春蘭miR396過(guò)表達(dá)對(duì)擬南芥葉片生長(zhǎng)、光合及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h1>
2021-06-23 07:55:28徐子涵劉倩苗大鵬陳躍胡鳳榮
生物技術(shù)通報(bào) 2021年5期
徐子涵 劉倩 苗大鵬 陳躍 胡鳳榮
（1.南京林業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，南京 210037；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所，杭州 310021）
葉片是植物最重要的器官之一，同時(shí)也是植物進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所，葉片的形態(tài)、大小、數(shù)目均在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。在現(xiàn)代的分子育種研究中，模式植物具有生長(zhǎng)迅速、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、表型明顯等眾多優(yōu)點(diǎn)，從中獲取葉片發(fā)育特性的定量信息較為容易［1］，對(duì)植物發(fā)育研究具有一定的實(shí)際意義。春蘭（Cymbidium goeringii）是蘭科（Orchidaceae）蘭屬的一類(lèi)地生蘭，是國(guó)蘭中最具代表性的品種之一，其葉線(xiàn)條優(yōu)美，花朵素雅、花型各異，兼具觀賞和藥用價(jià)值［2］。目前對(duì)于國(guó)蘭的研究主要集中于形態(tài)觀察、生理生化和組織培養(yǎng)方面，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的分子研究較少，且包括春蘭在內(nèi)的蘭科植物基本全為喜陰植物，栽培養(yǎng)護(hù)較為困難。因此，通過(guò)模式植物研究春蘭葉片發(fā)育及光合特性的分子調(diào)控機(jī)理，對(duì)探究其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和品質(zhì)形成十分必要。
miR396是植物體內(nèi)的一類(lèi)保守的miRNA，與植物生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，其主要靶向一類(lèi)重要的生長(zhǎng)調(diào)控因子（growth-regulating factor，GRF），在擬南芥、水稻、玉米等不同物種中均發(fā)現(xiàn)其保守序列的存在［3-4］。已有眾多研究發(fā)現(xiàn)，miR396通過(guò)調(diào)控GRF轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)葉片、莖、種子和心皮等組織和器官的生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮著重要的作用，尤其對(duì)葉片的研究報(bào)道居多，參與調(diào)控葉片的大小、細(xì)胞增殖、葉片衰老、葉綠素合成及光合作用等一系列過(guò)程［5-6］。但目前來(lái)看，miR396在蘭科植物中的研究極少，其對(duì)蘭科植物葉片發(fā)育和其他性能的影響也尚不清楚。鑒于此，本研究將春蘭miR396基因前體cgo-MIR396在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中過(guò)表達(dá)，觀察其葉片的生長(zhǎng)表型變化及其光合相關(guān)指標(biāo)的響應(yīng)，結(jié)合對(duì)其在生長(zhǎng)不同時(shí)期表達(dá)模式的分析，為春蘭的栽培應(yīng)用及優(yōu)良品種選育提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
試驗(yàn)所用春蘭“宋梅”種植于浙江省農(nóng)科院園藝所蘭花組實(shí)驗(yàn)室，選擇生長(zhǎng)健壯的品種“宋梅”植株，分別剪取營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期和生殖生長(zhǎng)期兩個(gè)階段的葉片，用于分析miR396在不同葉發(fā)育時(shí)期的特異性表達(dá)，并進(jìn)行其前體基因的克隆和超表達(dá)載體構(gòu)建。材料取好后裝入已標(biāo)記的干凈離心管中，立即置于液氮中，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。
轉(zhuǎn)基因所用擬南芥為本實(shí)驗(yàn)室自存的野生型哥倫比亞（Columbia，Col），在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培育，生長(zhǎng)條件為：溫度（22±1）℃，濕度70%，光周期16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度6 000-8 000 lx。
