李凱晴 李瑩 王藝?yán)?鄒鵬飛

（1.廈門(mén)大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，廈門(mén) 361102；2.河口生態(tài)安全與環(huán)境健康福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廈門(mén)大學(xué)嘉庚學(xué)院，漳州 363105；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廈門(mén) 361021）

魚(yú)類(lèi)是世界上最古老的脊椎動(dòng)物，幾乎分布于所有的水生環(huán)境，而其中硬骨魚(yú)類(lèi)數(shù)目占魚(yú)類(lèi)總數(shù)的90%以上，約為脊椎動(dòng)物數(shù)目的1/2［1］。與哺乳動(dòng)物類(lèi)似，硬骨魚(yú)類(lèi)具有先天免疫系統(tǒng)（innate immunity）和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)（adaptive immunity）［2］。先天免疫是硬骨魚(yú)類(lèi)抵抗外界病原體入侵的第一道防線，主要通過(guò)模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識(shí)別入侵的病原微生物而啟動(dòng)，而適應(yīng)性免疫是生物對(duì)特定病原體產(chǎn)生的特異性免疫應(yīng)答［3］。

一般認(rèn)為，動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中主要有3種細(xì)胞死亡方式：細(xì)胞凋亡（apoptosis）、自噬（autophagy）和細(xì)胞壞死（necrosis）。細(xì)胞凋亡是一種受死亡信號(hào)調(diào)節(jié)并伴隨天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶（caspase）激活的細(xì)胞程序性死亡，不會(huì)引發(fā)周?chē)M織的炎癥反應(yīng)［4］；自噬是細(xì)胞在應(yīng)激或受到損傷的情況下，由溶酶體介導(dǎo)的機(jī)體清除降解受損的或衰老的細(xì)胞器以及機(jī)體不再需要的生物大分子的過(guò)程［5］；而細(xì)胞壞死是指不受基因調(diào)控的意外的細(xì)胞死亡方式，這一死亡方式會(huì)伴隨炎癥反應(yīng)［6］。近年來(lái)，又發(fā)現(xiàn)一種有規(guī)律的細(xì)胞死亡方式——程序性壞死（necroptosis），它既受多種基因調(diào)控又呈現(xiàn)細(xì)胞壞死的一些特征，最終引發(fā)炎癥反應(yīng)［7］。程序性壞死是細(xì)胞在凋亡無(wú)法正常啟動(dòng)時(shí)執(zhí)行的死亡方式［8］，與細(xì)胞凋亡不同，程序性壞死沒(méi)有caspase的活化，它會(huì)使受損細(xì)胞釋放損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）， 如一些先天免疫調(diào)節(jié)因子：白介素-1（interleukin-1，IL-1）、高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）、ATP和線粒體DNA等，最終激活吞噬細(xì)胞識(shí)別清除受損細(xì)胞。

受體相互作用蛋白（receptor-interacting protein，RIP）又叫受體相互作用蛋白激酶（receptor-interacting protein kinase，RIPK），作為細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界刺激的重要接頭蛋白，不僅在炎癥反應(yīng)和先天免疫中起著重要作用，在誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的過(guò)程中也起著關(guān)鍵作用［9-10］。RIP家族是一類(lèi)具有蘇氨酸/絲氨酸激酶活性的蛋白，在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了包含RIP1-7共7個(gè)成員，都具有相對(duì)保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域（kinase domain，KD）。RIP家族成員由于其特定的結(jié)構(gòu)域而參與包括細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng)在內(nèi)的不同生物過(guò)程，或可接受細(xì)胞表面受體傳遞的胞外刺激，或可參與模式識(shí)別受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［11］。本文主要綜述了RIP家族成員在細(xì)胞死亡、炎癥反應(yīng)、先天免疫等不同生物過(guò)程中的作用以及在硬骨魚(yú)類(lèi)中研究的最新進(jìn)展，旨為深入解析硬骨魚(yú)類(lèi)乃至哺乳動(dòng)物的抗病免疫反應(yīng)提供一些思路。

