高鵬飛 席飛虎， 張澤宇 胡凱強(qiáng) 陳凱 魏文桃 丁家治 顧連峰

（1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院 基礎(chǔ)林學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)中心，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002）

最新一代的Nanopore納米孔測序技術(shù)和PacBio的異構(gòu)體測序（Iso-Seq）技術(shù)可便捷鑒定出長片段的基因信息［1］，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛運(yùn)用在植物學(xué)研究之中［2］。由于測序技術(shù)的飛速發(fā)展，測序儀器更加便攜，檢測時長大大縮短，所以不同植物物種的基因組序列信息也隨之激增［3］，包括銀白楊（Populus alba）［4］、挪威云杉（Picea abies）［5］、木麻黃（Casuarina equisetifolia）［6］等林木基因組被測序。雖然大規(guī)模高通量的基因序列已知，但相對應(yīng)的基因功能分析卻相對滯后，特別是確定林木物種基因功能仍然是一項艱巨的任務(wù)，因此開發(fā)對應(yīng)物種實用高通量的基因功能研究工具極為重要。

目前林木存在樹體高大、世代周期長、外源基因表達(dá)困難等問題［7］。利用植物穩(wěn)定過表達(dá)可以定向改造植物的遺傳特性在林木研究中雖已有應(yīng)用報道［8］，然而會受植物組織再生率、調(diào)控元件、轉(zhuǎn)化頻率等條件的限制，并且多數(shù)林木物種的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系較為困難，特別是在裸子植物針葉樹種中?；瘜W(xué)誘變、輻射誘變、T-DNA插入、基因槍微彈轟擊等手段［9］都也可以引發(fā)植物基因功能的喪失或者整合外源基因，但這些技術(shù)難以做到高效特異性的靶向目的基因。針對以上兩種問題使用VIGS可作為研究林木基因功能的一種快速有效的替代方案［10］，該技術(shù)與 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）都屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）［11］。VIGS 利用了病毒侵染植物后引發(fā)RNA沉默，病毒被設(shè)計修飾后成為攜帶植物自身基因轉(zhuǎn)錄物的片段則會靶向降解該特定內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄本序列從而引發(fā)靶基因序列的特異性沉默達(dá)到研究該基因功能的目的［12-13］。簡而言之，這是一種植物運(yùn)用自身特異性降解病毒基因組的先天防御途徑［14］所形成的反向遺傳學(xué)工具。早在1995年 Kumagai等［15］就將本氏煙（Nicotiana benthamiana）中八氫番茄紅素脫氫酶基因（phytoene desaturase，PDS）的cDNA片段置于煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）中，對本氏煙進(jìn)行侵染后葉片出現(xiàn)出了白化的表型并成功抑制了內(nèi)源PDS基因的表達(dá)。這種技術(shù)有望成為在林木物種中探究基因功能的利器。本文將系統(tǒng)綜述VIGS技術(shù)的機(jī)制和相關(guān)技術(shù)細(xì)節(jié)，同時著重討論VIGS在林木基因功能研究中的應(yīng)用。

