吸光度與H2O2 線性關(guān)系

表1 為以不同材料為模擬酶的H2O2檢測方法的分析性能對比，本研究采用污泥基CQDs 為模擬酶，獲得了較低的檢測限，而且成本更低。

表1 不同納米材料作為過氧化物模擬酶比色檢測 H2O2的比較

3 結(jié)論

以城市污泥為基質(zhì)制備水溶性CQDs，基于CQDs 的過氧化物模擬酶特性，可催化H2O2氧化3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺產(chǎn)生顯色反應(yīng)，建立了一種以CQDs 為過氧化物模擬酶的H2O2檢測方法。在最佳檢測條件下，該檢測方法對H2O2在0.5～5 μmol/L 和10～200 μmol/L 內(nèi)有良好的線性關(guān)系，檢測限為0.1 μmol/L 能夠滿足微量分析要求。