春蘭miR396過表達對擬南芥葉片生長、光合及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h1>
2021-06-23 07:55:28徐子涵劉倩苗大鵬陳躍胡鳳榮
生物技術(shù)通報 2021年5期
徐子涵 劉倩 苗大鵬 陳躍 胡鳳榮
（1.南京林業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，南京 210037；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所，杭州 310021）
葉片是植物最重要的器官之一，同時也是植物進行光合作用的主要場所，葉片的形態(tài)、大小、數(shù)目均在植物的生長發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。在現(xiàn)代的分子育種研究中，模式植物具有生長迅速、結(jié)構(gòu)簡單、表型明顯等眾多優(yōu)點，從中獲取葉片發(fā)育特性的定量信息較為容易［1］，對植物發(fā)育研究具有一定的實際意義。春蘭（Cymbidium goeringii）是蘭科（Orchidaceae）蘭屬的一類地生蘭，是國蘭中最具代表性的品種之一，其葉線條優(yōu)美，花朵素雅、花型各異，兼具觀賞和藥用價值［2］。目前對于國蘭的研究主要集中于形態(tài)觀察、生理生化和組織培養(yǎng)方面，對其生長發(fā)育的分子研究較少，且包括春蘭在內(nèi)的蘭科植物基本全為喜陰植物，栽培養(yǎng)護較為困難。因此，通過模式植物研究春蘭葉片發(fā)育及光合特性的分子調(diào)控機理，對探究其營養(yǎng)生長和品質(zhì)形成十分必要。
miR396是植物體內(nèi)的一類保守的miRNA，與植物生長發(fā)育密切相關(guān)，其主要靶向一類重要的生長調(diào)控因子（growth-regulating factor，GRF），在擬南芥、水稻、玉米等不同物種中均發(fā)現(xiàn)其保守序列的存在［3-4］。已有眾多研究發(fā)現(xiàn)，miR396通過調(diào)控GRF轉(zhuǎn)錄因子，對葉片、莖、種子和心皮等組織和器官的生長發(fā)育發(fā)揮著重要的作用，尤其對葉片的研究報道居多，參與調(diào)控葉片的大小、細胞增殖、葉片衰老、葉綠素合成及光合作用等一系列過程［5-6］。但目前來看，miR396在蘭科植物中的研究極少，其對蘭科植物葉片發(fā)育和其他性能的影響也尚不清楚。鑒于此，本研究將春蘭miR396基因前體cgo-MIR396在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中過表達，觀察其葉片的生長表型變化及其光合相關(guān)指標的響應(yīng)，結(jié)合對其在生長不同時期表達模式的分析，為春蘭的栽培應(yīng)用及優(yōu)良品種選育提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
試驗所用春蘭“宋梅”種植于浙江省農(nóng)科院園藝所蘭花組實驗室，選擇生長健壯的品種“宋梅”植株，分別剪取營養(yǎng)生長期和生殖生長期兩個階段的葉片，用于分析miR396在不同葉發(fā)育時期的特異性表達，并進行其前體基因的克隆和超表達載體構(gòu)建。材料取好后裝入已標記的干凈離心管中，立即置于液氮中，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。
轉(zhuǎn)基因所用擬南芥為本實驗室自存的野生型哥倫比亞（Columbia，Col），在培養(yǎng)箱中進行培育，生長條件為：溫度（22±1）℃，濕度70%，光周期16 h光照/8 h黑暗，光照強度6 000-8 000 lx。
1.2 方法
1.2.1 基因表達量的測定 將春蘭營養(yǎng)生長時期的幼葉、成熟葉及生殖生長時期的成熟葉片在液氮中研磨成粉末，用MiniBEST Universal RNA提取試劑盒（TaKaRa，上海）提取各樣本的Total Small RNA，再以800 ng上述各樣品的RNA為模板，用HiScriptⅢ 1stStrand cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（諾維贊，南京）莖環(huán)法進行反轉(zhuǎn)錄，得到miR396成熟體cDNA第一鏈，反轉(zhuǎn)錄引物為：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGT CCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTTCA-3′。以該cDNA為模板，用ChamQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix試劑盒（諾維贊，南京）進行反應(yīng)溶液的配制，在Applied Biosystems 型實時熒光定量分析儀上運行PCR程序，以檢測春蘭miR396在不同生長時期葉片中的表達量。根據(jù)基因序列，用miRNA Design軟件（諾維贊，南京）設(shè)計引物，上游引物 ：5′-GCGCGTTCCACAGCTTTCT-3′，下游引物 ：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′，反應(yīng)條件 ：95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，循環(huán) 40 次 ；95℃15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束通過StepOne Software v2.3導(dǎo)出數(shù)據(jù)，以春蘭18S基因為內(nèi)參，根據(jù)CT值用2-△△Cq相對定量法計算相對表達量。每個時期的葉片設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。
1.2.2 基因轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因株系篩選 將春蘭葉片用液氮研磨呈粉末，用MiniBEST Plant Genomic DNA提取試劑盒（TaKaRa，上海）提取gDNA，以其為模板克隆得到miR396前體cgo-MIR396的全長，連接pBI121植物表達載體，測序成功后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101（酶普利斯，南京）。將含有重組質(zhì)粒pBI121- MIR396的農(nóng)桿菌，對野生型擬南芥Col（WT）進行轉(zhuǎn)化，記為T0代，待其種子成熟收取后，均勻播種在含卡那霉素的MS培養(yǎng)基上，篩選得到T1代轉(zhuǎn)基因植株，待小苗長出4片真葉后移栽入盆土（營養(yǎng)土與育苗基質(zhì)1∶1混合）中繼續(xù)培養(yǎng)，單株收取種子，繼續(xù)進行抗性篩選，直至獲得T3代轉(zhuǎn)基因純合株系。