1 VIGS機(jī)制

植物具有多層防御策略來防御病原體的傳播，可以在植物體單細(xì)胞和整個生物體水平上對抗病毒感染。病毒在傳播復(fù)制期間會形成的雙鏈RNA（double-stranded，dsRNA）從而觸發(fā)宿主的第一級防御反應(yīng)［16］。植物細(xì)胞內(nèi)的抗性蛋白核苷酸結(jié)合亮氨酸重復(fù)受體（nucleotide-binding leucine-rich repeat，NB-LRR）可以檢測細(xì)胞內(nèi)活性［17］觸發(fā)第二級免疫策 略 ETI（effects Sub-triggered immunity）的啟動，從而控制感染部位細(xì)胞的程序性死亡從而限制病原體在植株體內(nèi)的傳播。來自于病毒的感染性克隆被稱為病毒載體，靶基因與病毒載體相連接后將重組病毒載體侵染入植物細(xì)胞開始轉(zhuǎn)錄翻譯，植物開啟自身第一級防御系統(tǒng)開始VIGS進(jìn)程（圖1）。來自于病毒的RNA通過RNA依賴性RNA合成酶（RNA-dependent RNA polymerase，RDRP）形成了包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的dsRNA［18］。dsRNA被宿主編碼的核酸內(nèi)切酶（dicer-like，DCL）蛋白識別，其中DCL4和DCL2蛋白直接參與RNA病毒防御系統(tǒng)［19］，DCL4是植物細(xì)胞中對病毒的主要防御者，抑制病毒在細(xì)胞間傳播對VIGS進(jìn)程起到了負(fù)調(diào)控作用，也是細(xì)胞內(nèi)VIGS開始觸發(fā)的主要因素。DCL2可以促進(jìn)細(xì)胞間進(jìn)行基因沉默的信號因子擴(kuò)散，還能夠靶向降解植物細(xì)胞中的病毒RNA是VIGS體系中必不可少的一部分。DCL蛋白將dsRNA切割成21-24個核苷酸的小干擾 RNA（small interfering RNAs，siRNA）。由DCL蛋白產(chǎn)生的雙鏈siRNA被分離為單鏈siRNA加載到AGO（argonaute）蛋白上，將這些siRNA進(jìn)一步加載到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA induced silencing complex，RISC）上組成了效應(yīng)子復(fù)合物［20］，引導(dǎo)siRNA與植物內(nèi)源的的RNA靶向互補(bǔ)結(jié)合后通過核酸內(nèi)切酶對轉(zhuǎn)錄物的裂解來沉默RNA造成基因功能的喪失［21］。

2 VIGS研究方法

2.1 VIGS載體構(gòu)建流程

VIGS涉及3個主要過程：設(shè)計靶向沉默宿主基因片段與病毒基因載體進(jìn)行連接；以適當(dāng)?shù)姆椒ǜ腥局参锼拗?；植物進(jìn)行防御病毒機(jī)制沉默靶基因［22］。為了對較大的文庫進(jìn)行篩選，Liu等［23］建立了含有Gateway克隆位點的煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）載體，去除了冗長的亞克隆步驟。VIGS載體構(gòu)建克隆的植物靶基因的片段通常為300-500 個堿基對（base pairs，bp）［24］，該長度片段能夠有效的產(chǎn)生siRNA，短片段會降低沉默效率，而過長的片段會增加沉默脫靶的可能性。插入序列的大小上限取決于病毒在細(xì)胞中的移動快慢、病毒載體的大小、以及病毒在不同植物物種中的感染效率。在對煙草的研究結(jié)果顯示，即使是來自相同靶基因的不同區(qū)域的相似大小片段都可導(dǎo)致不同的沉默效率，本氏煙中200-1 300 bp的插入片段范圍內(nèi)都可以導(dǎo)致有效的基因沉默［25］。因此針對不同基因的VIGS實驗都需考慮沉默目標(biāo)的靶基因區(qū)域。另外 應(yīng) 通 過 BLAST（basic local alignment search tool）進(jìn)行比對來確定構(gòu)建的基因片段是否具有特異性。靶基因目標(biāo)片段一般選擇在3′UTR區(qū)域的序列［25］，因為基因中這部分序列具有高度保守性，特異性的基因片段能夠?qū)е绿禺愋缘某聊?gòu)建載體時可以在病毒載體中插入多個基因片段以擴(kuò)大靶向范圍沉默不同的基因，Peele研究出使用番茄金色花葉病毒（tomato golden mosaic virus，TGMV）構(gòu)建的VIGS載體在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中共同沉默了鎂螯合酶亞基基因（magnesium chelatase subunit，SU）和增殖細(xì)胞核抗原基因（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）［26］。Turnage 等［27］構(gòu)建的白菜卷葉病毒（cabbage leaf curl virus，CbLCV）VIGS載體也可在擬南芥中同時沉默CH42和PDS兩個基因。