1.2 方法
1.2.1 基因表達(dá)量的測(cè)定 將春蘭營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的幼葉、成熟葉及生殖生長(zhǎng)時(shí)期的成熟葉片在液氮中研磨成粉末，用MiniBEST Universal RNA提取試劑盒（TaKaRa，上海）提取各樣本的Total Small RNA，再以800 ng上述各樣品的RNA為模板，用HiScriptⅢ 1stStrand cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（諾維贊，南京）莖環(huán)法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到miR396成熟體cDNA第一鏈，反轉(zhuǎn)錄引物為：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGT CCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTTCA-3′。以該cDNA為模板，用ChamQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix試劑盒（諾維贊，南京）進(jìn)行反應(yīng)溶液的配制，在Applied Biosystems 型實(shí)時(shí)熒光定量分析儀上運(yùn)行PCR程序，以檢測(cè)春蘭miR396在不同生長(zhǎng)時(shí)期葉片中的表達(dá)量。根據(jù)基因序列，用miRNA Design軟件（諾維贊，南京）設(shè)計(jì)引物，上游引物 ：5′-GCGCGTTCCACAGCTTTCT-3′，下游引物 ：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′，反應(yīng)條件 ：95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，循環(huán) 40 次 ；95℃15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束通過(guò)StepOne Software v2.3導(dǎo)出數(shù)據(jù)，以春蘭18S基因?yàn)閮?nèi)參，根據(jù)CT值用2-△△Cq相對(duì)定量法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)時(shí)期的葉片設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。
1.2.2 基因轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因株系篩選 將春蘭葉片用液氮研磨呈粉末，用MiniBEST Plant Genomic DNA提取試劑盒（TaKaRa，上海）提取gDNA，以其為模板克隆得到miR396前體cgo-MIR396的全長(zhǎng)，連接pBI121植物表達(dá)載體，測(cè)序成功后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101（酶普利斯，南京）。將含有重組質(zhì)粒pBI121- MIR396的農(nóng)桿菌，對(duì)野生型擬南芥Col（WT）進(jìn)行轉(zhuǎn)化，記為T(mén)0代，待其種子成熟收取后，均勻播種在含卡那霉素的MS培養(yǎng)基上，篩選得到T1代轉(zhuǎn)基因植株，待小苗長(zhǎng)出4片真葉后移栽入盆土（營(yíng)養(yǎng)土與育苗基質(zhì)1∶1混合）中繼續(xù)培養(yǎng)，單株收取種子，繼續(xù)進(jìn)行抗性篩選，直至獲得T3代轉(zhuǎn)基因純合株系。
1.2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥檢測(cè)及形態(tài)指標(biāo)測(cè)定 選取生長(zhǎng)時(shí)期相同的擬南芥野生型Col及篩選得到的miR396過(guò)表達(dá)植株，取其移栽后狀態(tài)穩(wěn)定植株的葉片組織剪碎，采用2×T5 Direct PCR試劑盒（擎科，南京）的加熱裂解法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因擬南芥的DNA鑒定。另外選取生長(zhǎng)時(shí)期一致的轉(zhuǎn)基因與野生型植株，分別在移栽后第20天和40天時(shí)統(tǒng)計(jì)葉片數(shù)目，并測(cè)量位于相同部位的葉片長(zhǎng)度、寬度、葉面積、葉片數(shù)目等，第60天高度生長(zhǎng)基本停止時(shí)測(cè)量株高。每個(gè)株系取5個(gè)植株進(jìn)行測(cè)量，每株植株測(cè)量3片葉片，下同。
