崔麗，陳哲，張偉立，盧芳，朱永杰

(1.河南省第三人民醫(yī)院，河南鄭州 450000； 2.解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心，北京 100000； 3.鄭州兒童醫(yī)院，河南鄭州 450053)

支氣管哮喘是兒童常見的氣道非特異性慢性炎癥性疾病，以氣道高反應(yīng)性或氣道炎癥為主要特征，多伴有廣泛且多變的可逆性氣流受限[1]。全球哮喘防治創(chuàng)議將糖皮質(zhì)激素作為哮喘治療首選藥物，但吸入性糖皮質(zhì)激素用于兒童哮喘的治療效果具有明顯個體差異[2-3]。有研究顯示，為兒童哮喘經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療找出反應(yīng)性相關(guān)基因可有效指導(dǎo)哮喘個體化治療的開展[4]。目前有研究表明，微小RNA調(diào)控的基因與誘導(dǎo)哮喘發(fā)病的輔助性T細(xì)胞有關(guān)，其中微小RNA-206(miR-206)基因位點(diǎn)與白細(xì)胞介素(IL)-17a、IL-17b毗鄰[5]。因IL-17參與多種炎性反應(yīng)，與哮喘發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，故推測miR-206可能與糖皮質(zhì)激素治療哮喘的療效有關(guān)。其他諸如Clara細(xì)胞蛋白16(CC16)，因具有極強(qiáng)的免疫抑制與抗炎活性，主要經(jīng)支氣管黏膜上細(xì)胞合成分泌，參與肺部炎性反應(yīng)生理、病理過程[6],推測CC16與哮喘也有一定相關(guān)性。CC16表達(dá)水平可能影響哮喘糖皮質(zhì)激素療效，但是否介導(dǎo)兒童支氣管哮喘的糖皮質(zhì)激素療效尚未明確，國內(nèi)外直接相關(guān)的研究尚不多見。本研究主要探討支氣管哮喘患兒糖皮質(zhì)激素治療前后血清miR-206和CC16表達(dá)水平，旨在分析血清miR-206和CC16表達(dá)水平與藥物療效的相關(guān)性，以指導(dǎo)兒童支氣管哮喘糖皮質(zhì)激素的個性化治療。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取河南省第三人民醫(yī)院2017年11月至2019年11月收治的98例支氣管哮喘患兒為支氣管哮喘組，另選取同期常規(guī)體檢健康兒童90例為健康對照組。其中，支氣管哮喘組男51例，女47例；年齡4～14(7.48±1.04)歲；體質(zhì)量18～55(30.21±4.42)kg；54例為學(xué)齡期兒童，44例為學(xué)齡前兒童。健康對照組男47例，女43例；年齡4～14(7.52±1.05)歲；體質(zhì)量19～54(30.31±4.24)kg；50例為學(xué)齡期兒童，40例為學(xué)齡前兒童。支氣管哮喘組患兒與健康對照組兒童性別、年齡、體質(zhì)量等一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》[7]中支氣管哮喘相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且病情分級為輕中度；(2)急性發(fā)作期；(3)使用糖皮質(zhì)激素治療；(4)就診前1個月內(nèi)未使用其他藥物或糖皮質(zhì)激素全身用藥治療；(5)患兒家屬對本研究知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重感染或其他嚴(yán)重疾病；(2)過敏性鼻炎；(3)合并蕁麻疹；(4)合并其他心、肝、腎等重要臟器功能不全。脫落與剔除標(biāo)準(zhǔn)：(1)治療期間發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥；(2)治療中途主動退出；(3)治療結(jié)束后失訪。同期自愿加入本研究且經(jīng)常規(guī)體檢證實(shí)身體健康的兒童為健康對照組。

1.3 方法

1.3.1 治療方法 本研究納入患兒均為輕中度哮喘，參照指南并結(jié)合患兒病情給予合理干預(yù)，首先進(jìn)行防治教育、環(huán)境控制等非藥物干預(yù)，在此基礎(chǔ)上根據(jù)患兒病情給予速效β2受體激動劑緩解急性期癥狀。早期可使用大劑量吸入性糖皮質(zhì)激素，有利于哮喘急性發(fā)作的控制，可為患兒選擇吸入布地奈德懸液，每次1 mg，或選擇丙酸倍氯米松混懸液，每次0.8 mg，3～4次/天。