圖1 VIGS分子機(jī)理Fig.1 Molecular mechanism of VIGS

2.2 VIGS接種侵染技術(shù)

TRV介導(dǎo)的VIGS是在雙子葉植物中使用最廣泛的VIGS體系之一，在較多的植物物種中都已經(jīng)成功侵染，并表現(xiàn)出較高的沉默效率。TRV載體研究本氏煙和番茄（Solanum lycopersicum）的VIGS技術(shù)相對較成熟［28］，將構(gòu)建好的病毒載體導(dǎo)入幼苗中，隨著植株的生長，病毒從接種部位擴(kuò)散到植物的發(fā)育區(qū)域并開始進(jìn)行PTGS過程?；虺聊蟊硇彤a(chǎn)生與病毒傳播的速度一致，輕微的病毒癥狀通常在接種7-10 d后開始產(chǎn)生，在2-3周內(nèi)向植株新生的幼嫩葉片擴(kuò)散，通常在3周之后即可產(chǎn)生最易觀察的表型。針對不同植物種類和實驗類型的研究目的，已經(jīng)開發(fā)了多種農(nóng)桿菌對植物接種侵染的不同方法。例如通過用牙簽挑選農(nóng)桿菌并將牙簽刺入幼苗葉片中就可以充分感染，對葉片、葉腋分生組織進(jìn)行注射滲透，真空滲透，或者用農(nóng)桿菌噴灑幼苗也都可以獲得良好的沉默效果［23，29］。使用農(nóng)桿菌進(jìn)行侵染的方法還應(yīng)針對不同物種進(jìn)行開發(fā)改進(jìn)，以及對病毒載體進(jìn)行改造，優(yōu)化接種技術(shù)。TRV這樣的二元病毒，其中PTRV1含有編碼RNA依賴性RNA聚合酶，運(yùn)動蛋白和16K富含半胱氨酸蛋白的基因，PTRV2含有編碼外殼蛋白的基因和用于克隆目的基因的限制位點。基于TRV的VIGS載體需要PTRV1和PTRV2兩組分的混合共表達(dá)才可以發(fā)揮侵染作用。如以最廣泛使用的TRV載體為例展示了侵染技術(shù)路線（圖2）。

2.3 接種后植株的環(huán)境影響

植物生長的外界壞境對病毒載體侵染植株的活性有直接影響［30］，在環(huán)境因素中溫度是影響病毒有效傳播的最重要因素之一。糧食作物多為單子葉植物，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值。針對小麥（Triticum aestivum）感染病毒的最適溫度研究發(fā)現(xiàn)，其生長的最佳環(huán)境溫度為15-20℃。中國小麥花葉病毒（Chinese wheat mosaic virus，CWMV）在低溫17℃下對小麥PDS基因的沉默效率達(dá)到了70%-84%從而產(chǎn)生了明顯的光漂白現(xiàn)象，而同樣溫度下大麥條紋花葉病毒（barley stripe mosaic virus，BSMV）和狐尾花葉病毒（Foxtail mosaic virus，F(xiàn)oMV）并未造成任何的沉默表型［31］。高粱（Sorghum bicolor）感染雀麥草花葉病毒（Brome mosaic virus，BMV）后在溫度22℃下僅有10%的植株產(chǎn)生病毒感染癥狀［32-33］，對實驗體系進(jìn)行了環(huán)境溫度的改進(jìn)發(fā)現(xiàn)高粱接種BMV沉默載體后轉(zhuǎn)移至環(huán)境溫度為18℃溫室中生長4周，植株出現(xiàn)基因沉默的表型為100%，顯著提高了VIGS實驗的沉默效率［24］。因此在實驗中檢測病毒適宜感染的溫度和觀測病毒感染起作用的時間都應(yīng)該進(jìn)行預(yù)先的實驗探究［34］。

圖2 VIGS侵染技術(shù)示意圖Fig.2 Schematic diagram of VIGS infection technology

針對雙子葉模式植物本氏煙和番茄進(jìn)行基因沉默實驗通常使用TRV體系，植株在20-22℃的溫室中生長3周就可以產(chǎn)生明顯的白化表型［35］，然而在對番茄基因沉默體系進(jìn)行改進(jìn)時發(fā)現(xiàn)在低溫15℃環(huán)境時番茄葉片、花朵、果實中的PDS基因的轉(zhuǎn)錄本水平發(fā)生了更顯著的降低，葉綠素含量降低了90%以上［36］。雙子葉植物通常使用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)化效率高低取決于環(huán)境溫度條件與農(nóng)桿菌病原體之間的相互作用能否促成細(xì)胞外菌毛（etracellular pilus，T-pilus）的形成。Vir（virulence）基因的大量表達(dá)可促進(jìn)T-pilus形成，它由VirA和VirG兩部分控制，高于28℃的溫度會抑制T-pilus的形成，并降低Vir蛋白的穩(wěn)定性溫度，超過32℃會導(dǎo)致VirA磷酸活化功能的喪失從而降低Vir基因的表達(dá)［37］，因此不耐高溫的農(nóng)桿菌株系無法在高于28℃情況下進(jìn)行轉(zhuǎn)化［34］。實驗探索過程中必須在確定接種病毒的最佳方式以及維持植物良好的生長條件方面投入巨大的時間和人力成本。對于特定植物和病毒載體均有最佳溫度范圍來使病毒侵染并在植物體內(nèi)傳播，因此在環(huán)境溫度可控的人工氣候室中進(jìn)行VIGS實驗有助于獲得良好且可重復(fù)的的穩(wěn)定侵染效率。