1.2.4 葉綠素含量的測(cè)定 選取與測(cè)量生長(zhǎng)指標(biāo)相同位置和發(fā)育階段（生殖生長(zhǎng)階段，下同）的野生型及轉(zhuǎn)基因葉片，稱(chēng)取0.05 g，采用無(wú)水乙醇與無(wú)水丙酮1∶1混合液浸提法，利用分光光度計(jì)測(cè)定663 nm、646 nm和470 nm下的OD值，根據(jù)公式求出葉綠素的含量。計(jì)算公式：葉綠素a含量（mg/g）=（12.21 A663- 2.81 A646）·Vt/ 1 000W；葉綠素b含量（mg/g）=（20.13 A646- 5.03A663）·Vt/ 1 000 W ；葉綠素總量（mg/g）= 葉綠素a含量 + 葉綠素b含量。其中，A663、A646分別為葉綠素溶液在波長(zhǎng)663和646 nm時(shí)的吸光度；Vt是總提取液體積，為10 mL；W為葉片重量，即0.05g。
1.2.5 光合指標(biāo)及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定 用CIRAS-3（PP-system，英國(guó)）便攜式光合儀進(jìn)行葉片光合指標(biāo)的測(cè)定。測(cè)定時(shí)，設(shè)置光合有效輻射強(qiáng)度為80 μmol·m-2·s-1，與培養(yǎng)箱內(nèi)光照基本一致，控制葉室溫度為25℃，CO2濃度為420-450 μmol/mol，相對(duì)濕度為（50±10）%，記錄凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（gs）等光合生理參數(shù)。
使用Handy PEA（Hansatech，英國(guó)）進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定。將葉片平展夾在熒光夾4 mm2的暗測(cè)試孔中，暗反應(yīng)20 min后進(jìn)行測(cè)定，獲得OJIP熒光誘導(dǎo)曲線(xiàn)及初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、可變熒光（Fv）、PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、及性能指數(shù)（PI）等一系列參數(shù)。
1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2010和SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素（one-way ANOVA）和Duncan法進(jìn)行方差分析和多重比較（α=0.05），Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析。圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
2 結(jié)果
2.1 春蘭miR396在不同葉發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)
采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)春蘭營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的幼嫩葉片、成熟葉片，以及花期成熟葉片中miR396基因的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果（圖1）顯示該基因在花期葉片中表達(dá)量最高，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期葉片的表達(dá)量均較低。
圖1 春蘭miR396在不同葉發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression of cgo-miR396 in different leaf development stages
2.2 春蘭miR396過(guò)表達(dá)株系的檢測(cè)
過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建完成并通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥中后，以含Kana抗生素的MS培養(yǎng)基對(duì)三代轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行陽(yáng)性篩選，得到純合的T3代陽(yáng)性株系，然后以植物基因組DNA為模板，利用來(lái)自35S啟動(dòng)子和MIR396的篩選引物初步鑒定轉(zhuǎn)基因株系（圖2）。結(jié)果表明，MIR396基因已成功轉(zhuǎn)入擬南芥植株中。