1 RIP1和RIP3

1.1 RIP1和RIP3的分子結(jié)構(gòu)和功能

RIP1是RIP激酶家族的第一個(gè)成員，于1995年被發(fā)現(xiàn)并鑒定為具有C末端死亡結(jié)構(gòu)域（death domain，DD）的新型蛋白激酶，可以與Fas受體的死亡結(jié)構(gòu)域相互作用，因此被稱(chēng)為“受體相互作用蛋白”［12］，RIP3則是第三個(gè)被鑒定出的RIP家族成員。RIP1和RIP3在結(jié)構(gòu)上相似，N端均為激酶結(jié)構(gòu)域，可催化自身磷酸化；中間域也均包含RIP同源相互作用基序（receptor-interacting-protein homotypic interaction motif，RHIM），可介導(dǎo)與其他含RHIM的蛋白相互作用，如β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域接頭蛋白（TIR domain-containing adaptor-inducing IFNβ，TRIF）和DNA依賴(lài)的干擾素調(diào)節(jié)因子激活物（DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors，DAI）［13-15］，以及參與下游核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）的活化［16］；RIP1 的 C 端為死亡結(jié)構(gòu)域（death domain，DD），參與介導(dǎo)同型蛋白之間的相互作用，如Fas、腫瘤壞死因子受體1（TNF-receptor 1，TNFR1）、死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（fas-associated death domain，F(xiàn)ADD）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡域蛋白（TNF-receptor-associated death domain，TRADD）［17］，而 RIP3不具有 DD 結(jié)構(gòu)域（圖1）。RIP1和RIP3廣泛表達(dá)于胚胎和成體組織中，RIP1敲除嚴(yán)重抑制了成熟T細(xì)胞在抗原受體誘導(dǎo)下的增殖反應(yīng)［18］，RIP1缺失會(huì)使成纖維細(xì)胞對(duì)TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡更加敏感，RIP1基因敲除小鼠出生3 d后無(wú)法存活［19］，而RIP3基因敲除小鼠可以存活下來(lái)［20］，這表明RIP1在個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育和生存中必不可少，同時(shí)暗示著RIP3在個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的功能或可被替代。

哺乳動(dòng)物中有大量研究表明，RIP1是炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和程序性壞死的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。RIP1通過(guò)激酶依賴(lài)性和非依賴(lài)性方式調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)，響應(yīng)TNF和Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）家族配體的刺激［20-21］。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）與其受體TNFR1結(jié)合后，通過(guò)接頭蛋白TRADD將RIP1募集到TNFR1上，同時(shí)還招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TNF receptor associated factor 2，TRAF2）、凋亡抑制蛋白 1（cellular inhibitor of apoptosis protein 1，cIAP1）和 cIAP2，最終形成初始質(zhì)膜結(jié)合復(fù)合物Ⅰ［22］（圖2）。其中，TRAF2和cIAPs催化RIP1多聚泛素化［23］，多聚泛素化的RIP1激活NF-κB和促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路，而RIP1通過(guò)激活NF-κB促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)參與炎癥反應(yīng)［24］。在缺失cIAPs或泛素連接酶的情況下，RIP1依賴(lài)其激酶活性與FADD和caspase-8前體結(jié)合，形成了復(fù)合物Ⅱ，促進(jìn)caspase-8前體加工剪切成其活性形式，從而引發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，啟動(dòng)經(jīng)典的caspase依賴(lài)性細(xì)胞凋亡［25］（圖2）。有報(bào)道顯示，泛素連接酶Pellino3能夠以RIP1為靶點(diǎn)抑制TNF誘導(dǎo)的復(fù)合物Ⅱ的形成［26］。RIP1在TNF誘導(dǎo)的信號(hào)通路中具有雙重作用——通過(guò)泛素化作用激活NF-κB和MAPK信號(hào)通路參與炎癥反應(yīng)，和RIP1去泛素化激活caspase-8介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同一種蛋白的不同作用形式觸發(fā)兩條完全相反的途徑，表明了RIP1在決定細(xì)胞命運(yùn)方面起著關(guān)鍵性作用。

圖1 哺乳動(dòng)物 RIP 家族成員及蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖Fig.1 Protein domain of mammalian RIP family members

RIP1不僅在調(diào)控TNF信號(hào)途徑中扮演關(guān)鍵角色，在TLR3和TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中也發(fā)揮重要作用。TLR3和TLR4通過(guò)接頭蛋白TRIF間接作用RIP1，這種相互作用依賴(lài)于TRIF和RIP1中共有的RHIM結(jié)構(gòu)域［27-28］。當(dāng)TLR3和TLR4分別識(shí)別進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)的病毒雙鏈RNA（dsRNA）和革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）時(shí)，TLR3直接與TRIF結(jié)合，而TLR4通過(guò)招募β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域接頭蛋白相關(guān)接頭分子（TIR domain-containing adaptor-inducing IFNβ-related adaptor molecule，TRAM）與 TRIF結(jié) 合，TRIF再通過(guò)RHIM結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)與RIP1的相互作用（圖2），RIP1通過(guò)其激酶活性募集和活化FADD和caspase-8介導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。此外，TRIF和RIP1以及TRAF6和泛素連接酶Pellino1形成復(fù)合物，隨后募集和活化轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激酶（TGFβ-activated kinase，TAK）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激酶靶蛋白（TGFβactivated kinase binding protein，TAB）和 IκB 激 酶（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK）復(fù)合體，最終介導(dǎo)下游NF-κB信號(hào)的激活從而觸發(fā)炎癥反應(yīng)［29］。Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白樣白介素-1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白（fas-associated death-domin-like IL-1βconverting enzyme inhibitory protein，F(xiàn)LIP）會(huì) 抑 制TRIF-RIP1復(fù)合物激活FADD和caspase-8從而阻斷細(xì)胞凋亡［30］。模式識(shí)別受體維甲酸誘導(dǎo)基因蛋白Ⅰ（retinoic acid-inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ）識(shí)別病毒RNA后，招募下游接頭分子線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（mitochondrial antiviral-signaling protein，MAVS），隨后募集和活化RIP1、FADD和TRADD等形成線粒體相關(guān)復(fù)合物，介導(dǎo)下游干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factors，IRFs）和 NF-κB 的 激 活［31］。 而活化的caspase-8能夠剪切RIP1，抑制了RIP1對(duì)RIG-Ⅰ復(fù)合物下游IRF3的激活［32］。目前，有關(guān)RIP1在細(xì)胞死亡和TLRs所介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的作用機(jī)制得到了較深入的研究，但對(duì)于其在RIG樣受體（RIG-Ⅰ like receptors，RLRs）所介導(dǎo)的信號(hào)通路中的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

