張西西 張怡青 李玉林 韓笑 王國強、4 王曉軍 王旭東王云龍

（1.河南師范大學，新鄉(xiāng) 453007；2.鄭州職業(yè)技術(shù)學院，鄭州 450010；3.河南省生物工程技術(shù)研究中心，鄭州 450010；4.河南中醫(yī)藥大學，鄭州 450046；5.河南省職工醫(yī)院，鄭州 450002）

自2019 年 12 月以來，新型冠狀病毒（SARSCoV-2）引發(fā)的肺炎疫情在中國武漢暴發(fā)，隨后疫情迅速蔓延，擴散至全球各地區(qū)［1］。在不到兩個月的時間里，疫情已經(jīng)蔓延至超過200個國家和地區(qū)，對人類的生命安全和全球經(jīng)濟造成巨大的負面影響［2-3］。面對急速增長的發(fā)熱疑似病例或無癥狀的密切接觸者，開發(fā)出靈敏、快速、特異的診斷檢測技術(shù)仍是當務(wù)之急。

SARS-CoV-2 是一種新型高傳染性的冠狀病毒，基因大小約為 29.8 kb，基因組 5′端的基因編碼主要為部分非結(jié)構(gòu)蛋白。3′端編碼 4 種結(jié)構(gòu)蛋白，包括表面刺突糖蛋白（spike，S）、小包膜蛋白（envelope，E）、外膜蛋白（membrane，M）和核衣殼蛋白（nucleocapsid，N）。N蛋白是冠狀病毒中含量最豐富的蛋白，位于病毒內(nèi)部，具有高度保守性［4-5］。N蛋白是一種具有高免疫原性的磷酸化蛋白，在病毒體組裝過程中，N蛋白與病毒RNA結(jié)合形成螺旋核衣殼并且與病毒基因組復制和調(diào)節(jié)細胞信號通路有關(guān)。因此，N蛋白常用作冠狀病毒檢測的靶點，是免疫學快速診斷試劑的核心原料［6］。

然 而，SARS-CoV-2和 SARS-CoV、MERS-CoV的結(jié)構(gòu)蛋白有較高的同源性［7-8］，為提高熒光免疫層析試紙條的特異性，本研究分析了N蛋白全長的保守性，選取全長N蛋白序列中C端，約13 kD的特異序列作為靶蛋白，構(gòu)建重組質(zhì)粒，在原核系統(tǒng)中誘導表達SARS-CoV-2 N蛋白C端重組蛋白［9］，利用Ni2+親和層析柱和凝膠過濾層析柱探索蛋白的純化方式從而獲得高純度的目的蛋白，初步應用于熒光免疫層析試紙條的包被抗原，可以快速區(qū)分PCR確診的新冠陰陽血清，為COVID-19的快速大規(guī)模初期篩查提供生物原料。

1 材料與方法

1.1 材料

抗SARS-CoV-2 全長N蛋白兔抗血清、原核系統(tǒng)表達的SARS-CoV-2 全長N蛋白、大腸桿菌表達菌株BL21（DE3）、質(zhì)粒pET21b由本實驗室保存；COVID-19核酸陰性血清、陽性血清由河南省疾病預防控制中心提供；氨芐青霉素、IPTG誘導劑為索萊寶公司產(chǎn)品；酵母粉、蛋白胨為OXOID公司產(chǎn)品；氯化鈉為國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品。三羥甲基氨基甲烷為河南東格生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；咪唑為生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 目的序列的合成和重組載體構(gòu)建 參考NCBI的SARS-CoV-2冠狀病毒的N蛋白全長基因序列（GenBank：MT434817.1），通過 EMBL-EBI數(shù)據(jù)庫進行序列比對，選取N蛋白全長序列C端（249AA-350AA）110個氨基酸對應的基因序列作為靶序列，通過密碼子優(yōu)化，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行人工合成，目的基因序列連入載體pUC57。以pUC57/NC 為模板，NC-F和NC-R為引物（表1），擴增新冠N蛋白C段靶基因序列。擴增片段和質(zhì)粒pET21b分別通過雙酶切（Nde Ⅰ和XhoⅠ）、連接和轉(zhuǎn)化將合成的靶基因序列插入pET21b質(zhì)粒，構(gòu)建重組載體，雙酶切和測序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET21b-NC。