2.4 VIGS的實驗對照和沉默效果的評估

每個VIGS實驗中都要進(jìn)行沉默有效性的檢測。常見的陽性對照是針對PDS基因和ChlH（chelatase subunit）基因進(jìn)行的沉默［38-39］，會產(chǎn)生明顯的葉片變白表型。使用馬鈴薯X病毒（potato virus x，PVX）載體針對在光合作用第二階段中參與葉綠體類囊體發(fā)育的Ftsh（filamentation temperaturesensitive H）基因沉默后同樣也使本氏煙產(chǎn)生了白化表型［40］。在本氏煙和茄子（Solanum melongena）中也有針對SU基因沉默作為陽性對照［41-42］，植株葉片變黃產(chǎn)生了黃色斑點。這些基因都參與植物的光合作用，特異性沉默后可以使植株沉默區(qū)域產(chǎn)生最容易看見的光漂白表型。但是根據(jù)不同物種的特性也需要進(jìn)行適時的改進(jìn)，如果病毒感染所產(chǎn)生的表型與沉默PDS或ChlH所產(chǎn)生的白化表型比較相似的話，針對白化基因的沉默就不是衡量VIGS實驗是否成功的視覺標(biāo)簽，所以為了解釋可能由于病毒本身引起的表型變化，在植物中接種不含目的基因的空載作為陰性對照是極為必要的。在對高粱基因沉默時針對植物發(fā)育的關(guān)鍵蛋白泛素基因（Ubiquitin，Ubiq）構(gòu)建了載體作為陽性對照，沉默后使植株葉片產(chǎn)生了褐變的可變表型，因此沉默Ubiq就是高粱的最佳視覺標(biāo)記基因［24］。

VIGS技術(shù)沉默基因的效率和特異性需要通過逆轉(zhuǎn)錄然后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）來進(jìn)行確認(rèn)各種組織中基因的表達(dá)量和不同樣品實驗處理間基因表達(dá)的差異。實時定量RT-PCR在實驗進(jìn)程中應(yīng)該注意以下因素：提取高質(zhì)量的RNA，有效去除DNA的污染，設(shè)計的引物無引物二聚體［43］。RTPCR引物設(shè)計的區(qū)域應(yīng)該確保位于靶基因轉(zhuǎn)錄本的區(qū)域，但是要處于VIGS載體中克隆的序列之外區(qū)段，并且要確保特異性而非來自其他相似同源的基因［22］。

3 VIGS相關(guān)的軟件工具

植物在PTGS期間存在有基因沉默脫靶的高風(fēng)險，VIGS實驗的成功需要確保靶基因的高度特異性，以及較高的沉默效率?，F(xiàn)在已開發(fā)出許多軟件來輔助進(jìn)行預(yù)測VIGS沉默效率以及構(gòu)建VIGS載體（表1）。

4 VIGS在林木基因功能研究中的應(yīng)用

在生命周期較長的多年生木本植物中，較長的世代限制了遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，所以建立快速可靠的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對于木本植物尤為重要。隨著林木中第一個多年生木本植物毛果楊（Populus trichocarpa）的全基因組序列的完成［54］，針對林木特有的性狀例如木材形成，多年生生長特性，季節(jié)性變化等這些在擬南芥和水稻這兩個模式植物無法解決的問題上開啟了新的研究領(lǐng)域［55］。由于病毒誘導(dǎo)的基因沉默具有實驗步驟易于操作且產(chǎn)生表型所需的時間比較短等優(yōu)勢，VIGS已經(jīng)從以下不同的方面運(yùn)用在林木功能基因組學(xué)研究之中。VIGS系統(tǒng)在木本模式植物楊屬胡楊中及果樹、觀賞樹種中進(jìn)行的基因沉默研究結(jié)果總結(jié)參見表2。