1.3.2 療效評價 持續(xù)治療3個月后，參照《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》[7]中兒童哮喘癥狀控制水平分級評價治療效果，并根據(jù)年齡進(jìn)行評價，分別為<6歲患兒、≥6歲患兒。<6歲患兒評估項(xiàng)目主要包括：(1)持續(xù)至少數(shù)分鐘，日間癥狀每周超過1次；(2)夜間因哮喘咳嗽或憋醒后，使用應(yīng)急緩解藥物次數(shù)每周超過1次；(3)因哮喘出現(xiàn)活動受限(步行或玩耍時易疲勞，較其他兒童玩耍/跑步減少等)。若患兒無上述癥狀，提示癥狀控制良好，記為顯效；若存在其中1～2項(xiàng)癥狀，提示癥狀部分控制，記為有效；若存在3項(xiàng)及以上癥狀，提示癥狀未控制，記為無效?！?歲患兒評估項(xiàng)目主要包括：(1)日間癥狀出現(xiàn)每周至少2次；(2)夜間因咳嗽或憋醒后，使用應(yīng)急藥物緩解每周至少2次；(3)因哮喘限制日常活動。若患兒無上述癥狀，提示癥狀控制良好，記為顯效；若存在其中1～2項(xiàng)癥狀，提示癥狀部分控制，記為有效；若存在3項(xiàng)及以上癥狀，提示癥狀未控制，記為無效。

1.3.3 血清miR-206和CC16表達(dá)水平檢測 健康對照組兒童體檢當(dāng)天抽取外周血檢測，支氣管哮喘組分別于入院當(dāng)天、療效評價當(dāng)天檢測血清miR-206和CC16表達(dá)水平。(1)血清miR-206檢測：分別在各檢測時間點(diǎn)抽取受檢者空腹?fàn)顟B(tài)下外周肘靜脈血5 mL，加入肝素抗凝，使用行知生物科技有限公司提供的分離液分離并提取外周血單個核細(xì)胞，將細(xì)胞調(diào)整為2×106/L，并接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，加入適量的植物血凝素，放置在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h，2 000 r/min離心10 min，取上清液待檢。使用實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR)法測定外周血單個核細(xì)胞中的miR-206水平。使用行知生物科技有限公司提供的儀器及配套將制得的外周血單個核細(xì)胞樣本內(nèi)總RNA逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，內(nèi)參為U6，計(jì)算其相對表達(dá)量，檢測中所用引物購自行知生物科技有限公司。(2)CC16水平檢測：分別于各檢測時間點(diǎn)采集受檢者空腹?fàn)顟B(tài)下外周肘靜脈血5 mL，使用美國States Biological公司提供的酶標(biāo)儀及相關(guān)試劑盒，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，嚴(yán)格參照說明書檢測血清CC16水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 支氣管哮喘組患兒糖皮質(zhì)激素治療效果

治療后，支氣管哮喘組顯效、有效、無效例數(shù)分別為40例(40.82%)、39例(39.80%)及19例(19.39%)。

2.2 兩組兒童首次檢驗(yàn)miR-206、CC16水平比較

支氣管哮喘組患兒血清miR-206和CC16表達(dá)水平均低于健康對照組兒童(P<0.05)，見表1。

表1 兩組兒童首次檢驗(yàn)miR-206、CC16水平比較

2.3 不同糖皮質(zhì)激素治療效果的患兒血清學(xué)指標(biāo)水平比較

顯效組患兒血清miR-206和CC16表達(dá)水平最高，其次為有效組、無效組(P<0.05)，見表2。

表2 不同糖皮質(zhì)激素治療效果的患兒miR-206、CC16水平比較

2.4 miR-206、CC16表達(dá)水平對糖皮質(zhì)激素療效影響的線性回歸分析

miR-206、CC16表達(dá)水平作為自變量，糖皮質(zhì)激素治療無效作為因變量，通過線性回歸分析得到回歸方程：Y=1.895-1.131X1-0.046X2，結(jié)果顯示血清miR-206和CC16低表達(dá)可能是兒童哮喘糖皮質(zhì)激素療效的影響因素(P<0.05)，見表3。

表3 各血清學(xué)指標(biāo)對糖皮質(zhì)激素療效影響的線性回歸分析

2.5 血清miR-206與CC16表達(dá)水平的相關(guān)性分析

雙變量Pearson直線相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，支氣管哮喘患兒血清miR-206與CC16表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.483，P<0.01)，相關(guān)性散點(diǎn)圖見圖1。

3 討論

支氣管哮喘治療藥物包括吸入性糖皮質(zhì)激素、支氣管擴(kuò)張劑、抗膽堿能藥物與抗白三烯類藥物，此外，一些新型免疫治療藥物被聯(lián)合應(yīng)用于重癥病例治療，在全部可用于哮喘治療的藥物中吸入性糖皮質(zhì)激素被國內(nèi)外指南推薦作為哮喘基礎(chǔ)治療藥物[8-9]。吸入性糖皮質(zhì)激素治療可作用于支氣管哮喘各發(fā)病環(huán)節(jié)，抑制氣道炎癥，具有顯著療效，被推薦作為兒童支氣管哮喘優(yōu)先用藥[10]。本研究未對所有患兒進(jìn)行藥物對照研究，98例支氣管哮喘患兒經(jīng)個體化糖皮質(zhì)激素治療后，79例患兒療效評價為有效，可見糖皮質(zhì)激素應(yīng)用的價值。