2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥形態(tài)指標(biāo)的變化
從MS培養(yǎng)基移至土壤中第20天，植株尚未抽莖開(kāi)花時(shí)，對(duì)野生型Col和過(guò)表達(dá)miR396擬南芥幼苗植株的冠幅、葉片數(shù)、葉長(zhǎng)和葉寬進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的某些形態(tài)指標(biāo)雖相較野生型（WT）有小幅度的增加，但總體來(lái)看，二者之間尚未出現(xiàn)明顯差異（圖3）。
圖2 過(guò)表達(dá)株系DNA檢測(cè)Fig.2 DNA detection of overexpressed line
而在植株處于生殖生長(zhǎng)階段時(shí)的觀測(cè)結(jié)果則表明，miR396過(guò)表達(dá)后，擬南芥株高增加，葉面積、葉長(zhǎng)和葉寬乃至基生葉片數(shù)目均增大（圖4），而莖生葉片數(shù)目未發(fā)現(xiàn)明顯的改變。在這些形態(tài)指標(biāo)中，葉面積的變化最為明顯，經(jīng)測(cè)量的野生型擬南芥平均葉面積為330.57 mm2，而不同的轉(zhuǎn)基因株系Line1、Line 2、Line3和Line4的平均葉面積分別為558.35、527.45、533.24和600.31 mm2，均與野生型的該項(xiàng)指標(biāo)呈現(xiàn)顯著性變化。
2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥葉綠素含量的變化
圖3 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期形態(tài)指標(biāo)觀測(cè)（Bar=1 cm）Fig.3 Morphological index observation during vegetative growth period
MIR396過(guò)表達(dá)顯著降低了葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量，其中與野生型對(duì)照相比，Line1到Line4株系葉綠素總量分別下降了27.79%、29.11%、27.66%、16.50%，在Line2株系處出現(xiàn)最小值，而葉綠素a與b的比值未發(fā)生明顯變化（表1）。
2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥光合指標(biāo)的變化
圖5顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥的凈光合速率（Pn）較野生型高出8.50%-19.52%，但尚未構(gòu)成顯著差異。而從氣孔導(dǎo)度（gs）和蒸騰速率（Tr）兩個(gè)指標(biāo)來(lái)看，各轉(zhuǎn)基因株系間未發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別，但均顯著低于野生型，氣孔導(dǎo)度下降幅度最大，在Line2株系處出現(xiàn)最小值，比野生型下降了74.8%；蒸騰速率則在Line1處出現(xiàn)最小值，平均值比野生型低46.75%。與之不同的是，隨著氣孔導(dǎo)度的減小，在過(guò)表達(dá)植株與對(duì)照的胞間二氧化碳濃度（Ci）的比較中，只Line2株系顯著低于野生型，但僅下降了9.58%。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，MIR396過(guò)表達(dá)后，葉片的水分利用效率（WUE）增大，在Line1與Line2株系處呈現(xiàn)顯著差異。
2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化
由表2可知，野生型與各轉(zhuǎn)基因株系間的葉綠素?zé)晒鈪?shù)雖略有差異，如Line2和Line3株系的PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、PSⅡ的潛在光化學(xué)效率（Fv/Fo）相對(duì)較低，但均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著水平，表明過(guò)表達(dá)CgMIR396后，擬南芥葉片的捕光及光能轉(zhuǎn)化能力未發(fā)生明顯變化。
圖4 生殖生長(zhǎng)期形態(tài)指標(biāo)觀測(cè)（Bar=1 cm）Fig.4 Morphological index observation during reproductive growth period
表1 葉綠素含量的測(cè)定Table 1 Determination of chlorophyll content
圖5 葉片光合指標(biāo)的測(cè)定Fig.5 Determination of photosynthetic indexes in leaves
