秦利芬，李惠英，李聃，楊曉峰，代澤友，李瑞蕓

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，云南昆明 650228)

紫黃軟膏由紫草、黃連、黃柏、當(dāng)歸、生地及冰片組成，是昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院經(jīng)60余年臨床篩選，應(yīng)用于兒童尿布疹、濕疹、燒傷、燙傷的外用經(jīng)驗(yàn)方。多年臨床實(shí)踐證實(shí)，紫黃軟膏具有療效確切、不良反應(yīng)少、使用方便、兒童用藥依從性好等優(yōu)點(diǎn)。目前，紫黃軟膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍沿用20世紀(jì)中期的我院自制簡單標(biāo)準(zhǔn)，缺乏定量控制指標(biāo)，在質(zhì)量控制方面無關(guān)鍵性檢測數(shù)據(jù)支持，難以保證每批制劑的均一性和穩(wěn)定性。方中生地黃清熱涼血，養(yǎng)陰生津；當(dāng)歸補(bǔ)血，活血通絡(luò)而不傷血，共為君藥。紫草清熱涼血，活血解毒，透疹消斑；黃連清熱燥濕，瀉火解毒；黃柏清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡，共為臣藥。冰片通諸竅，散郁火，消腫止痛，防腐生肌為佐藥。本方諸藥相伍清熱涼血、活血、燥濕而不耗血傷陰，為清熱解毒、活血通絡(luò)、消腫止痛、防腐生肌之良方。因此，本研究選取君藥當(dāng)歸和臣藥黃連與黃柏的主要成分阿魏酸和小檗堿進(jìn)行含量測定，以期為全面、有效、快速地控制紫黃軟膏的質(zhì)量提供參考[1]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ACQUITY UPLC(Waters公司，美國)超高效液相色譜儀，分析天平(奧豪斯儀器有限公司CP114)，恒溫水浴鍋(鄭州長城科工貿(mào)有限公司HH-S6)，集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠HH-S)。

1.2 試藥

紫黃軟膏(昆明市兒童醫(yī)院制劑室，20190130、20190214、20190329)，阿魏酸(中國藥品生物制品研究院，110773-201614)，鹽酸小檗堿(中國藥品生物制品研究院，110713-201613)，乙腈(德國MARK公司)為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純，水為娃哈哈純凈水(娃哈哈啟力食品有限公司)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，體積流量0.3 mL/min，以乙腈(A)和0.05%磷酸二氫鉀(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫程序(0～3 min，18%～18%A；3～4 min，18%～28%A；4～9 min，28%～28%A)，檢測波長345 nm[2]，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液 精密稱取紫黃軟膏5 g，加水 50 mL，60 ℃水浴加熱10 min至融化，磁力攪拌30 min，過濾至蒸發(fā)皿中，蒸干，加流動(dòng)相(A∶B=20∶80)溶解，定容至2 mL，用0.22 μm的微孔濾膜過濾備用。

2.2.2 對(duì)照品溶液 取鹽酸小檗堿和阿魏酸適量加流動(dòng)相(A∶B=20∶80)制成含鹽酸小檗堿2.92 μg/mL、阿魏酸13.76 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，即得，以0.22 μm的微孔濾膜過濾備用。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按照“2.2.1”供試品溶液的處理方法，不添加紫黃軟膏進(jìn)行處理，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 精密量取供試品、對(duì)照品、陰性對(duì)照溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果阿魏酸與小檗堿出峰位置陰性對(duì)照品溶液無干擾信號(hào)出現(xiàn)。見圖1、圖2、圖3。

圖1 陰性對(duì)照品色譜圖

圖2 混合對(duì)照品色譜圖(A阿魏酸，B小檗堿)

圖3 供試品色譜圖

2.3.2 線性性關(guān)系考察 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10、12 μL按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸分析。阿魏酸的回歸方程為：Y=6×106X+56 720，r=0.999 6，提示阿魏酸在13.76～165.12 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。小檗堿的回歸方程為：Y=8×106X+16 656，r=0.999 8，提示小檗堿在2.92～35.04 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液5 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果阿魏酸峰面積積分值RSD=1.19%，小檗堿峰面積積分值RSD=1.96%，表明精密度良好，見表1。