圖1 血清miR-206與CC16表達(dá)水平相關(guān)性散點(diǎn)圖

隨著臨床對支氣管哮喘個體化治療認(rèn)識的不斷深入，糖皮質(zhì)激素應(yīng)用效果也被越來越多的學(xué)者質(zhì)疑，多數(shù)研究認(rèn)為糖皮質(zhì)激素在兒童支氣管哮喘中的應(yīng)用效果存在的異質(zhì)性可能受病情、病程等因素影響，但這一說法尚未得到證實(shí)，也有研究顯示藥物存在的這種療效差異可能與機(jī)體部分基因缺失或免疫因素相關(guān)[11-12]。明確相關(guān)藥物治療效果對不同個體存在的差異有利于哮喘個體化治療方案的制定與實(shí)施，在一定程度上也能提高治療效果，改善哮喘患兒預(yù)后。微小RNA是非編碼單股RNA，通過結(jié)合Argonaute家族蛋白參加誘惑性RNA的形成，從而誘導(dǎo)沉默復(fù)合體-沉默目標(biāo)RNA，進(jìn)而調(diào)節(jié)對應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)，參與機(jī)體多種疾病的病理生理過程[13-14]。有研究表明，微小RNA參與淋巴細(xì)胞終末分化進(jìn)程[15]。作為一種主要的微小RNA，miR-206被認(rèn)為參與骨肉瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，且可能與體內(nèi)各激素分泌有關(guān)[16]。徐慶雷等[17]發(fā)現(xiàn)，哮喘發(fā)作期患兒外周血單核細(xì)胞中miR-206水平低于緩解期患兒與健康兒童，提示其表達(dá)水平下降與哮喘發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，支氣管哮喘組患兒miR-206水平低于健康對照組，與徐慶雷等[17]研究結(jié)果一致。進(jìn)一步比較不同糖皮質(zhì)激素治療效果的患兒miR-206水平發(fā)現(xiàn)，治療效果越好的患兒血清miR-206水平越高，推測miR-206表達(dá)缺失可能是導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素治療效果不佳的主要原因，該推測也在進(jìn)一步的線性回歸分析結(jié)果中得以證實(shí)。

CC16蛋白是Clara細(xì)胞主要的分泌物，目前已被證實(shí)該蛋白在肺內(nèi)有諸多關(guān)鍵性的生理功能，主要包括抗炎作用、抗纖維化作用及抑制腫瘤作用等[18]。此外，有研究表明，急性肺損傷患者肺水腫液與血漿內(nèi)CC16蛋白含量下降也可作為肺上皮損傷標(biāo)志，可將其作為急性肺損傷肺上皮生物標(biāo)志物[19-20]。但CC16蛋白是否與支氣管哮喘患兒疾病及治療等有關(guān)目前尚不明確。本研究結(jié)果顯示，支氣管哮喘組血清CC16水平低于健康對照組，且支氣管哮喘治療顯效組、有效組療效優(yōu)于無效組，進(jìn)一步線性回歸分析結(jié)果顯示，血清CC16蛋白水平表達(dá)降低是哮喘患兒糖皮質(zhì)激素療效的影響因素。本研究已證實(shí)血清miR-206與CC16表達(dá)水平對支氣管哮喘患兒糖皮質(zhì)激素療效的影響，但二者間是否存在相關(guān)性報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示，血清miR-206與CC16表達(dá)水平在支氣管哮喘患兒中呈正相關(guān)，推測血清miR-206與CC16表達(dá)可能存在相互作用，共同對支氣管哮喘患兒糖皮質(zhì)激素療效產(chǎn)生影響。因本研究未能得到其他有力的循證學(xué)依據(jù)作為理論支持，且納入樣本較少，研究時間較短，存在一定局限，結(jié)果真實(shí)性與可靠性仍需大量的前瞻性、大樣本、多中心研究加以驗(yàn)證。

綜上所述，血清miR-206和CC16表達(dá)水平低表達(dá)可能是支氣管哮喘患兒糖皮質(zhì)激素治療效果的影響因素，臨床可考慮在入院時檢測支氣管哮喘患兒血清miR-206和CC16表達(dá)水平，高度重視低表達(dá)患兒，并進(jìn)行合理干預(yù)，以提高糖皮質(zhì)激素治療效果。