RIP1通過(guò)激酶依賴(lài)性和非激酶依賴(lài)性?xún)煞N方式調(diào)控炎癥反應(yīng)和細(xì)胞死亡［33］。RIP1不依賴(lài)其激酶活性形成TNF誘導(dǎo)的死亡復(fù)合物Ⅰ來(lái)參與炎癥反應(yīng)；同時(shí)，也可通過(guò)其激酶活性誘導(dǎo)caspase-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和RIP3-MLKL（mixed lineage kinase domainlike protein）介導(dǎo)的程序性壞死［34］。有大量研究表明，RIP1和RIP3在介導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死方面起著重要的作用［11，35-36］。當(dāng) caspase-8 的蛋白活性受到抑制時(shí)，RIP1通過(guò)RHIM結(jié)構(gòu)域與RIP3相互作用，同時(shí)，RIP1和RIP3依賴(lài)各自激酶活性催化自身磷酸化［37］，形成一個(gè)磷酸化驅(qū)動(dòng)的壞死小體，RIP3再募集和磷酸化MLKL，磷酸化的MLKL轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上破壞膜結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞程序性壞死，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［38-39］（圖2）。有報(bào)道顯示，RIP1和RIP3基因敲除小鼠與RIP1和MLKL基因敲除小鼠的存活時(shí)間比只敲除RIP1基因小鼠長(zhǎng)幾天［30，40-41］，表明RIP1和RIP3或RIP1和MLKL的同時(shí)缺失可能造成壞死小體無(wú)法組裝，從而阻斷細(xì)胞程序性壞死，為生物體提供了一定的保護(hù)作用。敲除小鼠成纖維細(xì)胞中的TRAF2基因可促進(jìn)RIP1-RIP3-MLKL壞死小體結(jié)合，觸發(fā)程序性壞死［42］。cIAPs和TAK1通過(guò)抑制RIP1-RIP3-MLKL壞死小體介導(dǎo)的活性氧（ROS）產(chǎn)生從而阻斷細(xì)胞程序性壞死［43-44］。RIP3可以調(diào)控包括TLRs、TNF和DAI在內(nèi)的多種信號(hào)途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞程序性壞死［40，45-46］。在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，TRIF可以不經(jīng)過(guò)RIP1直接招募RIP3啟動(dòng)程序性壞死［47］。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)受體DAI在識(shí)別病毒雙鏈DNA后，可以通過(guò)RHIM結(jié)構(gòu)域的相互作用直接招募RIP3，催化RIP3磷酸化并形成寡聚體，導(dǎo)致細(xì)胞程序性壞死［48］。目前的研究表明，程序性壞死主要發(fā)生在凋亡通路受到抑制的情況下［49-50］，RIP1-RIP3-MLKL形成壞死小體，磷酸化的MLKL轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，但尚不清楚MLKL是通過(guò)直接還是間接作用誘導(dǎo)細(xì)胞膜破裂。

圖2 哺乳動(dòng)物 RIP1 和 RIP3 介導(dǎo)的信號(hào)通路Fig.2 RIP1 and RIP3-mediated signaling pathways in mammals