2.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備的方法，平行制備6份供試品，精密量取各供試品溶液 5 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果阿魏酸含量 RSD=2.85%，小檗堿含量RSD=2.94%，說明供試品溶液重復(fù)性良好，見表2。

表1 阿魏酸和小檗堿精密度測定結(jié)果

表2 阿魏酸和小檗堿重復(fù)性測定結(jié)果

2.3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中的一種供試品溶液按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12 h測定，結(jié)果阿魏酸峰面積積分值RSD=1.47%，小檗堿峰面積積分值RSD=2.06%，說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。提示阿魏酸和小檗堿在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取5份已知含量的紫黃軟膏各2.5 g，每份加入含阿魏酸15.26 μg/mL的對(duì)照品溶液0.5 mL，含小檗堿6.66 μg/mL的對(duì)照品溶液0.5 mL，按照供試品溶液制備項(xiàng)下操作，采用“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定阿魏酸與小檗堿含量，計(jì)算回收率，見表3。

表3 阿魏酸和小檗堿加樣回收測定結(jié)果

2.3.7 樣品含量測定 取3批制劑，按“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算阿魏酸與小檗堿含量，見表4。

表4 阿魏酸與小檗堿含量測定結(jié)果 μg/g

3 討論

本研究采用超高效液相色譜法(UPLC)建立了紫黃軟膏中兩種有效成分阿魏酸和小檗堿含量的測定方法，分別對(duì)精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率進(jìn)行了考察，結(jié)果均符合要求。對(duì)3批樣品進(jìn)行含量測定，結(jié)果顯示阿魏酸含量2.81～3.05 μg/g，平均2.93 μg/g；小檗堿含量1.01～1.30 μg/g，平均1.21 μg/g。3批樣品之間兩種成分測定結(jié)果差異均較小，可作為紫黃軟膏的含量測定指標(biāo)，用于制劑快檢工作。

本研究采用單因素分析考察了浸泡、磁力攪拌、超聲提取法對(duì)提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)磁力攪拌提取更完全，故采用磁力攪拌提取法制備供試品溶液。此外，對(duì)提取溶劑進(jìn)行了考察，分別以70%甲醇、甲醇、乙醇、水為溶劑磁力攪拌提取，結(jié)果醇提取雜質(zhì)峰較多，最終選擇水為溶劑。

本研究采用單因素分析考察了流動(dòng)相乙腈-0.05%磷酸二氫鉀、甲醇-0.05%磷酸二氫鉀、乙腈-0.03%磷酸、甲醇-0.03%磷酸、甲醇-水、乙腈-水[3]，結(jié)果顯示乙腈-0.05%磷酸二氫鉀條件下色譜峰尖銳且呈正態(tài)分布，通過梯度洗脫目標(biāo)物實(shí)現(xiàn)了良好分離[4]。色譜柱考察了ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)和ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)的影響，結(jié)果顯示采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，各成分色譜峰峰形、分離度均較好[5]。此外，本研究考察了超高效液相色譜常用柱溫(30 ℃、35 ℃及40 ℃)和常用體積流量(0.15 mL/min、0.20 mL/min及0.30 mL/min)的影響，結(jié)果顯示柱溫 35 ℃ 和40 ℃峰型均較好，考慮節(jié)能及色譜柱保護(hù)，選擇柱溫35 ℃；體積流量對(duì)結(jié)果無影響，考慮時(shí)間和資源節(jié)省，選擇體積流量0.30 mL/min。

綜上所述，本研究采用UPLC法同時(shí)測定我院自主研發(fā)制劑紫黃軟膏中主要成分阿魏酸和小檗堿的含量，為紫黃軟膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂提供全新的含量檢測數(shù)據(jù)，對(duì)全面控制紫黃軟膏的質(zhì)量具有十分重要的意義。該方法快捷、簡便、準(zhǔn)確、可靠，可消耗較少的樣本量，在較短時(shí)間內(nèi)獲取更多信息，極大地提高了工作效率，可為其他醫(yī)療機(jī)構(gòu)研發(fā)自制制劑提供參考。