1.2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥檢測及形態(tài)指標測定 選取生長時期相同的擬南芥野生型Col及篩選得到的miR396過表達植株，取其移栽后狀態(tài)穩(wěn)定植株的葉片組織剪碎，采用2×T5 Direct PCR試劑盒（擎科，南京）的加熱裂解法進行轉(zhuǎn)基因擬南芥的DNA鑒定。另外選取生長時期一致的轉(zhuǎn)基因與野生型植株，分別在移栽后第20天和40天時統(tǒng)計葉片數(shù)目，并測量位于相同部位的葉片長度、寬度、葉面積、葉片數(shù)目等，第60天高度生長基本停止時測量株高。每個株系取5個植株進行測量，每株植株測量3片葉片，下同。
1.2.4 葉綠素含量的測定 選取與測量生長指標相同位置和發(fā)育階段（生殖生長階段，下同）的野生型及轉(zhuǎn)基因葉片，稱取0.05 g，采用無水乙醇與無水丙酮1∶1混合液浸提法，利用分光光度計測定663 nm、646 nm和470 nm下的OD值，根據(jù)公式求出葉綠素的含量。計算公式：葉綠素a含量（mg/g）=（12.21 A663- 2.81 A646）·Vt/ 1 000W；葉綠素b含量（mg/g）=（20.13 A646- 5.03A663）·Vt/ 1 000 W ；葉綠素總量（mg/g）= 葉綠素a含量 + 葉綠素b含量。其中，A663、A646分別為葉綠素溶液在波長663和646 nm時的吸光度；Vt是總提取液體積，為10 mL；W為葉片重量，即0.05g。
1.2.5 光合指標及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定 用CIRAS-3（PP-system，英國）便攜式光合儀進行葉片光合指標的測定。測定時，設(shè)置光合有效輻射強度為80 μmol·m-2·s-1，與培養(yǎng)箱內(nèi)光照基本一致，控制葉室溫度為25℃，CO2濃度為420-450 μmol/mol，相對濕度為（50±10）%，記錄凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（gs）等光合生理參數(shù)。
使用Handy PEA（Hansatech，英國）進行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定。將葉片平展夾在熒光夾4 mm2的暗測試孔中，暗反應(yīng)20 min后進行測定，獲得OJIP熒光誘導(dǎo)曲線及初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、可變熒光（Fv）、PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、及性能指數(shù)（PI）等一系列參數(shù)。
1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2010和SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用單因素（one-way ANOVA）和Duncan法進行方差分析和多重比較（α=0.05），Pearson法進行相關(guān)性分析。圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差。
2 結(jié)果
2.1 春蘭miR396在不同葉發(fā)育時期中的表達
采用實時熒光定量PCR對春蘭營養(yǎng)生長時期的幼嫩葉片、成熟葉片，以及花期成熟葉片中miR396基因的表達進行分析，結(jié)果（圖1）顯示該基因在花期葉片中表達量最高，營養(yǎng)生長時期葉片的表達量均較低。
圖1 春蘭miR396在不同葉發(fā)育時期的相對表達量Fig.1 Relative expression of cgo-miR396 in different leaf development stages
2.2 春蘭miR396過表達株系的檢測
過表達載體構(gòu)建完成并通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥中后，以含Kana抗生素的MS培養(yǎng)基對三代轉(zhuǎn)基因擬南芥進行陽性篩選，得到純合的T3代陽性株系，然后以植物基因組DNA為模板，利用來自35S啟動子和MIR396的篩選引物初步鑒定轉(zhuǎn)基因株系（圖2）。結(jié)果表明，MIR396基因已成功轉(zhuǎn)入擬南芥植株中。
2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥形態(tài)指標的變化
從MS培養(yǎng)基移至土壤中第20天，植株尚未抽莖開花時，對野生型Col和過表達miR396擬南芥幼苗植株的冠幅、葉片數(shù)、葉長和葉寬進行觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的某些形態(tài)指標雖相較野生型（WT）有小幅度的增加，但總體來看，二者之間尚未出現(xiàn)明顯差異（圖3）。
圖2 過表達株系DNA檢測Fig.2 DNA detection of overexpressed line
而在植株處于生殖生長階段時的觀測結(jié)果則表明，miR396過表達后，擬南芥株高增加，葉面積、葉長和葉寬乃至基生葉片數(shù)目均增大（圖4），而莖生葉片數(shù)目未發(fā)現(xiàn)明顯的改變。在這些形態(tài)指標中，葉面積的變化最為明顯，經(jīng)測量的野生型擬南芥平均葉面積為330.57 mm2，而不同的轉(zhuǎn)基因株系Line1、Line 2、Line3和Line4的平均葉面積分別為558.35、527.45、533.24和600.31 mm2，均與野生型的該項指標呈現(xiàn)顯著性變化。
2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥葉綠素含量的變化
圖3 營養(yǎng)生長期形態(tài)指標觀測（Bar=1 cm）Fig.3 Morphological index observation during vegetative growth period
MIR396過表達顯著降低了葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量，其中與野生型對照相比，Line1到Line4株系葉綠素總量分別下降了27.79%、29.11%、27.66%、16.50%，在Line2株系處出現(xiàn)最小值，而葉綠素a與b的比值未發(fā)生明顯變化（表1）。