RIP3不僅是程序性壞死的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡（pyroptosis）。細(xì)胞焦亡是指炎癥依賴(lài)性的細(xì)胞死亡，其特征是組裝一個(gè)稱(chēng)為炎癥小體的多聚蛋白復(fù)合物，誘導(dǎo)caspase-1的加工和激活，最終導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的成熟和釋放［51］。RIP3可以激活caspase-8，致使caspase-8對(duì)IL-1β前體進(jìn)行剪切，同時(shí)促進(jìn)NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的IL-1β的成熟和分泌［50］（圖2）。有研究顯示，當(dāng)細(xì)胞中缺失凋亡抑制蛋白cIAPs時(shí)，RIP3可以激活caspase-8介導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的加工，在不依賴(lài)MLKL的情況下激活NLRP3炎癥小體從而介導(dǎo)細(xì)胞焦亡；相反地，在細(xì)胞中缺失cIAPs和caspase-8的情況下，RIP3和MLKL對(duì)于TLRs誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的激活則變得至關(guān)重要［49］。A20可以與泛素化的RIP3形成復(fù)合物，阻礙NLRP3炎癥小體中caspase-1和caspase-8的組裝，從而抑制IL-1β的加工［52］。有研究表明，缺乏caspase-8和RIP3的細(xì)胞大大影響了caspase-1的加工，并減少了感染誘導(dǎo)的IL-1β和IL-18的產(chǎn)生，與此同時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性也受到損傷［53］。早期研究表明，RIP3的過(guò)表達(dá)會(huì)抑制HEK293T細(xì)胞中TRIF依賴(lài)的NF-κB 激活［54］，但近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，RIP3可通過(guò)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞中的TLR4信號(hào)通路，激活NF-κB信號(hào)，起到重要的促炎作用［55］。因此，RIP3可能會(huì)影響NF-κB激活，但其對(duì)NF-κB活性的調(diào)控作用及具體機(jī)制仍然需要進(jìn)一步的研究。

1.2 RIP1和RIP3在硬骨魚(yú)類(lèi)中的研究進(jìn)展

近年來(lái)，在硬骨魚(yú)類(lèi)的相關(guān)研究中也發(fā)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物RIP1和RIP3的同源基因，在斑馬魚(yú)（Danio rerio）、鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）、斜帶石斑魚(yú)（Epinephelus coioides）和青魚(yú)（Mylopharyngodon piceus）中均發(fā)現(xiàn)RIP1，RIP3的同源基因在斑馬魚(yú)、鯉魚(yú)和半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）中也有報(bào)道。

硬骨魚(yú)類(lèi)RIP1和RIP3在細(xì)胞死亡方面的作用與哺乳動(dòng)物類(lèi)似：斑馬魚(yú)cIAP蛋白可以通過(guò)泛素連接酶促進(jìn)RIP1的多聚泛素化，進(jìn)而調(diào)節(jié)TNFR1死亡復(fù)合物的組裝［56］；傳染性胰腺壞死病毒（infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）感染斑馬魚(yú)后，通過(guò)TNF-α觸發(fā)的死亡信號(hào)來(lái)誘導(dǎo)caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和RIP1-RIP3-MLKL介導(dǎo)的程序性壞死［57］；在cIAP拮抗劑和caspase抑制劑存在時(shí)，TNF-α刺激后半滑舌鰨RIP3蛋白可與MLKL相結(jié)合，且RIP3的過(guò)表達(dá)能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡［58］。有研究通過(guò)ROS定量分析發(fā)現(xiàn)，RIP1、RIP3和PGAM5敲降使TNF過(guò)表達(dá)的斑馬魚(yú)ROS降低到正常水平；白三烯A4水解酶（leukotriene A4 hydrolase，LTA4H）的過(guò)表達(dá)使早期巨噬細(xì)胞的殺菌效力增強(qiáng)，而RIP1和RIP3的基因敲降逆轉(zhuǎn)了這一結(jié)果［59］。通過(guò)構(gòu)建色盲斑馬魚(yú)模型，發(fā)現(xiàn)突變體胚胎中RIP3敲降可以通過(guò)抑制ROS的形成防止視錐細(xì)胞死亡，表明RIP3介導(dǎo)的程序性壞死是視錐細(xì)胞死亡的潛在原因［60］。此外，有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑“毒死蜱”（chlorpyrifos，CPF）暴露可下調(diào)鯉caspase-8的表達(dá)水平并抑制其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，上調(diào)RIP1、RIP3和MLKL的表達(dá)水平，誘導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死［61］；在除草劑“莠去津”（atrazine，ATR）的作用下，鯉魚(yú)RIP1、RIP3、MLKL和FADD的轉(zhuǎn)錄水平以及RIP3和MLKL的蛋白水平顯著增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞程序性壞死［62］。目前，對(duì)于硬骨魚(yú)類(lèi)RIP1和RIP3研究的熱點(diǎn)聚焦在其介導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死上，而有關(guān)RIP3調(diào)控炎癥小體組裝和激活的研究還存在空白。因此，對(duì)硬骨魚(yú)類(lèi)RIP3的功能及其介導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制尚需深入研究。

