周 芳，康佳銘，李偉銘，張志華

（遼寧工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

索拉非尼（Sorafenib）（圖1）于2005 年和2007年分別被美國(guó)FDA 批準(zhǔn)用于治療晚期腎癌和中期肝癌藥物，在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和甲狀腺癌等領(lǐng)域亦有一定應(yīng)用前景。Sorafeinib 是一種酪氨酸激酶（VEGFR 和PDGFR）和RAF/MEK/ERK 級(jí)聯(lián)抑制劑[1-4]，同時(shí)作用于Raf-1 和BRAF[5]。此外，Sorafeinib 還對(duì)其他多種酪氨酸氨酸激酶如p38 和FGFR-1 亦具有較強(qiáng)的抑制作用。但Sorafeinib 仍有一些缺點(diǎn)，如對(duì)對(duì)B-Raf 激酶的活性較差，這也是Sorafeinib 對(duì)黑色素瘤抑制活性較差的原因之一[5]。研究發(fā)現(xiàn)，修飾Sorafeinib 末端酰胺及其相連接的吡啶環(huán)可提高藥效及選擇性，對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的抑制活性也有一定的改善。將Sorafeinib 的末端酰胺片段替換為咪唑啉酮與吡啶環(huán)稠合片段，合成了系列脲、酰胺等衍生物，其中個(gè)別化合物抑制B-Raf激酶和對(duì)黑色素瘤生長(zhǎng)的抑制活性均比Sorafeinib有所改良。此外，這些化合物的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)也得到改進(jìn)[6]。2016 年Michael Cerezo 等[7]報(bào)道了一種化合物HA15（圖1），是特異靶向BiP/GRP78/HSPA5的小分子抑制劑。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用拼合原理，把活性分子HA15 和Sorafeinib 結(jié)構(gòu)中的優(yōu)勢(shì)結(jié)構(gòu)片段進(jìn)行融合，以期獲得保留2 個(gè)模板分子的某些性質(zhì)，設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)新穎的的N-(4-(2-乙酰氨基噻唑-4-基)苯基)-3-甲基苯甲酰胺，并篩選其抗腫瘤活性。

圖1 目標(biāo)化合物的設(shè)計(jì)思路

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

WRS-1B 數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀，Bruker IFS55-IR 或FTIR920 型紅外光譜儀測(cè)定，Agilent Technologies LC/MS 1200 series-6130 Quadrupole 型液質(zhì)聯(lián)用儀，Bruker 400/54Premium Shielded NMR Magnet System，Bruker AXS Smart APEX II CCD 型X 射線衍射儀。所用試劑均為分析純，未經(jīng)純化。

1.2 目標(biāo)化合物的合成

目標(biāo)化合物的合成如圖2 所示。

圖2 目標(biāo)化合物（3）的合成路線

1.2.1N-(4-(4-硝基苯基)噻唑-2-基)乙酰胺 (1)的合成

將α-溴代對(duì)硝基苯乙酮（2.15 g，0.010 mol）、硫脲（0.84 g，0.011 mol）和無水乙醇（20 mL）混合后回流反應(yīng)3 h。然后減壓蒸餾除去溶劑，殘余固體加入15 mL 乙酸酐，混合物在130 ℃微波加熱攪拌反應(yīng)0.5 h。降溫后向混合物中加入冰水，攪拌至釋出大量固體沉淀，抽濾、水洗、干燥，得黃色的粉末狀固體，產(chǎn)率91.5%。m.p.:312.0-312.7 °C;1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 12.39 (s,1H),8.37 -8.26 (m,2H),8.19 -8.11 (m,2H),7.98 (d,J=0.9 Hz,1H),2.18 (s,3H);HRMS m/z:calcd.for C11H10N3O3S [M+H]+264.04429,found 264.043835[8]。

1.2.2N-(4-(4-氨基苯基)噻唑-2-基)乙酰胺（2）的合成

將化合物（1）(2.64 g,0.010 mol)、二氯化錫二水合物[9](4.50 g,0.020 mol)溶于無水乙醇(50 mL) 中，反應(yīng)混合物回流反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后減壓蒸餾除去溶劑，殘余物用CH2Cl2(40 mL×2)萃取，有機(jī)層分別使用 NaOH 溶液(1 mol/L,20 mL) 水(20 mL)洗滌，干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得淡黃色的粉末狀固體，產(chǎn)率90.2%；m.p.:182.0-183.7 °C;1H NMR (400 MHz,Chloroform-d) δ 10.92 (s,1H),7.63 (d,J=7.9 Hz,2H),7.28 (dd,J=3.3,1.5 Hz,1H),6.95 (d,J=3.0 Hz,1H),6.73 (dd,J=7.9,3.9 Hz,2H),1.95 (t,J=2.9 Hz,3H);HRMS m/z:calcd.For C11H12N3OS [M+H]+234.07011,found 234.071242。

1.2.3N-(4-(2-乙酰氨基噻唑-4-基)苯基)-3-甲基苯甲酰胺（3）的合成

將N-(4-(氨基取代苯基)噻唑-2-基)乙酰胺衍生物（50 mg,0.123 mmol）、三乙胺（25 mg,0.246 mmol）和間甲基苯甲酰氯（0.184 mmol）[10]溶于CH2Cl2（30 mL）溶液中。室溫下反應(yīng)，TLC 監(jiān)測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物分層，有機(jī)層依次用飽和NaHCO3溶液、鹽水洗滌，用無水NaSO4干燥并減壓蒸餾除去溶劑。殘余物通過柱色譜法純化[洗脫劑:V(二氯甲烷)∶V(甲醇)＝50∶1]。White solid;Yield,83.8%;m.p.:154.5-156.4 °C;1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 12.27 (s,1H),10.31 (s,1H),7.87 (t,J=6.2 Hz,4H),7.77 (d,J=7.3 Hz,2H),7.53 (s,1H),7.42 (d,J=5.4 Hz,2H),2.41 (s,3H),2.17 (s,3H);13C NMR (101 MHz,DMSO-d6) δ 169.02,166.09,158.31,148.94,139.23,138.15,135.36,132.61,130.16,128.75,128.56,126.37,125.26,120.70,107.23,22.94,21.42;HRMS m/z:calcd.for C19H18N3O2S [M +H]+352.11197,found 352.112329。