1.2.2 重組蛋白誘導表達 將pET21b-NC重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達菌株BL21（DE3）感受態(tài)細胞?；罨膒ET21b-NC的重組菌按1∶1 000的比例加入含有氨芐青霉素（50 μg/mL）LB培養(yǎng)基中搖晃培養(yǎng)至菌液OD600nm至0.8時，設(shè)置37℃、25℃、16℃3個不同的誘導溫度，按終濃度為0.4 mmol/L加入IPTG，誘導時間分別為4 h、10 h、20 h，之后將菌體離心，用20 mmol/L Tris（pH8.0）緩沖液重懸并超聲破碎，離心后收集上清和沉淀，將上清和沉淀分別制樣進行SDS-PAGE電泳分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 重組蛋白發(fā)酵和純化 重組蛋白在37℃，0.4 mmol/L IPTG誘導表達4 h時，80%的目的蛋白以水溶性形式存在。按照此條件，大量誘導表達目的蛋白，誘導結(jié)束離心收集菌體，20 mmol/L Tris（pH8.0）緩沖液重懸菌體，冰浴超聲破碎（350 W，工作5 s，停止 5 s，超聲 20 min），12 000 r/min離心 10 min，將超聲破碎后的上清溶液用0.45 μm濾膜過濾，濾液直接上樣，進行Ni2+親和層析純化，上樣流速為3.5 mL/min，上樣結(jié)束，用緩沖液繼續(xù)沖洗至基線，換用含有100 mmol/L咪唑的緩沖液除去雜蛋白，沖洗至基線，再用含300 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫目的蛋白，收集流出液。流出液經(jīng)過超濾濃縮管（截留分子量：3 kD）濃縮之后，以2 mL/min速度上樣，進凝膠過濾層析（Superdex-200），收集第2個流出峰［10］，即為純化目的蛋白。使用SDS-PAGE電泳對其進行檢測，并用 Image Lab 6.0軟件對蛋白純度進行量化分析，同時用高效分子排阻色譜法鑒定重組蛋白的純度。

1.2.4 Western blot鑒定重組蛋白 將純化后的目的蛋白和誘導前的樣品進行 SDS-PAGE 電泳，電泳結(jié)束，通Bio-Rad濕轉(zhuǎn)電泳儀冰浴條件下進行轉(zhuǎn)膜（100 V，40 min）。轉(zhuǎn)膜后放入 10 mL 含5%脫脂奶粉的PBST溶液中，37℃封閉2 h，棄去封閉液，加入用PBST 1∶1 000稀釋的抗全長N蛋白兔抗血清，37℃孵育2 h，棄去一抗，用PBST洗滌3次，每次5 min，然后加入1∶2 000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，37℃，孵育2 h，再用PBST洗滌3次，每次5 min；最后滴加DAB顯色液進行顯色觀察。

1.2.5 重組目的蛋白的初步應用 參考前期本實驗室熒光免疫層析試紙條制備方法［11-12］，用純化的新冠重組NC蛋白作為包被抗原，以1 mg/mL在NC膜上劃線，實驗室制備的全長N蛋白標記熒光微球，組裝熒光免疫層析試紙條。以兔抗全長N蛋白兔抗血清作為陽性對照，正常人血清作為陰性對照，優(yōu)化層析試紙條各種工藝，條件確定后，組裝50個試紙條，送往河南省疾病預防控制中心進行檢測，共檢測20份新冠核酸檢測確證的臨床血清標本（10份陽性，10份陰性），滴加80 μL的原倍血清至加樣孔，10 min后將試紙條置于紫外燈下照射觀察，陰陽通過檢測線是否出現(xiàn)熒光信號來進行判斷。

2 結(jié)果

2.1 靶目的蛋白序列選取

通過 EMBL-EBI數(shù)據(jù)庫對 SARS-CoV-2（YP_009724397.2）、SARS-CoV（NP_828858.1）和 MERSCoV（YP_009047211.1）的N蛋白進行氨基酸序列比對，可以看出在N蛋白的C端三者有較大的差異，因此本研究選取了249-350AA共102個氨基酸序列作為靶序列，人工合成構(gòu)建重組載體，以期原核表達純化后，N蛋白具有更高的特異性（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

以pUC57/NC 為模板，特異型引物NC-F和NC-R進行擴增，得到了大小約為350 bp的靶基因片段，與預期相符（圖2-A）。重組載體用Nde I和Xho I雙酶切驗證，得到目的片段和pET21b線性片段（圖2-B），表明成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET21b-NC。

2.3 重組蛋白可溶性表達分析

通過設(shè)置不同的誘導溫度和時間來探索重組蛋白是否能夠進行可溶性表達，SDS-PAGE（圖3）電泳結(jié)果可以看出：在37℃、25℃和16℃誘導條件下，上清和沉淀均有目的蛋白，且上清中目的蛋白的表達量均高于沉淀表達，37℃誘導4 h條件下目的蛋白在上清中表達量最大（泳道 2），因此，誘導條件確定為：在0.4 mmol/L IPTG，37℃誘導4 h。

2.4 重組蛋白的純化

將工程菌株BL21（DE3）/pET21b-NC按照2.3誘導培養(yǎng)條件進行大量表達，采用Ni2+親和層析柱和凝膠過濾層析柱純化目的蛋白，誘導前菌液和誘導后超聲破碎上清以及不同方法純化后用12% SDSPAGE電泳觀察分析，結(jié)果顯示，目的蛋白分子量約為13 kD，與預期相符，其在上清液中大量表達，Ni2+親和層析柱純化后，目的蛋白純度達85%，再經(jīng)過凝膠過濾層析后，除去了一條雜帶，純度進一步提升，達到90%以上（圖4）。進一步通過高效分子排阻色譜法對最終純化的蛋白樣品進行純度檢測，結(jié)果顯示，重組蛋白在2-3 min左右出現(xiàn)明顯單一的色譜峰，其他位置未出現(xiàn)色譜峰，說明重組蛋白有很好的純度（圖5）。