4.1 林木物種中病毒載體的開發(fā)建立

TRV載體在對林木物種中基因功能的探究中發(fā)揮了重要作用。與其他病毒相比TRV具有在植株中的傳播感染強(qiáng)，產(chǎn)生的病毒癥狀輕，可以更強(qiáng)烈降低基因的表達(dá)量等優(yōu)點［69］，因此TRV在林木物種中得到了廣泛的運(yùn)用。麻風(fēng)樹作為礦物資源和生物染料的替代來源，其種子中含油量高達(dá)30%，利用TRV載體對麻風(fēng)樹基因的高通量篩選后確定了其中脂肪酸合成、發(fā)育調(diào)控和自然毒素分泌3個功能相關(guān)的基因［57］。TRV載體還在經(jīng)濟(jì)價值較高的果樹中成功運(yùn)用，例如對桃子沉默ChlH基因，載體侵染桃樹幼苗葉子15 d后接種的區(qū)域就開始褪色最后產(chǎn)生了白化葉片［61］，以及在對櫻桃樹調(diào)節(jié)花色苷合成途徑的MYBA基因沉默后生長出缺少紅色素的櫻桃果實［62］。除此之外，TRV載體在抗逆性較強(qiáng)的林木物種中也被成功運(yùn)用，例如運(yùn)用VIGS技術(shù)在胡楊中沉默了PDS基因，在實驗中設(shè)置了溫度梯度對胡楊樹的侵染最適環(huán)境進(jìn)行探究發(fā)現(xiàn)在28℃時沉默效率最高［56］，使其葉片產(chǎn)生了光漂白的表型。因此使用TRV載體在較難穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的林木中的應(yīng)用具有較大前景。

表1 基因沉默相關(guān)設(shè)計軟件Table 1 Gene silence related design software

針對不同的林木物種應(yīng)該開發(fā)建立特有的新病毒載體，以擴(kuò)大VIGS研究體系范圍，進(jìn)行最有效的基因功能研究。目前開發(fā)林木物種中的VIGS載體工具已經(jīng)展開并獲得了初步的成功。感染相對廣泛的蘋果潛伏球形病毒（apple latent spherical virus，ALSV）最初就是從蘋果樹中分離出來，它是一種直徑為25 nm的球形小病毒［70］，由兩組分單鏈RNA基因組（RNA1和RNA2）和3種不同的衣殼蛋白組成［71］。盡管蘋果樹是ALSV唯一的自然宿主，但是它可以通過人工接種去感染擬南芥、本氏煙、重要的經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物（番茄、黃瓜（Cucumis sativus）、大豆（Glycine max）、蘋果、葡萄（Vitis vinifera）、柑橘（Citrus reticulata））等［72-74］，在這些物種中ALSV都可以導(dǎo)致有效的基因沉默。木薯是全球最重要的塊根作物之一，全球八億多人以它生長產(chǎn)生的塊狀淀粉根為主食，盡管現(xiàn)在已有遺傳轉(zhuǎn)化方案，但是耗時較長且方法困難，并且受到生命周期長，雜合度高和近親衰退的限制［75］?；谀臼碜陨淼姆侵弈臼砘ㄈ~病毒（African cassava mosaic virus，ACMV）的VIGS載體可以快速高效地侵染木薯，針對PDS和標(biāo)記基因UidA（β-glucuronidase enzyme）沉默后在木薯葉子、纖維根、塊狀根等這些不同器官中可視化的觀察到基因沉默結(jié)果［29］，證明了VIGS可以高通量的分析木薯基因功能。

表2 VIGS系統(tǒng)在楊樹屬等林木物種中的研究應(yīng)用Table 2 Research and application of VIGS system in poplar and other forest tree species