對(duì)硬骨魚(yú)類(lèi)的先天免疫和炎癥反應(yīng)方面的研究發(fā)現(xiàn)，斜帶石斑魚(yú)RIP1可與TRIF相互作用參與TLRs介導(dǎo)的信號(hào)通路，也可與TRAFs結(jié)合介導(dǎo)下游NF-κB和干擾素（interferon，IFN）通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖4），且RIP1過(guò)表達(dá)抑制新加坡石斑魚(yú)虹彩病毒（singapore grouper iridovirus，SGIV）和赤點(diǎn)石斑魚(yú)神經(jīng)壞死病毒（red-spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV）復(fù)制，并上調(diào)IFN、IRFs和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平［63］，這表明RIP1可能在宿主的抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。但同時(shí)有研究顯示，青魚(yú)RIP1可與MAVS相互作用抑制MAVS對(duì)IFN的激活作用，同時(shí)負(fù)調(diào)控MAVS介導(dǎo)的RLRs抗病毒信號(hào)通路［64］（圖4），而哺乳動(dòng)物中的研究顯示RIP1可以激活MAVS介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)通路［31］，這表明RIP1在硬骨魚(yú)類(lèi)和哺乳動(dòng)物中的抗病毒免疫功能可能有所不同。目前研究顯示硬骨魚(yú)類(lèi)RIP1在TLRs和RLRs介導(dǎo)的信號(hào)通路中發(fā)揮著不同的調(diào)控作用，其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

2 RIP2

2.1 RIP2的分子結(jié)構(gòu)和功能

RIP2又叫RIP樣凋亡調(diào)控蛋白激酶（RIP-like-interacting CLARP kinase，RICK）或 含 caspase激活募集域白介素-1β轉(zhuǎn)化酶相關(guān)激酶（CARD-containing IL-1β converting enzyme-associated kinase，CARDIAK），可以激活 NF-κB 和介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［65-67］。RIP2在N端有激酶結(jié)構(gòu)域，C端有一個(gè)caspase激活募集域（caspase activation and recruitment domain，CARD），可以介導(dǎo)與其他含CARD結(jié)構(gòu)域的蛋白相互作用，如模式識(shí)別受體核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋 白 1（nucleotide-binding oligomerization domains，NOD1）、NOD2 和 caspase-1 等［68-69］（ 圖1）。 除 去CARD-CARD間的相互作用，RIP2還可以和其他蛋 白 特 異 性 結(jié) 合， 包 括 TLR2［70］、cIAP1/2［71］、TRAF3［72］和 CD40［73］。RIP2 廣泛表達(dá)在生物體各組織中，RIP2缺失嚴(yán)重抑制TLR4和NOD1介導(dǎo)的NF-κB激活，IL-1誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子減少，并削弱抗原受體誘導(dǎo)下的T細(xì)胞增殖和分化［70，74］，表明RIP2在炎癥反應(yīng)、先天免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮了重要作用。

RIP2在哺乳動(dòng)物NOD1和NOD2介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)中起著重要作用。NOD1和NOD2可分別識(shí)別進(jìn)入宿主細(xì)胞的病原菌肽聚糖（peptidoglycan，PGN）中的 iE-DAP（γ-D-glutamyl-meso-diaminopimelic acid）和 胞 壁 酰 二 肽（muramyl dipeptide，MDP）并激活，通過(guò)CARD-CARD結(jié)構(gòu)域相互作用招募RIP2，活化TAB-TAK和IKK復(fù)合體并誘導(dǎo)NF-κB和MAPK信號(hào)通路激活，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和抗菌分子的產(chǎn)生［68］（圖3）。許多與RIP2相互作用或調(diào)節(jié)RIP2泛素化的分子能參與調(diào)控NOD1和NOD2介導(dǎo)的信號(hào)通路：Caspase-12通過(guò)與RIP2結(jié)合，致使NOD1/2信號(hào)受到抑制和抗菌反應(yīng)減弱［75］；RIP2同家族的RIP7可以通過(guò)促進(jìn)RIP2磷酸化來(lái)正調(diào)控NOD1/2-RIP2信號(hào)通路［76］；甲狀腺激素受體相互作用蛋白6（thyroid hormone receptor interactor 6，TRIP6）通過(guò)TNF或IL-1的介導(dǎo)，與RIP2相互作用以正調(diào)控NOD1介導(dǎo)的信號(hào)通路［77］。RIP2的多聚泛素化是NOD1和NOD2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵步驟［78-79］。X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）通過(guò)與RIP2結(jié)合被招募到NOD1/2-RIP2復(fù)合物中，促進(jìn)RIP2的多聚泛素化從而介導(dǎo)NF-κB和MAPK 的激活［80-81］。Pellino3和cIAP1/2與XIAP作用基本相同，通過(guò)促進(jìn)RIP2多聚泛素化從而激活TAB-TAK和IKK復(fù)合體［71，82］。而TNF-α誘導(dǎo)蛋白A20、去泛素化酶OTULIN（OTU deubiquitinase with linear linkage specificity）和去泛素化酶頭帕腫瘤綜合征蛋白（cylindromatosis，CYLD）都可以通過(guò)對(duì)RIP2去泛素化進(jìn)而對(duì)NOD1/2-RIP2信號(hào)進(jìn)行負(fù)調(diào)控并抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生［83-85］。目前已證實(shí)有多種泛素化修飾酶可參與調(diào)控NOD1/2-RIP2介導(dǎo)的NF-κB和MAPK的信號(hào)通路，是否還有其他泛素化酶可參與調(diào)控，它們之間是否存在協(xié)同作用，這些問(wèn)題尚有待進(jìn)一步解答。