1.3 晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定

取少量樣品加到適量的甲醇回流使之溶解，靜置至室溫后，抽濾或傾倒上層清液置于干燥的小玻璃瓶中，再加少量甲醇使之不飽和，用濾紙封住瓶口，讓其緩慢自然揮發(fā)。

1.4 以MTT 檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響

本文采用MTT 法篩選了目標(biāo)化合物對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29 的細(xì)胞增殖抑制效果。實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)方法[11]。用GraphPad Prism 6 軟件采用非線性回歸法計(jì)算IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 乙酰氨基噻唑（化合物1）的合成研究

文獻(xiàn)[12]報(bào)道，以溴代酮、硫脲和乙酸酐為原料，采用微波輻射一鍋法合成了2-乙酰氨基噻唑衍生物。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)此合成步驟，收率一般在75.3～81.2%之間。分析原因，可能是反應(yīng)溫度較高，硫脲和乙酸酐首先發(fā)生了一酰胺化反應(yīng)，然后得到的乙?；螂甯子谛纬晒曹椊Y(jié)構(gòu)[13-14]，如圖3 所示。

圖3 硫脲的乙酰化反應(yīng)

以α-鹵代酮和硫脲作用是合成氨基噻唑類化合物的重要合成方法之一。反應(yīng)的機(jī)理[15]為硫脲先形成亞胺結(jié)構(gòu)，然后硫脲中的巰基與和α-鹵代酮形成硫醚鍵，然合環(huán)、脫水形成了2-氨基噻唑衍生物（圖4）。乙?；螂褰Y(jié)構(gòu)中巰基的S 原子和氨基N原子，由于共軛作用電子密度減少，不易發(fā)生烷基化和合環(huán)反應(yīng)。長(zhǎng)時(shí)間的加熱回流反應(yīng)，使乙?；螂逡缀鸵宜狒^續(xù)形成二乙酰基硫脲[16]，導(dǎo)致合環(huán)產(chǎn)物收率降低。

圖4 2-氨基噻唑衍生物的反應(yīng)機(jī)理

本實(shí)驗(yàn)以溴代酮、硫脲為原料，先合環(huán)生成2-氨基噻唑衍生物，TLC 監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程，然后在反應(yīng)體系中繼續(xù)加入乙酸酐發(fā)生乙?；磻?yīng)。

2.2 化合物（3）晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)

選取合適尺寸的單晶，利用Bruker AXS Smart APEX II CCD 型X 射線衍射儀測(cè)定，采用經(jīng)石墨單色器單色化的MoKa 射線（λ=0.71073 ?）在296 ± 2 K 時(shí)收集數(shù)據(jù)，在2.50°≤θ≤25.02°范圍內(nèi)用以ω/2θ的掃描方式，收集衍射點(diǎn)。以差值傅立葉合成法定出非氫原子坐標(biāo)，以各向異性熱參數(shù)用全矩陣最小二乘法對(duì)其進(jìn)行修正。晶體結(jié)構(gòu)以直接法SHELXL-97 程序解出。單晶衍射晶體結(jié)構(gòu)如圖5所示，通過圖6 晶體堆積圖看出，化合物（3）依靠相鄰分子之間-C=O… H 氫鍵形成多維結(jié)構(gòu)，化合物（3）的晶體學(xué)參數(shù)列于表1。

圖5 化合物（3）的晶體結(jié)構(gòu)

圖6 化合物（3）的晶體堆積圖

表1 化合物（3）的晶體參數(shù)

2.3 抗腫瘤活性

為了考察目標(biāo)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，選擇以索拉非尼（Sorafenib）為陽性對(duì)照藥，測(cè)試結(jié)果如表2 所示。目標(biāo)化合（3）對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29 的細(xì)胞增殖抑制效果強(qiáng)于人肺腺癌細(xì)胞株A549，其對(duì)HT29 細(xì)胞的IC50值為23.37 μmol/L，具有進(jìn)一步的研究?jī)r(jià)值。

表2 化合物（3）對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

將RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org)中下載的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（PDB code 4asd），以配體Sorafenib（棍狀模型）為模板，利用PyMOL 與本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的目標(biāo)化合物（3）（線性模型）疊合。結(jié)果圖7 顯示，化合物（3）和模板Sorafenib 的骨架重合較好，但Sorafeinib 的末端酰胺片段和化合物（3）的乙酰氨基指向差距較大，另外，3-三氟甲基-4-氯苯基和3-甲基苯基比較，苯環(huán)上的取代基極性差別較大，這些差別可能導(dǎo)致了二者藥理活性差別較大。

圖7 Sorafenib 和化合物（3）晶體結(jié)構(gòu)疊合

3 結(jié)論

以α-溴代苯乙酮、硫脲和乙酸酐為原料，采用微波輻射一鍋法合成了2-乙酰氨基噻唑衍生物（3），并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征?？鼓[瘤細(xì)胞增殖活性顯示目標(biāo)化合（3）對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29 的細(xì)胞增殖抑制效果強(qiáng)于人肺腺癌細(xì)胞株A549，其對(duì)HT29 細(xì)胞的IC50值為23.37 μM，具有進(jìn)一步的研究?jī)r(jià)值。