2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥光合指標的變化
圖5顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥的凈光合速率（Pn）較野生型高出8.50%-19.52%，但尚未構(gòu)成顯著差異。而從氣孔導(dǎo)度（gs）和蒸騰速率（Tr）兩個指標來看，各轉(zhuǎn)基因株系間未發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別，但均顯著低于野生型，氣孔導(dǎo)度下降幅度最大，在Line2株系處出現(xiàn)最小值，比野生型下降了74.8%；蒸騰速率則在Line1處出現(xiàn)最小值，平均值比野生型低46.75%。與之不同的是，隨著氣孔導(dǎo)度的減小，在過表達植株與對照的胞間二氧化碳濃度（Ci）的比較中，只Line2株系顯著低于野生型，但僅下降了9.58%。同時還發(fā)現(xiàn)，MIR396過表達后，葉片的水分利用效率（WUE）增大，在Line1與Line2株系處呈現(xiàn)顯著差異。
2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化
由表2可知，野生型與各轉(zhuǎn)基因株系間的葉綠素?zé)晒鈪?shù)雖略有差異，如Line2和Line3株系的PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、PSⅡ的潛在光化學(xué)效率（Fv/Fo）相對較低，但均未達到統(tǒng)計顯著水平，表明過表達CgMIR396后，擬南芥葉片的捕光及光能轉(zhuǎn)化能力未發(fā)生明顯變化。
圖4 生殖生長期形態(tài)指標觀測（Bar=1 cm）Fig.4 Morphological index observation during reproductive growth period
表1 葉綠素含量的測定Table 1 Determination of chlorophyll content
圖5 葉片光合指標的測定Fig.5 Determination of photosynthetic indexes in leaves
表2 快速葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定Table 2 Rapid determination of chlorophyll fluorescence parameters
2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片能量分配比率的變化
擬南芥轉(zhuǎn)基因后量子產(chǎn)額和能量分配比率的變化趨勢，如圖6所示，其暗適應(yīng)后的最大光化學(xué)效率（φPo）并未發(fā)生較大變化；而在反應(yīng)中心捕獲的激子中，用來推動電子傳遞到電子傳遞鏈中超過QA的其他電子受體的激子占用來推動QA還原激子的比率（ψo）在轉(zhuǎn)基因后略有減小，其中Line2株系與野生型呈現(xiàn)顯著差異，即照光2 ms時有活性的反應(yīng)中心開放程度顯著變??；另外，Line2與Line3株系反應(yīng)中心吸收的光能用于電子傳遞的量子產(chǎn)額（φEo）也顯著降低，下降比例分別為10.01%和8.29%。
圖6 葉片量子產(chǎn)額和能量分配比率的變化Fig.6 Variations of leaf quantum yield and energy distribution ratio
2.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥PS Ⅱ反應(yīng)中心活性參數(shù)的變化
通過對光合機構(gòu)比活性的分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系在單位反應(yīng)中心吸收的光能（ABS/RC）及耗散掉的能量（DIo/RC，在t=0時）僅在Line3株系處出現(xiàn)較明顯的變化，分別高出野生型6.25%和14.45%；但單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA的能量（TRo/RC，在t=0時）和用于電子傳遞的能量（ETo/RC，在t=0時）未發(fā)生明顯變化（圖7）。
圖7 葉片比活性參數(shù)的變化Fig.7 Variations of specific activity parameters in leaves
2.9 轉(zhuǎn)基因擬南芥性能指數(shù)及推動力的變化
以吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)（PIABS）和推動力（DFABS）能夠更為準確地反映植物葉片光合機構(gòu)的狀態(tài)，在圖8中可以看出，轉(zhuǎn)基因株系的PIABS及DFABS均呈現(xiàn)下降趨勢，其中在DFABS中反應(yīng)的變化更為明顯，Line1到Line4株系分別較野生型下降了18.06%、60.22%、54.95%和7.18%，在Line2和Line3處呈現(xiàn)顯著差異，并在Line2株系處達到最小值。
圖8 葉片性能指數(shù)及推動力的變化Fig.8 Variations of performance index and driving force
2.10 轉(zhuǎn)基因擬南芥形態(tài)、光合及葉綠素?zé)晒庵笜说南嚓P(guān)性分析
傳統(tǒng)Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，擬南芥葉面積、葉長和葉寬之間的相關(guān)性呈現(xiàn)極顯著水平，這三者均與氣孔導(dǎo)度（gs）之間呈顯著相關(guān)；胞間二氧化碳濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（gs）和水分利用效率（WUE）三者之間也達到極顯著相關(guān)水平，凈光合速率（Pn）則與其他光合指標間無明顯相關(guān)性；而葉綠素?zé)晒飧黜椫笜酥g大多均存在一定的相關(guān)性，尤其是快速熒光參數(shù)Fo、Fm與Fv及其比值，與DIo/RC、φPo、φEo、PIABS、DFABS之間多數(shù)達到顯著相關(guān)甚至極顯著相關(guān)（表3）。
3 討論