RIP2除參與NOD1和NOD2介導(dǎo)的信號(hào)通路，還可參與包括TNF、IL-1和TLRs在內(nèi)的多種NF-κB激活途徑。RIP2與caspase-1可通過(guò)CARD-CARD相互作用，介導(dǎo)NF-κB的激活［69］。而凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）可通過(guò)其CARD結(jié)構(gòu)域干擾RIP2與caspase-1的結(jié)合，抑制RIP2和caspase-1互作誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)，促進(jìn)caspase-1的激活和促炎細(xì)胞因子IL-1β的加工［86］（圖3）。同時(shí)還有報(bào)道顯示，RIP2可以與TRAF1、TRAF2、TRAF5和 TRAF6多個(gè)TRAF成員相互作用，誘導(dǎo)NF-κB的激活［87］。在某些情況下RIP2也能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，如RIP2可以直接激活死亡受體家族中的Fas受體，從而參與Fas受體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［65］。目前尚不清楚RIP2如何促進(jìn)Fas受體介導(dǎo)的凋亡及在細(xì)胞死亡中扮演怎樣的角色，這些科學(xué)問(wèn)題值得在未來(lái)深入了解。

2.2 RIP2在硬骨魚(yú)類(lèi)中的研究進(jìn)展

近來(lái)，在斑馬魚(yú)、南亞野鯪（Labeo rohita）、斜帶石斑魚(yú)、麥瑞加拉鯪（Cirrhinus mrigala）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、 牙 鲆（Paralichthys olivaceus）、金魚(yú)（Carassius auratus L.）、鮸魚(yú)（Miichthysmiiuy）和卡特拉魚(yú)（Catla catla）研究中相繼報(bào)道了RIP2的同源序列。在南亞野鯪［88-89］、麥瑞加拉鯪［90］、斜帶石斑魚(yú)［91］和卡特拉魚(yú)［92］中，用 iEDAP、MDP、LPS和聚肌胞苷酸（poly I：C）刺激以及病原體嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、遲緩愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella tarda）和福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）感染后，RIP2的表達(dá)上調(diào)；在金魚(yú)中，RIP2作為NLR信號(hào)通路中的關(guān)鍵接頭蛋白可與NOD1/2相互作用，并且可以激活NF-κB通路，同時(shí)RIP2參與調(diào)控金魚(yú)巨噬細(xì)胞中TNF-α和IL-1β的表達(dá)［93］；鮸魚(yú)NOD1通過(guò)LRR結(jié)構(gòu)域識(shí)別iEDAP并通過(guò)招募RIP2激活NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［94］。在斑馬魚(yú)中，RIP2的過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)I型IFN和NF-κB啟動(dòng)子激活，且RIP2過(guò)表達(dá)的細(xì)胞表現(xiàn)出抗病毒和抗細(xì)菌感染的能力［95］；斑馬魚(yú)組蛋白H2A可以與RIP2作用協(xié)同誘導(dǎo)抗菌基因和主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）相關(guān)基因的表達(dá)［96］；RIP2可參與調(diào)節(jié)NLRs信號(hào)、MHC抗原呈遞和自噬，對(duì)幼體發(fā)育至關(guān)重要，但由NOD1介導(dǎo)的MAPK信號(hào)和下游CD44a-Lck-PI3K-Akt信號(hào)與RIP2無(wú)關(guān)［97］。魚(yú)類(lèi)中存在多種與哺乳動(dòng)物RIP2相似的下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)：如在虹鱒魚(yú)中，使用RIP2抑制劑顯著降低iE-DAP誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子 IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α 的表達(dá)［98］；在牙鲆中，RIP2定位于細(xì)胞質(zhì)，RIP2的過(guò)表達(dá)會(huì)上調(diào)PGN刺激的促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和IL-8的表達(dá)［99］。此外，金魚(yú)ASC可以與RIP2和caspase-1相互作用，ASC的過(guò)表達(dá)可抑制RIP2對(duì)NF-κB的激活作用［100］（圖4）。硬骨魚(yú)類(lèi)RIP2通過(guò)NOD1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與調(diào)節(jié)NLRs信號(hào)和MHC抗原呈遞，還可通過(guò)與NOD1/2或caspase-1相互作用誘導(dǎo)NF-κB的激活和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，參與宿主抗菌和抗病毒免疫反應(yīng)，但不參與NOD1介導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路，這表明了硬骨魚(yú)類(lèi)RIP2介導(dǎo)的信號(hào)通路與哺乳動(dòng)物有所不同。

3 RIP4和RIP5

圖3 哺乳動(dòng)物 RIP2 介導(dǎo)的信號(hào)通路Fig.3 RIP2-mediated signaling pathways in mammals