圖1 SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV 的 N 蛋白 C 末端氨基酸序列對比Fig.1 Comparison of N protein C-terminal amino acid sequences of SARS-CoV-2, SARS-CoV and MERS-CoV

圖2 N 蛋白 C 端序列基因表達載體的 PCR 及雙酶切鑒定Fig.2 N protein C-terminal sequence gene expression vector PCR and double enzyme digestion

圖3 重組蛋白可溶性表達Fig.3 Soluble expression of recombinant protein

圖4 SARS-CoV-2 N 蛋白 C 端重組蛋白原核表達和純化的SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of prokaryotic expression and purification of the C-terminal recombinant protein of SARS-CoV-2 N protein

圖5 SARS-CoV-2 N 蛋白 C 端重組蛋白凝膠過濾層析純化的高效液相分析Fig.5 High performance liquid phase analysis of SARSCoV-2 N protein C-terminal recombinant protein gel filter chromatography

2.5 Western blot鑒定重組蛋白

Western blot結(jié)果顯示，在純化后（泳道1）13 kD處有一條明顯的單一條帶，而誘導前（泳道2）無條帶，表明目的蛋白正確表達，同時純化的目的蛋白可以與全長的N蛋白免疫兔抗血清進行特異性反應（圖6）。

圖6 SARS-CoV-2 N 蛋白 C 端重組蛋白免疫印跡分析Fig.6 Western blotting analysis of SARS-CoV-2 N protein C-terminal recombinant protein

2.6 重組蛋白的初步應用

10份新冠陰性血清T線無熒光信號，C線均有熒光信號，10份陽性血清中有9份T線顯示強的熒光信號，1份顯示弱的熒光信號，C線均有熒光信號（圖7）。該結(jié)果說明目的蛋白作為包被抗原組裝的免疫熒光層析試紙條可以初步應用于新型冠狀病毒抗體的初篩。

圖7 熒光免疫層析試劑血清檢測Fig.7 Serum detection of fluorescent immunomy

3 討論

在SARS-CoV-2冠狀病毒的4種主要的結(jié)構(gòu)蛋白中，N蛋白是冠狀病毒重要的結(jié)構(gòu)蛋白，而且是病毒的主要抗原，N蛋白有較強的免疫原性，可誘導機體產(chǎn)生較強的免疫應答［13］。其抗體較抗 S 蛋白抗體出現(xiàn)早，檢出率高，維持時間長，說明 N 蛋白的免疫原性高于 S蛋白。但是因與其他冠狀病毒序列有較高的同源性［14-15］，特異性不強，為了提高N蛋白的特異性，本研究將N蛋白的基因組進行改造，截取C端具有特異性的序列，人工合成C端序列并制備基因工程菌通過原核表達的方式獲得可溶性重組蛋白。

本研究運用原核系統(tǒng)對重組蛋白進行誘導表達，并確定其在誘導溫度為37℃，誘導時間為4 h，IPTG終濃度為0.4 mmol/L 時重組蛋白可在上清溶液中大量表達。本研究探索了重組蛋白的純化方式并確定了運用層析柱的方式純化蛋白，通過Ni2+親和層析使蛋白溶液中大多數(shù)雜質(zhì)去除，使重組蛋白的純度得到大幅提升，又使用凝膠過濾層析，利用其對不同大小分子的分離作用使重組蛋白的純度進一步提升，通過SDS-PAGE電泳和高效液相可以確定最終得到的重組蛋白純度可達到90%以上。本研究以全長的N蛋白免疫兔抗血清為一抗，通過Western blot可以證明重組蛋白能夠與全長的N蛋白抗體結(jié)合，具備良好的可結(jié)合性和生物活性。本研究將重組蛋白應用于熒光免疫層析試紙的包被抗原，健康人血清未出現(xiàn)假陽性，10份核酸檢測陽性的病人血清可以檢測出9份陽性結(jié)果和1份弱陽性結(jié)果。說明重組蛋白具備一定的抗原性和應用潛力。

由于本研究測試的血清樣本量較少，還不足以說明以重組蛋白為原料制作的檢測試劑的臨床應用效果，以及相較于其他類型檢測試劑的特異性的提升。但是，以上結(jié)果仍然可以說明本研究制備的重組蛋白具備較高的生物活性和應用潛力，可用于核酸檢測全流程質(zhì)控及試劑盒開發(fā)階段的模擬測試。

4 結(jié)論

SARS-CoV-2 N 蛋白 C末端在適當?shù)臈l件下（誘導溫度 37℃，誘導時間 4 h， IPTG 終濃度0.4 mmol/L），可在大腸桿菌表達系統(tǒng)中超過80%以可溶形式表達。通過 Ni2+親和層析和凝膠過濾層析，目的蛋白純度超過 90%。且目的蛋白在熒光免疫層析檢測試紙中表現(xiàn)出較好的反應原性和特異性，可初步用于 COVID-19 的早期初篩。