表2 快速葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定Table 2 Rapid determination of chlorophyll fluorescence parameters
2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片能量分配比率的變化
擬南芥轉(zhuǎn)基因后量子產(chǎn)額和能量分配比率的變化趨勢(shì)，如圖6所示，其暗適應(yīng)后的最大光化學(xué)效率（φPo）并未發(fā)生較大變化；而在反應(yīng)中心捕獲的激子中，用來(lái)推動(dòng)電子傳遞到電子傳遞鏈中超過(guò)QA的其他電子受體的激子占用來(lái)推動(dòng)QA還原激子的比率（ψo(hù)）在轉(zhuǎn)基因后略有減小，其中Line2株系與野生型呈現(xiàn)顯著差異，即照光2 ms時(shí)有活性的反應(yīng)中心開(kāi)放程度顯著變小；另外，Line2與Line3株系反應(yīng)中心吸收的光能用于電子傳遞的量子產(chǎn)額（φEo）也顯著降低，下降比例分別為10.01%和8.29%。
圖6 葉片量子產(chǎn)額和能量分配比率的變化Fig.6 Variations of leaf quantum yield and energy distribution ratio
2.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥PS Ⅱ反應(yīng)中心活性參數(shù)的變化
通過(guò)對(duì)光合機(jī)構(gòu)比活性的分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系在單位反應(yīng)中心吸收的光能（ABS/RC）及耗散掉的能量（DIo/RC，在t=0時(shí)）僅在Line3株系處出現(xiàn)較明顯的變化，分別高出野生型6.25%和14.45%；但單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA的能量（TRo/RC，在t=0時(shí)）和用于電子傳遞的能量（ETo/RC，在t=0時(shí)）未發(fā)生明顯變化（圖7）。
圖7 葉片比活性參數(shù)的變化Fig.7 Variations of specific activity parameters in leaves
2.9 轉(zhuǎn)基因擬南芥性能指數(shù)及推動(dòng)力的變化
以吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)（PIABS）和推動(dòng)力（DFABS）能夠更為準(zhǔn)確地反映植物葉片光合機(jī)構(gòu)的狀態(tài)，在圖8中可以看出，轉(zhuǎn)基因株系的PIABS及DFABS均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中在DFABS中反應(yīng)的變化更為明顯，Line1到Line4株系分別較野生型下降了18.06%、60.22%、54.95%和7.18%，在Line2和Line3處呈現(xiàn)顯著差異，并在Line2株系處達(dá)到最小值。
圖8 葉片性能指數(shù)及推動(dòng)力的變化Fig.8 Variations of performance index and driving force
2.10 轉(zhuǎn)基因擬南芥形態(tài)、光合及葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)的相關(guān)性分析
傳統(tǒng)Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，擬南芥葉面積、葉長(zhǎng)和葉寬之間的相關(guān)性呈現(xiàn)極顯著水平，這三者均與氣孔導(dǎo)度（gs）之間呈顯著相關(guān)；胞間二氧化碳濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（gs）和水分利用效率（WUE）三者之間也達(dá)到極顯著相關(guān)水平，凈光合速率（Pn）則與其他光合指標(biāo)間無(wú)明顯相關(guān)性；而葉綠素?zé)晒飧黜?xiàng)指標(biāo)之間大多均存在一定的相關(guān)性，尤其是快速熒光參數(shù)Fo、Fm與Fv及其比值，與DIo/RC、φPo、φEo、PIABS、DFABS之間多數(shù)達(dá)到顯著相關(guān)甚至極顯著相關(guān)（表3）。
3 討論
miR396及其靶基因GRF對(duì)植物各組織器官的發(fā)育都具有顯著的調(diào)控作用，尤其以控制葉片發(fā)育方面的研究居多［5］。目前的研究結(jié)果表明，該模塊主要是通過(guò)控制細(xì)胞增殖來(lái)調(diào)節(jié)葉細(xì)胞形態(tài)乃至葉片的表觀形態(tài)。本研究中發(fā)現(xiàn)，春蘭miR396基因在擬南芥中的過(guò)量表達(dá)能夠促進(jìn)生殖生長(zhǎng)時(shí)期的葉片生長(zhǎng)、降低葉綠素含量，進(jìn)而影響其光合、葉綠素?zé)晒獾纫幌盗袇?shù)的變化。