miR396及其靶基因GRF對植物各組織器官的發(fā)育都具有顯著的調(diào)控作用，尤其以控制葉片發(fā)育方面的研究居多［5］。目前的研究結(jié)果表明，該模塊主要是通過控制細胞增殖來調(diào)節(jié)葉細胞形態(tài)乃至葉片的表觀形態(tài)。本研究中發(fā)現(xiàn)，春蘭miR396基因在擬南芥中的過量表達能夠促進生殖生長時期的葉片生長、降低葉綠素含量，進而影響其光合、葉綠素?zé)晒獾纫幌盗袇?shù)的變化。
表3各單項指標的相關(guān)系數(shù)矩陣Table 3 Correlation coefficient matrix of each single index
在對葉片形態(tài)的觀測中，cgo-miR396基因過表達株系的葉片發(fā)育受到促進，呈現(xiàn)出與擬南芥、番茄、歐洲油菜等雙子葉植物在miR396-GRF模塊中不一致的研究趨勢；但Wu等［7］在玉米中對ZmGRF10的研究結(jié)果則表明，該基因的過量表達導(dǎo)致了玉米葉面積和株高的減小，這與本研究的結(jié)果較為相似。通過前期對春蘭miR396的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其與高粱、甘蔗等單子葉植物的同源性最高，因此，單雙子葉植物之間基因功能的差異，以及蘭科植物自身的特異性，均暗示著該作用模塊可能發(fā)揮的特殊功能。
光合作用是植物最為重要的物質(zhì)和能量來源，春蘭作為一種重要的觀賞和藥用植物，探究光合作用不僅能夠更好的保障其生長和發(fā)育所需的優(yōu)質(zhì)物質(zhì)來源，還可對其栽培所需環(huán)境、葉片形態(tài)發(fā)育及觀賞價值等方面的研究提供指導(dǎo)。在本研究中，隨著轉(zhuǎn)基因植株葉片面積和長寬的增加，葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量均呈下降趨勢。從前人的分析來看，miR396導(dǎo)致葉片增大的主要原因是由于細胞增殖導(dǎo)致葉細胞數(shù)目的增多或體積的增大［8-9］，本研究結(jié)果可能與周厚君等［10］的研究結(jié)果相似，即miR396導(dǎo)致了細胞體積的擴張，且可能并未增加葉綠體的數(shù)目，從而使得葉綠素分布較為分散，單位重量的葉綠素含量明顯下降、且葉綠素a/b的比值保持不變。從光合指標來看，相較野生型來說，cgo-miR396的過表達雖導(dǎo)致氣孔導(dǎo)度顯著下降，乃至蒸騰速率降低，但其Ci指標表明其用于光合作用的CO2仍能達到飽和狀態(tài)，水分利用效率也上升，最終使凈光合效率呈上升趨勢，促進了擬南芥的生長。另外，本研究中光合各項指標的組內(nèi)標準偏差較大，參考張治平等［11］對于煙草轉(zhuǎn)基因葉片光合作用的研究來看，不同葉位間光合指標的差異，是導(dǎo)致該因素產(chǎn)生的主要原因。
本研究的4個轉(zhuǎn)基因株系相較野生型來看，雖PSⅡ最大光化學(xué)效率及潛在光化學(xué)效率等葉綠素?zé)晒鈪?shù)未發(fā)生顯著變化，但Appenroth等［12］和Heerden等［13］的研究表明，性能指數(shù)和推動力能夠更準確的反映植物光合機構(gòu)的狀態(tài)，通過圖8中對二者的分析來看，miR396的過表達很可能對擬南芥葉片的光合機構(gòu)造成了一定程度的破壞，尤其體現(xiàn)在Line2與Line3株系中。且對量子產(chǎn)額和能量分配比率的分析也表明，轉(zhuǎn)基因株系的能量在PSII反應(yīng)中心中的分配比率發(fā)生了變化，照光2ms時有活性反應(yīng)中心的開放程度也相應(yīng)減小，說明PSⅡ受體側(cè)發(fā)生了改變［14］。
最后，通過對這24個指標進行的Pearson相關(guān)性分析來看，各指標間均存在一定的相關(guān)性，一些指標間呈現(xiàn)顯著相關(guān)，有的甚至達到極顯著相關(guān)。從形態(tài)指標來看，葉面積與葉長、葉寬均呈極顯著相關(guān)，且與葉寬的相關(guān)性更高，表明miR396主要是通過增大葉寬來增大葉片大小；這三者也與氣孔導(dǎo)度（gs）呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，結(jié)合上述分析來看，推測葉片細胞的增殖或許導(dǎo)致了氣孔數(shù)目的增多，但因光合所需CO2已達飽和狀態(tài)，因此氣孔開合程度遵循自主調(diào)節(jié)機制而顯著下降，在后續(xù)研究中可對葉片表皮結(jié)構(gòu)進一步觀察以得出結(jié)論。各光合指標分析表明，凈光合速率與其他因素并無顯著相關(guān)性，表明葉面積、氣孔及水分可能不是影響光合速率的主要原因，因此在這些轉(zhuǎn)基因植株中，葉片中各種光合酶的活性或其他內(nèi)部因子可能已經(jīng)發(fā)生了改變。另外，雖然葉綠素與類胡蘿卜素是植物吸收光能的基礎(chǔ)，但相關(guān)性分析表明，葉綠素與光合能力的變化也并不存在正相關(guān)，這與葉子飄等［15］的研究結(jié)果一致，說明植物電子傳遞的速率不僅與葉綠素含量有關(guān)，還與捕光色素分子的特性，如光能吸收截面、激子傳遞效率等密切相關(guān)［16］。
4 結(jié)論
春蘭miR396的過表達對擬南芥生殖生長時期葉片生長發(fā)育的形態(tài)指標和光合指標均產(chǎn)生了一定的影響，與前人在雙子葉植物中的研究存在較大差異，并在此基礎(chǔ)上對其葉綠素?zé)晒鈪?shù)進行了分析發(fā)現(xiàn)，該基因在保證植物凈光合效率、促進葉片生長的同時，適當降低了植物葉片的氣孔導(dǎo)度及PSII受體側(cè)的部分性能。
猜你喜歡
我的媽媽快樂作文(1.2年級)(2023年2期)2023-03-30 01:09:26 擬南芥：活得粗糙，才讓我有了上太空的資格中學(xué)生天地(A版)(2023年1期)2023-02-17 00:33:04 過表達NtMYB4a基因增強煙草抗旱能力亞熱帶植物科學(xué)(2022年1期)2022-05-17 12:39:32 精細化健康體檢管理模式在體檢中心的應(yīng)用探析健康體檢與管理(2022年4期)2022-05-13 18:42:17 嫦娥5號返回式試驗衛(wèi)星小麥育種材料研究進展情況四川農(nóng)業(yè)科技(2019年5期)2019-07-01 09:46:46 尿黑酸對擬南芥酪氨酸降解缺陷突變體sscd1的影響生命科學(xué)研究(2018年1期)2018-05-29 01:12:47 兩種LED光源作為擬南芥生長光源的應(yīng)用探究上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(2017年3期)2017-04-10 12:39:14 擬南芥干旱敏感突變體篩選及其干旱脅迫響應(yīng)機制探究山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報(2016年6期)2016-12-01 05:38:19 衢州椪柑變異株系—黃皮椪柑相關(guān)特性研究浙江柑橘(2016年1期)2016-03-11 20:12:31 你有什么了不起小小說月刊·下半月(2015年2期)2015-05-14 15:23:17