4.2 林木物種中生長結(jié)構(gòu)和激素相關(guān)基因解析

VIGS在林木中生長結(jié)構(gòu)以及抗逆機(jī)制中的研究中具有重要意義。木質(zhì)部次生細(xì)胞壁的形成為生產(chǎn)生物乙醇提供了必要的原料，工業(yè)生產(chǎn)中廣泛運(yùn)用的木材和纖維也主要由次生細(xì)胞壁組成。與擬南芥相比木本植物的次生細(xì)胞壁調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更加復(fù)雜，因此了解木本植物中次生細(xì)胞壁形成的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控非常重要［76］。VIGS體系針對DUF579（domain unknown function 579）和 KNAT7（knotted-like homeobox of Arabidopsis thaliana 7）的基因沉默后，發(fā)現(xiàn)植株的細(xì)胞壁松弛，糖脂提取后顯示多糖提取率增加［77］，研究結(jié)果有助于深入了解木質(zhì)部纖維素的產(chǎn)生機(jī)制。VIGS在研究樹木韌皮部中運(yùn)輸mRNA等大分子快速響應(yīng)干旱脅迫機(jī)制也發(fā)揮了重要作用。梨樹嫁接到砧木上后，RNA測序分析顯示PbDRM（pyrus betulaefolia drought responsive mobile gene）轉(zhuǎn)錄本豐度顯著增加，RT-PCR檢測到PbDRM從砧木轉(zhuǎn)移到接穗上從而使接穗的抗旱性顯著增加。并且通過VIGS下調(diào)PbDRM發(fā)現(xiàn)增加了梨樹的干旱敏感性，證明了PbDRM作為干旱脅迫下梨樹韌皮部的移動信號［60］。

木本植物的生長與生長素、赤霉素（GA）、細(xì)胞分裂素等激素有著顯著的相關(guān)性。GA的合成過程中植物特有的發(fā)育和信號傳導(dǎo)關(guān)鍵因子GRAS（GAI-RGA-and-SCR）蛋白質(zhì)家族發(fā)揮了關(guān)鍵作用，并且GRAS在植物結(jié)構(gòu)中具有重要的調(diào)節(jié)效應(yīng)可促進(jìn)枝條的下垂［78］，針對不同生長結(jié)構(gòu)表型植物利用VIGS工具對GRAS基因功能的探究有助于深入了解結(jié)構(gòu)控制機(jī)制。紫薇有枝干直立和枝條矮化下垂的兩個品種，使用TRV載體針對枝條下垂品種紫薇的GRAS1基因進(jìn)行基因沉默，侵染15 d后發(fā)現(xiàn)下垂枝條出現(xiàn)了向上生長的表型，其中一些樹枝的分枝角度甚至接近于直立品種分枝的角度，30 d后產(chǎn)生了更多的腋芽和更多畸形的分枝［68］。該研究解析了林木中枝干下垂的調(diào)控機(jī)制，為林木的根枝生長和分層定位提供了重要基礎(chǔ)，在林木結(jié)構(gòu)水平上闡明了分子功能［79］。

5 VIGS在林木基因功能研究中的局限性以及解決方法

VIGS可導(dǎo)致對非靶基因的表達(dá)抑制，產(chǎn)生脫靶沉默現(xiàn)象，造成基因的沉默效率降低，這在缺乏基因組測序數(shù)據(jù)的林木物種中更容易發(fā)生。脫靶沉默取決于多方面的因素［80］，如靶基因的位置，dsRNA的長度，轉(zhuǎn)化侵染植物的方法是否合適，VIGS載體感染的效率等方面［25］。針對上述問題在構(gòu)建VIGS載體時可以使用SGN，siRNA-Scan等軟件來選擇基因沉默區(qū)域并且評估PTGS過程中所產(chǎn)生的21nt siRNA 是否能夠發(fā)揮的功效［44，46］。Zhou 等［81］提出一種構(gòu)建載體的改進(jìn)方法，使用70 bp的基因片段其中包含來自3個不同基因相互不匹配的21 bp堿基的片段，使用這種改進(jìn)的方法可以減少VIGS的脫靶沉默現(xiàn)象并且特異性的敲除基因家族中的高度相似的成員。改進(jìn)載體的同時也應(yīng)該探索新的病毒誘導(dǎo)機(jī)制，Ossowski等［52］證明了卷心菜卷葉病毒（cabbage leaf curling virus，CaLCuV）和TRV在本氏煙中使用新開發(fā)的微小RNA介導(dǎo)的病毒誘導(dǎo)基因沉 默（microRNA-based virus induced gene silencing，MR-VIGS）方法，也可以降低脫靶現(xiàn)象的產(chǎn)生［82］。