表3各單項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)矩陣Table 3 Correlation coefficient matrix of each single index
在對(duì)葉片形態(tài)的觀測(cè)中，cgo-miR396基因過(guò)表達(dá)株系的葉片發(fā)育受到促進(jìn)，呈現(xiàn)出與擬南芥、番茄、歐洲油菜等雙子葉植物在miR396-GRF模塊中不一致的研究趨勢(shì)；但Wu等［7］在玉米中對(duì)ZmGRF10的研究結(jié)果則表明，該基因的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致了玉米葉面積和株高的減小，這與本研究的結(jié)果較為相似。通過(guò)前期對(duì)春蘭miR396的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其與高粱、甘蔗等單子葉植物的同源性最高，因此，單雙子葉植物之間基因功能的差異，以及蘭科植物自身的特異性，均暗示著該作用模塊可能發(fā)揮的特殊功能。
光合作用是植物最為重要的物質(zhì)和能量來(lái)源，春蘭作為一種重要的觀賞和藥用植物，探究光合作用不僅能夠更好的保障其生長(zhǎng)和發(fā)育所需的優(yōu)質(zhì)物質(zhì)來(lái)源，還可對(duì)其栽培所需環(huán)境、葉片形態(tài)發(fā)育及觀賞價(jià)值等方面的研究提供指導(dǎo)。在本研究中，隨著轉(zhuǎn)基因植株葉片面積和長(zhǎng)寬的增加，葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量均呈下降趨勢(shì)。從前人的分析來(lái)看，miR396導(dǎo)致葉片增大的主要原因是由于細(xì)胞增殖導(dǎo)致葉細(xì)胞數(shù)目的增多或體積的增大［8-9］，本研究結(jié)果可能與周厚君等［10］的研究結(jié)果相似，即miR396導(dǎo)致了細(xì)胞體積的擴(kuò)張，且可能并未增加葉綠體的數(shù)目，從而使得葉綠素分布較為分散，單位重量的葉綠素含量明顯下降、且葉綠素a/b的比值保持不變。從光合指標(biāo)來(lái)看，相較野生型來(lái)說(shuō)，cgo-miR396的過(guò)表達(dá)雖導(dǎo)致氣孔導(dǎo)度顯著下降，乃至蒸騰速率降低，但其Ci指標(biāo)表明其用于光合作用的CO2仍能達(dá)到飽和狀態(tài)，水分利用效率也上升，最終使凈光合效率呈上升趨勢(shì)，促進(jìn)了擬南芥的生長(zhǎng)。另外，本研究中光合各項(xiàng)指標(biāo)的組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，參考張治平等［11］對(duì)于煙草轉(zhuǎn)基因葉片光合作用的研究來(lái)看，不同葉位間光合指標(biāo)的差異，是導(dǎo)致該因素產(chǎn)生的主要原因。
本研究的4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系相較野生型來(lái)看，雖PSⅡ最大光化學(xué)效率及潛在光化學(xué)效率等葉綠素?zé)晒鈪?shù)未發(fā)生顯著變化，但Appenroth等［12］和Heerden等［13］的研究表明，性能指數(shù)和推動(dòng)力能夠更準(zhǔn)確的反映植物光合機(jī)構(gòu)的狀態(tài)，通過(guò)圖8中對(duì)二者的分析來(lái)看，miR396的過(guò)表達(dá)很可能對(duì)擬南芥葉片的光合機(jī)構(gòu)造成了一定程度的破壞，尤其體現(xiàn)在Line2與Line3株系中。且對(duì)量子產(chǎn)額和能量分配比率的分析也表明，轉(zhuǎn)基因株系的能量在PSII反應(yīng)中心中的分配比率發(fā)生了變化，照光2ms時(shí)有活性反應(yīng)中心的開(kāi)放程度也相應(yīng)減小，說(shuō)明PSⅡ受體側(cè)發(fā)生了改變［14］。