徐子涵 劉倩 苗大鵬 陳躍 胡鳳榮
（1.南京林業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，南京 210037；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所，杭州 310021）
葉片是植物最重要的器官之一，同時也是植物進行光合作用的主要場所，葉片的形態(tài)、大小、數(shù)目均在植物的生長發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。在現(xiàn)代的分子育種研究中，模式植物具有生長迅速、結(jié)構(gòu)簡單、表型明顯等眾多優(yōu)點，從中獲取葉片發(fā)育特性的定量信息較為容易［1］，對植物發(fā)育研究具有一定的實際意義。春蘭（Cymbidium goeringii）是蘭科（Orchidaceae）蘭屬的一類地生蘭，是國蘭中最具代表性的品種之一，其葉線條優(yōu)美，花朵素雅、花型各異，兼具觀賞和藥用價值［2］。目前對于國蘭的研究主要集中于形態(tài)觀察、生理生化和組織培養(yǎng)方面，對其生長發(fā)育的分子研究較少，且包括春蘭在內(nèi)的蘭科植物基本全為喜陰植物，栽培養(yǎng)護較為困難。因此，通過模式植物研究春蘭葉片發(fā)育及光合特性的分子調(diào)控機理，對探究其營養(yǎng)生長和品質(zhì)形成十分必要。
miR396是植物體內(nèi)的一類保守的miRNA，與植物生長發(fā)育密切相關(guān)，其主要靶向一類重要的生長調(diào)控因子（growth-regulating factor，GRF），在擬南芥、水稻、玉米等不同物種中均發(fā)現(xiàn)其保守序列的存在［3-4］。已有眾多研究發(fā)現(xiàn)，miR396通過調(diào)控GRF轉(zhuǎn)錄因子，對葉片、莖、種子和心皮等組織和器官的生長發(fā)育發(fā)揮著重要的作用，尤其對葉片的研究報道居多，參與調(diào)控葉片的大小、細胞增殖、葉片衰老、葉綠素合成及光合作用等一系列過程［5-6］。但目前來看，miR396在蘭科植物中的研究極少，其對蘭科植物葉片發(fā)育和其他性能的影響也尚不清楚。鑒于此，本研究將春蘭miR396基因前體cgo-MIR396在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中過表達，觀察其葉片的生長表型變化及其光合相關(guān)指標的響應(yīng)，結(jié)合對其在生長不同時期表達模式的分析，為春蘭的栽培應(yīng)用及優(yōu)良品種選育提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
試驗所用春蘭“宋梅”種植于浙江省農(nóng)科院園藝所蘭花組實驗室，選擇生長健壯的品種“宋梅”植株，分別剪取營養(yǎng)生長期和生殖生長期兩個階段的葉片，用于分析miR396在不同葉發(fā)育時期的特異性表達，并進行其前體基因的克隆和超表達載體構(gòu)建。材料取好后裝入已標記的干凈離心管中，立即置于液氮中，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。
轉(zhuǎn)基因所用擬南芥為本實驗室自存的野生型哥倫比亞（Columbia，Col），在培養(yǎng)箱中進行培育，生長條件為：溫度（22±1）℃，濕度70%，光周期16 h光照/8 h黑暗，光照強度6 000-8 000 lx。
1.2 方法
1.2.1 基因表達量的測定 將春蘭營養(yǎng)生長時期的幼葉、成熟葉及生殖生長時期的成熟葉片在液氮中研磨成粉末，用MiniBEST Universal RNA提取試劑盒（TaKaRa，上海）提取各樣本的Total Small RNA，再以800 ng上述各樣品的RNA為模板，用HiScriptⅢ 1stStrand cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（諾維贊，南京）莖環(huán)法進行反轉(zhuǎn)錄，得到miR396成熟體cDNA第一鏈，反轉(zhuǎn)錄引物為：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGT CCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTTCA-3′。以該cDNA為模板，用ChamQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix試劑盒（諾維贊，南京）進行反應(yīng)溶液的配制，在Applied Biosystems 型實時熒光定量分析儀上運行PCR程序，以檢測春蘭miR396在不同生長時期葉片中的表達量。根據(jù)基因序列，用miRNA Design軟件（諾維贊，南京）設(shè)計引物，上游引物 ：5′-GCGCGTTCCACAGCTTTCT-3′，下游引物 ：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′，反應(yīng)條件 ：95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，循環(huán) 40 次 ；95℃15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束通過StepOne Software v2.3導(dǎo)出數(shù)據(jù)，以春蘭18S基因為內(nèi)參，根據(jù)CT值用2-△△Cq相對定量法計算相對表達量。每個時期的葉片設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。
1.2.2 基因轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因株系篩選 將春蘭葉片用液氮研磨呈粉末，用MiniBEST Plant Genomic DNA提取試劑盒（TaKaRa，上海）提取gDNA，以其為模板克隆得到miR396前體cgo-MIR396的全長，連接pBI121植物表達載體，測序成功后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101（酶普利斯，南京）。將含有重組質(zhì)粒pBI121- MIR396的農(nóng)桿菌，對野生型擬南芥Col（WT）進行轉(zhuǎn)化，記為T0代，待其種子成熟收取后，均勻播種在含卡那霉素的MS培養(yǎng)基上，篩選得到T1代轉(zhuǎn)基因植株，待小苗長出4片真葉后移栽入盆土（營養(yǎng)土與育苗基質(zhì)1∶1混合）中繼續(xù)培養(yǎng)，單株收取種子，繼續(xù)進行抗性篩選，直至獲得T3代轉(zhuǎn)基因純合株系。