VIGS難以完全抑制靶基因表達(dá)，因此即使降低了靶基因的轉(zhuǎn)錄水平但仍然可以產(chǎn)生足夠的功能性蛋白，所以在沉默的植物中可能未觀察到表型，或者表型不明顯。并且如果僅病毒接種植物就可以改變植物表型［83］，那么由于基因沉默而導(dǎo)致的細(xì)微表型有可能被病毒癥狀掩蓋，因此對沉默表型的解釋會變的更加復(fù)雜化。許多病毒在增殖和傳播過程中會刪除插入的基因［84-85］，因此在實驗過程中應(yīng)當(dāng)加入空載處理，有助于區(qū)分沉默基因所產(chǎn)生的表型和病毒載體誘導(dǎo)的癥狀［10］。

6 利用VIGS研究基因功能的優(yōu)勢以及未來前景

研究基因功能的最簡單最有效的方法是減弱基因的表達(dá)或產(chǎn)生不編碼功能性蛋白質(zhì)的突變體。隨著植物全基因組序列的獲得，需要大規(guī)模分析來確定數(shù)千個基因的功能。VIGS是新興的植物功能基因組學(xué)工具之一，雖然有一定的不足但也避免了許多傳統(tǒng)功能分析方法的局限性［86］，在基因鑒定和功能分析方面具有巨大的潛力。VIGS具有的優(yōu)點以及在未來的前景方向主要包括以下幾個方面：

第一，VIGS不需要完善的參考基因組序列，只需要部分轉(zhuǎn)錄組序列的信息就可以對待研究的的目的基因造成基因沉默［87］。雖然現(xiàn)在高通量測序非常普及，但是很多林木類非模式物種依然沒有參考基因組序列，對于這種非模式物種的基因功能研究，VIGS明顯具有十分明顯的優(yōu)勢。

第二，VIGS不需要穩(wěn)定的植物遺傳轉(zhuǎn)化，實驗操作步驟簡單?？梢栽谥参锷芷趦?nèi)的侵染短暫幾周后快速產(chǎn)生表型，因此在難以轉(zhuǎn)化的林木物種中基因功能的表征變得容易［22］。最近的研究表明，在植物在適當(dāng)?shù)臈l件下，VIGS在整個生命周期中可以進(jìn)行持續(xù)長時間高效的VIGS［88］，甚至可以持續(xù)數(shù)年直到植物死亡。大豆中ALSV介導(dǎo)的VIGS針對PDS基因進(jìn)行沉默后葉片出現(xiàn)了高度均勻的光漂白表型，并且在整個生命周期中穩(wěn)定的維持了VIGS。基因沉默傳播到20%-30%的種子中，所有基因沉默的種子生長后的幼苗都表現(xiàn)出均勻的病毒感染癥狀和高沉默效率產(chǎn)生了白化表型［89］。到目前為止，VIGS 在植物激素代謝合成［90］、出苗活力［91］、花果實發(fā)育［92］、外界應(yīng)激非生物和生物脅迫［93］及衰老凋亡［94］等生命過程中的基因功能驗證方面具有巨大潛力。特別是在那些難以進(jìn)行轉(zhuǎn)化且沒有廣泛收集突變體的林木物種中，VIGS是一種較為有效的研究基因功能的技術(shù)。

第三，針對具有高度同源性的基因家族進(jìn)行有效的特異性敲除。基因家族中的基因具有相似保守的基因結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域，通過將具有相同保守序列的兩個或多個基因家族成員沉默，可以破解大多數(shù)基因家族參與的調(diào)節(jié)植物激素信號傳導(dǎo)和逆境調(diào)控相關(guān)機(jī)制，以及植物中碳水化合物的合成、衰老、發(fā)育和次級代謝產(chǎn)物的合成途徑［95］。真菌病原體（Setosphaeria turcica，ST）可以在玉米高粱葉片上引發(fā)葉枯病，是世界范圍內(nèi)的流行性病害，ST抗性基因家族中都具有CC-NB-LRR（coiled-coil nucleotidebinding site leucine-rich repeats）蛋白結(jié)構(gòu)域參與識別病原體啟動植物的防御反應(yīng)。Martin針對ST基因家族中6個基因的共同區(qū)域設(shè)計了VIGS載體，沉默高粱后發(fā)現(xiàn)其中5個基因的表達(dá)量均發(fā)生了下調(diào)，病菌侵染后沉默組的抗病性顯著下降，染病癥狀加劇，產(chǎn)生大量的真菌孢子［33］。因此VIGS在對基因家族中共同的特異性基因結(jié)構(gòu)域的沉默，可以破解脅迫相關(guān)的復(fù)雜信號傳導(dǎo)組分［96-97］，促進(jìn)了植物在多種脅迫下的基因功能研究。