RIP4又叫蛋白激酶C-δ相互作用激酶（protein kinase C-δ interacting protein kinase，DIK）［101］或蛋白激酶C相關(guān)激酶（protein kinase C-associated kinase，PKK）［102］，RIP4的 N 端包含激酶結(jié)構(gòu)域，C端具有錨蛋白重復(fù)序列（ankyrinrepeat，ANK）（圖1）。RIP4敲除小鼠在出生幾小時(shí)后就不能存活，其骨骼形態(tài)發(fā)生變化，同時(shí)角質(zhì)形成細(xì)胞分化受損，而缺失RIP4的小鼠淋巴細(xì)胞會(huì)使外周B淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，RIP4在B淋巴細(xì)胞發(fā)育和維持成熟B淋巴細(xì)胞再循環(huán)中占據(jù)重要地位［103-105］，這暗示著RIP4可能在適應(yīng)性免疫中發(fā)揮著作用。

RIP4的過(guò)表達(dá)依賴(lài)其激酶活性可誘導(dǎo)NF-κB和氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號(hào)的激活［106-107］。在哺乳動(dòng)物中，RIP4介導(dǎo)的NF-κB激活需要IKK復(fù)合體中的調(diào)節(jié)亞基IKK-α和IKK-β，RIP4通過(guò)使IKK-α和IKK-β上絲氨酸位點(diǎn)磷酸化，活化IKK復(fù)合體從而激活NF-κB［108］。促分裂原活化蛋白激酶激酶的激酶2（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 2，MEKK2）和 MEKK3通 過(guò)與RIP4相互作用使其磷酸化，而磷酸化的RIP4增強(qiáng)了這兩種蛋白激酶對(duì)NF-κB的激活［109］。同時(shí)有研究表明，B細(xì)胞活化因子（B cell-activating factor，BAF）介導(dǎo)的 NF-κB 活化需要 RIP4的參與［110］，RIP4的Lys51和Lys145是cIAP1介導(dǎo)的泛素化和NF-κB活化的兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基［111］。此外，TRAF家族的幾個(gè)成員包括TRAF1、TRAF3和TRAF6通過(guò)與RIP4結(jié)合，抑制RIP4誘導(dǎo)的NF-κB活化［106］。在凋亡過(guò)程中，caspase通過(guò)作用于RIP4中間結(jié)構(gòu)域的Asp340和Asp378氨基酸位點(diǎn)使RIP4發(fā)生剪切，從而抑制NF-κB信號(hào)通路［106］。RIP4通過(guò)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）相互作用增強(qiáng)STAT3的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎性因子-3α（macrophage inflammatory protein-3α，MIP-3α）的 表達(dá)［112］。哺乳動(dòng)物中有關(guān)RIP4的研究主要集中在其對(duì)NF-κB信號(hào)的激活，而它是否還參與了其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程目前尚不清楚。

哺乳動(dòng)物RIP5在其結(jié)構(gòu)上與RIP4相似，N端為激酶結(jié)構(gòu)域，C端具有ANK序列，這暗示它可能具有類(lèi)似于RIP4的功能（圖1）。RIP5的過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)具有DNA斷裂等凋亡形態(tài)特征的細(xì)胞死亡［113］。RIP5可能通過(guò)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）信號(hào)通路在后腎發(fā)育和成熟中發(fā)揮作用［114］，也可能參與控制細(xì)胞衰老和細(xì)胞死亡［115］，但它的具體功能尚不清晰。

目前，尚未在硬骨魚(yú)類(lèi)中報(bào)道RIP4的同源基因，僅在斑馬魚(yú)中報(bào)道敲除RIP5會(huì)導(dǎo)致發(fā)育缺陷，F(xiàn)GF信號(hào)丟失［116］。

4 RIP6和RIP7

RIP6又叫富亮氨酸重復(fù)激酶1（leucine-rich repeat kinase 1，LRRK1），它的結(jié)構(gòu)域十分獨(dú)特又與RIP激酶密切相關(guān)。RIP6在N端含有ANK結(jié)構(gòu)域，除了含有激酶結(jié)構(gòu)域外還包含富亮氨酸重復(fù)序列（leucine-rich repeat，LRR）和Roc/COR結(jié)構(gòu)域（ras complex protein/C-terminal of Roc）（圖1）。

RIP6可參與和調(diào)節(jié)特定的內(nèi)體運(yùn)輸，如RIP6可以使Ras相關(guān)蛋白7（ras-related protein 7，Rab7）在S72位點(diǎn)上磷酸化，促進(jìn)Rab7與其效應(yīng)分子Rab7相互作用溶酶體蛋白（Rab7-interating lysosomal protein，RILP）的相互作用，促進(jìn)含有表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的內(nèi)體向核周區(qū)域運(yùn)輸［117］。有研究發(fā)現(xiàn)，RIP6基因敲除小鼠出現(xiàn)了骨骼發(fā)育不良并伴有硬化，這與骨硬化性干骺端發(fā)育不良的表型相似［118］。哺乳動(dòng)物RIP6主要與內(nèi)體運(yùn)輸和骨骼發(fā)育相關(guān)，但其對(duì)骨骼發(fā)育的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚，仍需深入研究。