1.2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥檢測及形態(tài)指標測定 選取生長時期相同的擬南芥野生型Col及篩選得到的miR396過表達植株，取其移栽后狀態(tài)穩(wěn)定植株的葉片組織剪碎，采用2×T5 Direct PCR試劑盒（擎科，南京）的加熱裂解法進行轉(zhuǎn)基因擬南芥的DNA鑒定。另外選取生長時期一致的轉(zhuǎn)基因與野生型植株，分別在移栽后第20天和40天時統(tǒng)計葉片數(shù)目，并測量位于相同部位的葉片長度、寬度、葉面積、葉片數(shù)目等，第60天高度生長基本停止時測量株高。每個株系取5個植株進行測量，每株植株測量3片葉片，下同。
1.2.4 葉綠素含量的測定 選取與測量生長指標相同位置和發(fā)育階段（生殖生長階段，下同）的野生型及轉(zhuǎn)基因葉片，稱取0.05 g，采用無水乙醇與無水丙酮1∶1混合液浸提法，利用分光光度計測定663 nm、646 nm和470 nm下的OD值，根據(jù)公式求出葉綠素的含量。計算公式：葉綠素a含量（mg/g）=（12.21 A663- 2.81 A646）·Vt/ 1 000W；葉綠素b含量（mg/g）=（20.13 A646- 5.03A663）·Vt/ 1 000 W ；葉綠素總量（mg/g）= 葉綠素a含量 + 葉綠素b含量。其中，A663、A646分別為葉綠素溶液在波長663和646 nm時的吸光度；Vt是總提取液體積，為10 mL；W為葉片重量，即0.05g。
1.2.5 光合指標及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定 用CIRAS-3（PP-system，英國）便攜式光合儀進行葉片光合指標的測定。測定時，設(shè)置光合有效輻射強度為80 μmol·m-2·s-1，與培養(yǎng)箱內(nèi)光照基本一致，控制葉室溫度為25℃，CO2濃度為420-450 μmol/mol，相對濕度為（50±10）%，記錄凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（gs）等光合生理參數(shù)。
使用Handy PEA（Hansatech，英國）進行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定。將葉片平展夾在熒光夾4 mm2的暗測試孔中，暗反應(yīng)20 min后進行測定，獲得OJIP熒光誘導(dǎo)曲線及初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、可變熒光（Fv）、PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、及性能指數(shù)（PI）等一系列參數(shù)。
1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2010和SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用單因素（one-way ANOVA）和Duncan法進行方差分析和多重比較（α=0.05），Pearson法進行相關(guān)性分析。圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差。
2 結(jié)果
2.1 春蘭miR396在不同葉發(fā)育時期中的表達
采用實時熒光定量PCR對春蘭營養(yǎng)生長時期的幼嫩葉片、成熟葉片，以及花期成熟葉片中miR396基因的表達進行分析，結(jié)果（圖1）顯示該基因在花期葉片中表達量最高，營養(yǎng)生長時期葉片的表達量均較低。
圖1 春蘭miR396在不同葉發(fā)育時期的相對表達量Fig.1 Relative expression of cgo-miR396 in different leaf development stages
2.2 春蘭miR396過表達株系的檢測
過表達載體構(gòu)建完成并通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥中后，以含Kana抗生素的MS培養(yǎng)基對三代轉(zhuǎn)基因擬南芥進行陽性篩選，得到純合的T3代陽性株系，然后以植物基因組DNA為模板，利用來自35S啟動子和MIR396的篩選引物初步鑒定轉(zhuǎn)基因株系（圖2）。結(jié)果表明，MIR396基因已成功轉(zhuǎn)入擬南芥植株中。
2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥形態(tài)指標的變化
從MS培養(yǎng)基移至土壤中第20天，植株尚未抽莖開花時，對野生型Col和過表達miR396擬南芥幼苗植株的冠幅、葉片數(shù)、葉長和葉寬進行觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的某些形態(tài)指標雖相較野生型（WT）有小幅度的增加，但總體來看，二者之間尚未出現(xiàn)明顯差異（圖3）。
圖2 過表達株系DNA檢測Fig.2 DNA detection of overexpressed line
而在植株處于生殖生長階段時的觀測結(jié)果則表明，miR396過表達后，擬南芥株高增加，葉面積、葉長和葉寬乃至基生葉片數(shù)目均增大（圖4），而莖生葉片數(shù)目未發(fā)現(xiàn)明顯的改變。在這些形態(tài)指標中，葉面積的變化最為明顯，經(jīng)測量的野生型擬南芥平均葉面積為330.57 mm2，而不同的轉(zhuǎn)基因株系Line1、Line 2、Line3和Line4的平均葉面積分別為558.35、527.45、533.24和600.31 mm2，均與野生型的該項指標呈現(xiàn)顯著性變化。
2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥葉綠素含量的變化
圖3 營養(yǎng)生長期形態(tài)指標觀測（Bar=1 cm）Fig.3 Morphological index observation during vegetative growth period