第四，將病毒載體和最新的功能基因組學(xué)工具結(jié)合是著眼于當(dāng)前以及未來的可能發(fā)展方向［98］。植 物 中 CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced palindromic repeats）已經(jīng)成為另一種強(qiáng)大有力的編輯技術(shù)［98］。在編輯系統(tǒng)中高效的傳遞載體尤為重要，Ali研究報道稱TRV可以將引導(dǎo)RNA（guid RNA gRNA）傳遞到Cas9穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因本氏煙中，指導(dǎo)核酸內(nèi)切酶至目標(biāo)位點進(jìn)行精確切割，雖然效率較低但也檢測到了PCNA基因的靶向修飾［99］。Liu開發(fā)了一種更強(qiáng)大的基于DNA病毒CaLCuV用于CRISPR/Cas9介導(dǎo)的植物基因組編輯技術(shù)（virusbased genome editing，VIGE），精確地靶定 PDS和IspH基因引發(fā)突變，其編輯效率高達(dá)85%和75%并產(chǎn)生了白化表型。與TRV在細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)錄不同，CaLCuV可以在基因編輯的細(xì)胞核中復(fù)制并表達(dá)gRNA，所以顯示出了較高的基因編輯效率［100］。這擴(kuò)大了VIGS和CRISPER/Cas在植物基因組學(xué)和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中的應(yīng)用。

植物穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系中通常都需要植物組織培養(yǎng)和生成愈傷組織，并且林木物種中難以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。尋找一種不需要組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化方法使后代依然保持著高突變是植物轉(zhuǎn)基因和基因編輯的主要方向。如果sgRNA可以進(jìn)入到生殖細(xì)胞中，則使用RNA病毒載體就能導(dǎo)致產(chǎn)生更高頻率的可遺傳基因編輯。在2020年6月Ellison等［101］開發(fā)了一種植物體內(nèi)基因編輯的方法，使用TRV病毒攜帶著單向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA）感染進(jìn)Cas9的轉(zhuǎn)基因植物中，其中sgRNA與植物體內(nèi)的FT（flowering locus T）基因融合，F(xiàn)T基因可以在植物體內(nèi)葉維管束中轉(zhuǎn)錄后并轉(zhuǎn)移到莖尖分生組織誘導(dǎo)開花，因此FT可以促進(jìn)sgRNA進(jìn)入莖尖分生組織并以較高的效率產(chǎn)生可遺傳的基因編輯［102］。實驗證明65%的后代幼苗基因組中都出現(xiàn)了PDS基因等位突變，并且該系統(tǒng)同時靶向了3個基因座的效率與靶向一個基因座的編輯效率相同，都獲得了在編輯位點發(fā)生突變的后代植株?；赥RV載體的VIGS廣泛運(yùn)用在作物和模式植物的基因功能研究中［28］，其引導(dǎo)基因編輯攜帶可移動的sgRNA在植物中創(chuàng)建可遺傳的基因編輯有助于揭示基因功能，打開通往植物基因功能研究新世界的大門。

從分子生物學(xué)和反向遺傳學(xué)建立開始，最初生物學(xué)家只是開發(fā)克隆新的病毒載體，隨著高通量測序的飛速發(fā)展科研工作者利用VIGS技術(shù)更廣泛的沉默了感興趣的基因，但是沒人在十年前預(yù)測出病毒載體可以輔助進(jìn)行基因編輯，而現(xiàn)在VIGS作為輔助基因編輯工具在功能基因組學(xué)和病毒傳遞遺傳中大放光彩。事實上這些轉(zhuǎn)變證明了人們才剛開始摸索發(fā)掘VIGS的無限可能性，新技術(shù)推動了極具創(chuàng)新的新穎應(yīng)用的發(fā)展，甚至VIGS還可以運(yùn)用到非轉(zhuǎn)基因遞送技術(shù)中是運(yùn)送脂質(zhì)體納米材料的理想途徑［103］。VIGS作為重要的功能基因研究手段已經(jīng)迎來了令人振奮的新時代。