RIP7又叫做LRRK2，在N端含有LRR序列，C端有WD40重復(fù)序列，中間包括Roc/COR結(jié)構(gòu)域和激酶結(jié)構(gòu)域（圖1）。RIP7基因突變是家族性和偶發(fā)性帕金森病的常見(jiàn)遺傳原因，在帕金森患者中RIP7表達(dá)量增加［119］。在RIP7基因敲除小鼠的肝臟中，低氧誘導(dǎo)因子-2α（hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α）蛋白的表達(dá)增加且其靶基因促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）的表達(dá)也顯著增加［120］。此外，RIP7可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸和維持細(xì)胞器形態(tài)，RIP7基因敲除和藥物抑制其激酶活性分別會(huì)引起嚙齒動(dòng)物和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞溶酶體異常［121-122］，RIP7基因發(fā)生突變的帕金森患者細(xì)胞中溶酶體形態(tài)發(fā)生改變［123］。同時(shí)，RIP7是RIP2的一種正調(diào)控因子，通過(guò)正調(diào)控NOD1/2-RIP2途徑誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)［76］，這也暗示RIP7可通過(guò)RIP2參與調(diào)控宿主的先天免疫反應(yīng)。

目前，尚未在硬骨魚(yú)類(lèi)中報(bào)道RIP6同源基因，而RIP7僅在斑馬魚(yú)中有相關(guān)報(bào)道。研究顯示，斑馬魚(yú)RIP7突變使與抗感染和免疫疾病相關(guān)的基因表達(dá)明顯受到影響，其抗病原菌感染的能力顯著減弱［124］。早期研究認(rèn)為RIP7的敲降不會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的損失［125］，但近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)RIP7敲降不僅會(huì)導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的損失，還會(huì)導(dǎo)致腎前導(dǎo)管中鈉鉀泵蛋白的錯(cuò)誤定位引起發(fā)育紊亂［126］。因此，關(guān)于RIP7對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的功能與作用機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

過(guò)去的十幾年中，關(guān)于不同RIP家族成員的結(jié)構(gòu)、功能和參與調(diào)控的信號(hào)通路解析方面取得了很大進(jìn)展，越來(lái)越多的研究表明它們?cè)谒拗骺垢腥久庖?、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化和細(xì)胞死亡中發(fā)揮著重要作用。RIP1是細(xì)胞死亡的重要節(jié)點(diǎn)性蛋白，是細(xì)胞選擇凋亡還是程序性壞死的開(kāi)關(guān)，RIP3是程序性壞死和炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，RIP1與RIP3組成壞死小體在程序性壞死中發(fā)揮重要作用。目前硬骨魚(yú)類(lèi)中有關(guān)RIP1和RIP3的研究大都集中在參與細(xì)胞死亡的過(guò)程，而對(duì)其參與調(diào)控宿主先天免疫和炎癥反應(yīng)的研究較為匱乏。RIP2與宿主的先天免疫應(yīng)答密切相關(guān)，可介導(dǎo)多種促炎因子的表達(dá)，并可通過(guò)模式識(shí)別受體參與宿主的抗菌和抗病毒免疫反應(yīng)。目前研究表明硬骨魚(yú)類(lèi)RIP2所介導(dǎo)的信號(hào)通路與哺乳動(dòng)物有所不同，但多數(shù)研究停留在配體或病原體刺激下對(duì)其表達(dá)水平的影響，后續(xù)研究需要對(duì)其功能和作用機(jī)制進(jìn)行深入解析。而不管在哺乳動(dòng)物還是硬骨魚(yú)類(lèi)中，有關(guān)RIP4、RIP5、RIP6和RIP7的研究都較少，它們具體的功能和作用機(jī)制尚不清楚。盡管目前對(duì)硬骨魚(yú)類(lèi)RIP家族成員的功能研究有限，但隨著第三代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和CRISPR/Cas9等基因敲除技術(shù)的進(jìn)步，相信在不遠(yuǎn)的未來(lái)將不斷揭示RIP家族成員在魚(yú)類(lèi)抗病免疫和細(xì)胞程序性死亡中的重要性，豐富和發(fā)展硬骨魚(yú)類(lèi)乃至哺乳動(dòng)物的免疫學(xué)知識(shí)。

圖4 硬骨魚(yú)類(lèi) RIP1、RIP2 和 RIP3 介導(dǎo)的信號(hào)通路Fig.4 RIP1, RIP2, and RIP3-mediated signaling pathways in teleosts