MIR396過表達顯著降低了葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量，其中與野生型對照相比，Line1到Line4株系葉綠素總量分別下降了27.79%、29.11%、27.66%、16.50%，在Line2株系處出現(xiàn)最小值，而葉綠素a與b的比值未發(fā)生明顯變化（表1）。
2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥光合指標的變化
圖5顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥的凈光合速率（Pn）較野生型高出8.50%-19.52%，但尚未構(gòu)成顯著差異。而從氣孔導(dǎo)度（gs）和蒸騰速率（Tr）兩個指標來看，各轉(zhuǎn)基因株系間未發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別，但均顯著低于野生型，氣孔導(dǎo)度下降幅度最大，在Line2株系處出現(xiàn)最小值，比野生型下降了74.8%；蒸騰速率則在Line1處出現(xiàn)最小值，平均值比野生型低46.75%。與之不同的是，隨著氣孔導(dǎo)度的減小，在過表達植株與對照的胞間二氧化碳濃度（Ci）的比較中，只Line2株系顯著低于野生型，但僅下降了9.58%。同時還發(fā)現(xiàn)，MIR396過表達后，葉片的水分利用效率（WUE）增大，在Line1與Line2株系處呈現(xiàn)顯著差異。
2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化
由表2可知，野生型與各轉(zhuǎn)基因株系間的葉綠素?zé)晒鈪?shù)雖略有差異，如Line2和Line3株系的PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、PSⅡ的潛在光化學(xué)效率（Fv/Fo）相對較低，但均未達到統(tǒng)計顯著水平，表明過表達CgMIR396后，擬南芥葉片的捕光及光能轉(zhuǎn)化能力未發(fā)生明顯變化。
圖4 生殖生長期形態(tài)指標觀測（Bar=1 cm）Fig.4 Morphological index observation during reproductive growth period
表1 葉綠素含量的測定Table 1 Determination of chlorophyll content
圖5 葉片光合指標的測定Fig.5 Determination of photosynthetic indexes in leaves
表2 快速葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定Table 2 Rapid determination of chlorophyll fluorescence parameters
2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片能量分配比率的變化
擬南芥轉(zhuǎn)基因后量子產(chǎn)額和能量分配比率的變化趨勢，如圖6所示，其暗適應(yīng)后的最大光化學(xué)效率（φPo）并未發(fā)生較大變化；而在反應(yīng)中心捕獲的激子中，用來推動電子傳遞到電子傳遞鏈中超過QA的其他電子受體的激子占用來推動QA還原激子的比率（ψo）在轉(zhuǎn)基因后略有減小，其中Line2株系與野生型呈現(xiàn)顯著差異，即照光2 ms時有活性的反應(yīng)中心開放程度顯著變??；另外，Line2與Line3株系反應(yīng)中心吸收的光能用于電子傳遞的量子產(chǎn)額（φEo）也顯著降低，下降比例分別為10.01%和8.29%。
圖6 葉片量子產(chǎn)額和能量分配比率的變化Fig.6 Variations of leaf quantum yield and energy distribution ratio
2.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥PS Ⅱ反應(yīng)中心活性參數(shù)的變化
通過對光合機構(gòu)比活性的分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系在單位反應(yīng)中心吸收的光能（ABS/RC）及耗散掉的能量（DIo/RC，在t=0時）僅在Line3株系處出現(xiàn)較明顯的變化，分別高出野生型6.25%和14.45%；但單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA的能量（TRo/RC，在t=0時）和用于電子傳遞的能量（ETo/RC，在t=0時）未發(fā)生明顯變化（圖7）。
圖7 葉片比活性參數(shù)的變化Fig.7 Variations of specific activity parameters in leaves
2.9 轉(zhuǎn)基因擬南芥性能指數(shù)及推動力的變化
以吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)（PIABS）和推動力（DFABS）能夠更為準確地反映植物葉片光合機構(gòu)的狀態(tài)，在圖8中可以看出，轉(zhuǎn)基因株系的PIABS及DFABS均呈現(xiàn)下降趨勢，其中在DFABS中反應(yīng)的變化更為明顯，Line1到Line4株系分別較野生型下降了18.06%、60.22%、54.95%和7.18%，在Line2和Line3處呈現(xiàn)顯著差異，并在Line2株系處達到最小值。
圖8 葉片性能指數(shù)及推動力的變化Fig.8 Variations of performance index and driving force
2.10 轉(zhuǎn)基因擬南芥形態(tài)、光合及葉綠素?zé)晒庵笜说南嚓P(guān)性分析
傳統(tǒng)Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，擬南芥葉面積、葉長和葉寬之間的相關(guān)性呈現(xiàn)極顯著水平，這三者均與氣孔導(dǎo)度（gs）之間呈顯著相關(guān)；胞間二氧化碳濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（gs）和水分利用效率（WUE）三者之間也達到極顯著相關(guān)水平，凈光合速率（Pn）則與其他光合指標間無明顯相關(guān)性；而葉綠素?zé)晒飧黜椫笜酥g大多均存在一定的相關(guān)性，尤其是快速熒光參數(shù)Fo、Fm與Fv及其比值，與DIo/RC、φPo、φEo、PIABS、DFABS之間多數(shù)達到顯著相關(guān)甚至極顯著相關(guān)（表3）。
3 討論
miR396及其靶基因GRF對植物各組織器官的發(fā)育都具有顯著的調(diào)控作用，尤其以控制葉片發(fā)育方面的研究居多［5］。目前的研究結(jié)果表明，該模塊主要是通過控制細胞增殖來調(diào)節(jié)葉細胞形態(tài)乃至葉片的表觀形態(tài)。本研究中發(fā)現(xiàn)，春蘭miR396基因在擬南芥中的過量表達能夠促進生殖生長時期的葉片生長、降低葉綠素含量，進而影響其光合、葉綠素?zé)晒獾纫幌盗袇?shù)的變化。
表3各單項指標的相關(guān)系數(shù)矩陣Table 3 Correlation coefficient matrix of each single index
在對葉片形態(tài)的觀測中，cgo-miR396基因過表達株系的葉片發(fā)育受到促進，呈現(xiàn)出與擬南芥、番茄、歐洲油菜等雙子葉植物在miR396-GRF模塊中不一致的研究趨勢；但Wu等［7］在玉米中對ZmGRF10的研究結(jié)果則表明，該基因的過量表達導(dǎo)致了玉米葉面積和株高的減小，這與本研究的結(jié)果較為相似。通過前期對春蘭miR396的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其與高粱、甘蔗等單子葉植物的同源性最高，因此，單雙子葉植物之間基因功能的差異，以及蘭科植物自身的特異性，均暗示著該作用模塊可能發(fā)揮的特殊功能。
光合作用是植物最為重要的物質(zhì)和能量來源，春蘭作為一種重要的觀賞和藥用植物，探究光合作用不僅能夠更好的保障其生長和發(fā)育所需的優(yōu)質(zhì)物質(zhì)來源，還可對其栽培所需環(huán)境、葉片形態(tài)發(fā)育及觀賞價值等方面的研究提供指導(dǎo)。在本研究中，隨著轉(zhuǎn)基因植株葉片面積和長寬的增加，葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量均呈下降趨勢。從前人的分析來看，miR396導(dǎo)致葉片增大的主要原因是由于細胞增殖導(dǎo)致葉細胞數(shù)目的增多或體積的增大［8-9］，本研究結(jié)果可能與周厚君等［10］的研究結(jié)果相似，即miR396導(dǎo)致了細胞體積的擴張，且可能并未增加葉綠體的數(shù)目，從而使得葉綠素分布較為分散，單位重量的葉綠素含量明顯下降、且葉綠素a/b的比值保持不變。從光合指標來看，相較野生型來說，cgo-miR396的過表達雖導(dǎo)致氣孔導(dǎo)度顯著下降，乃至蒸騰速率降低，但其Ci指標表明其用于光合作用的CO2仍能達到飽和狀態(tài)，水分利用效率也上升，最終使凈光合效率呈上升趨勢，促進了擬南芥的生長。另外，本研究中光合各項指標的組內(nèi)標準偏差較大，參考張治平等［11］對于煙草轉(zhuǎn)基因葉片光合作用的研究來看，不同葉位間光合指標的差異，是導(dǎo)致該因素產(chǎn)生的主要原因。
本研究的4個轉(zhuǎn)基因株系相較野生型來看，雖PSⅡ最大光化學(xué)效率及潛在光化學(xué)效率等葉綠素?zé)晒鈪?shù)未發(fā)生顯著變化，但Appenroth等［12］和Heerden等［13］的研究表明，性能指數(shù)和推動力能夠更準確的反映植物光合機構(gòu)的狀態(tài)，通過圖8中對二者的分析來看，miR396的過表達很可能對擬南芥葉片的光合機構(gòu)造成了一定程度的破壞，尤其體現(xiàn)在Line2與Line3株系中。且對量子產(chǎn)額和能量分配比率的分析也表明，轉(zhuǎn)基因株系的能量在PSII反應(yīng)中心中的分配比率發(fā)生了變化，照光2ms時有活性反應(yīng)中心的開放程度也相應(yīng)減小，說明PSⅡ受體側(cè)發(fā)生了改變［14］。
最后，通過對這24個指標進行的Pearson相關(guān)性分析來看，各指標間均存在一定的相關(guān)性，一些指標間呈現(xiàn)顯著相關(guān)，有的甚至達到極顯著相關(guān)。從形態(tài)指標來看，葉面積與葉長、葉寬均呈極顯著相關(guān)，且與葉寬的相關(guān)性更高，表明miR396主要是通過增大葉寬來增大葉片大小；這三者也與氣孔導(dǎo)度（gs）呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，結(jié)合上述分析來看，推測葉片細胞的增殖或許導(dǎo)致了氣孔數(shù)目的增多，但因光合所需CO2已達飽和狀態(tài)，因此氣孔開合程度遵循自主調(diào)節(jié)機制而顯著下降，在后續(xù)研究中可對葉片表皮結(jié)構(gòu)進一步觀察以得出結(jié)論。各光合指標分析表明，凈光合速率與其他因素并無顯著相關(guān)性，表明葉面積、氣孔及水分可能不是影響光合速率的主要原因，因此在這些轉(zhuǎn)基因植株中，葉片中各種光合酶的活性或其他內(nèi)部因子可能已經(jīng)發(fā)生了改變。另外，雖然葉綠素與類胡蘿卜素是植物吸收光能的基礎(chǔ)，但相關(guān)性分析表明，葉綠素與光合能力的變化也并不存在正相關(guān)，這與葉子飄等［15］的研究結(jié)果一致，說明植物電子傳遞的速率不僅與葉綠素含量有關(guān)，還與捕光色素分子的特性，如光能吸收截面、激子傳遞效率等密切相關(guān)［16］。
4 結(jié)論
春蘭miR396的過表達對擬南芥生殖生長時期葉片生長發(fā)育的形態(tài)指標和光合指標均產(chǎn)生了一定的影響，與前人在雙子葉植物中的研究存在較大差異，并在此基礎(chǔ)上對其葉綠素?zé)晒鈪?shù)進行了分析發(fā)現(xiàn)，該基因在保證植物凈光合效率、促進葉片生長的同時，適當降低了植物葉片的氣孔導(dǎo)度及PSII受體側(cè)的部分性能。
猜你喜歡
快樂作文(1.2年級)(2023年2期)2023-03-30 01:09:26
中學(xué)生天地(A版)(2023年1期)2023-02-17 00:33:04
亞熱帶植物科學(xué)(2022年1期)2022-05-17 12:39:32
健康體檢與管理(2022年4期)2022-05-13 18:42:17
四川農(nóng)業(yè)科技(2019年5期)2019-07-01 09:46:46
生命科學(xué)研究(2018年1期)2018-05-29 01:12:47
上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(2017年3期)2017-04-10 12:39:14
山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報(2016年6期)2016-12-01 05:38:19
浙江柑橘(2016年1期)2016-03-11 20:12:31
小小說月刊·下半月(2015年2期)2015-05-14 15:23:17