最后，通過(guò)對(duì)這24個(gè)指標(biāo)進(jìn)行的Pearson相關(guān)性分析來(lái)看，各指標(biāo)間均存在一定的相關(guān)性，一些指標(biāo)間呈現(xiàn)顯著相關(guān)，有的甚至達(dá)到極顯著相關(guān)。從形態(tài)指標(biāo)來(lái)看，葉面積與葉長(zhǎng)、葉寬均呈極顯著相關(guān)，且與葉寬的相關(guān)性更高，表明miR396主要是通過(guò)增大葉寬來(lái)增大葉片大?。贿@三者也與氣孔導(dǎo)度（gs）呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，結(jié)合上述分析來(lái)看，推測(cè)葉片細(xì)胞的增殖或許導(dǎo)致了氣孔數(shù)目的增多，但因光合所需CO2已達(dá)飽和狀態(tài)，因此氣孔開(kāi)合程度遵循自主調(diào)節(jié)機(jī)制而顯著下降，在后續(xù)研究中可對(duì)葉片表皮結(jié)構(gòu)進(jìn)一步觀察以得出結(jié)論。各光合指標(biāo)分析表明，凈光合速率與其他因素并無(wú)顯著相關(guān)性，表明葉面積、氣孔及水分可能不是影響光合速率的主要原因，因此在這些轉(zhuǎn)基因植株中，葉片中各種光合酶的活性或其他內(nèi)部因子可能已經(jīng)發(fā)生了改變。另外，雖然葉綠素與類(lèi)胡蘿卜素是植物吸收光能的基礎(chǔ)，但相關(guān)性分析表明，葉綠素與光合能力的變化也并不存在正相關(guān)，這與葉子飄等［15］的研究結(jié)果一致，說(shuō)明植物電子傳遞的速率不僅與葉綠素含量有關(guān)，還與捕光色素分子的特性，如光能吸收截面、激子傳遞效率等密切相關(guān)［16］。
4 結(jié)論
春蘭miR396的過(guò)表達(dá)對(duì)擬南芥生殖生長(zhǎng)時(shí)期葉片生長(zhǎng)發(fā)育的形態(tài)指標(biāo)和光合指標(biāo)均產(chǎn)生了一定的影響，與前人在雙子葉植物中的研究存在較大差異，并在此基礎(chǔ)上對(duì)其葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行了分析發(fā)現(xiàn)，該基因在保證植物凈光合效率、促進(jìn)葉片生長(zhǎng)的同時(shí)，適當(dāng)降低了植物葉片的氣孔導(dǎo)度及PSII受體側(cè)的部分性能。
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徐子涵 劉倩 苗大鵬 陳躍 胡鳳榮
（1.南京林業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，南京 210037；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所，杭州 310021）
葉片是植物最重要的器官之一，同時(shí)也是植物進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所，葉片的形態(tài)、大小、數(shù)目均在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。在現(xiàn)代的分子育種研究中，模式植物具有生長(zhǎng)迅速、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、表型明顯等眾多優(yōu)點(diǎn)，從中獲取葉片發(fā)育特性的定量信息較為容易［1］，對(duì)植物發(fā)育研究具有一定的實(shí)際意義。春蘭（Cymbidium goeringii）是蘭科（Orchidaceae）蘭屬的一類(lèi)地生蘭，是國(guó)蘭中最具代表性的品種之一，其葉線(xiàn)條優(yōu)美，花朵素雅、花型各異，兼具觀賞和藥用價(jià)值［2］。目前對(duì)于國(guó)蘭的研究主要集中于形態(tài)觀察、生理生化和組織培養(yǎng)方面，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的分子研究較少，且包括春蘭在內(nèi)的蘭科植物基本全為喜陰植物，栽培養(yǎng)護(hù)較為困難。因此，通過(guò)模式植物研究春蘭葉片發(fā)育及光合特性的分子調(diào)控機(jī)理，對(duì)探究其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和品質(zhì)形成十分必要。
miR396是植物體內(nèi)的一類(lèi)保守的miRNA，與植物生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，其主要靶向一類(lèi)重要的生長(zhǎng)調(diào)控因子（growth-regulating factor，GRF），在擬南芥、水稻、玉米等不同物種中均發(fā)現(xiàn)其保守序列的存在［3-4］。已有眾多研究發(fā)現(xiàn)，miR396通過(guò)調(diào)控GRF轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)葉片、莖、種子和心皮等組織和器官的生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮著重要的作用，尤其對(duì)葉片的研究報(bào)道居多，參與調(diào)控葉片的大小、細(xì)胞增殖、葉片衰老、葉綠素合成及光合作用等一系列過(guò)程［5-6］。但目前來(lái)看，miR396在蘭科植物中的研究極少，其對(duì)蘭科植物葉片發(fā)育和其他性能的影響也尚不清楚。鑒于此，本研究將春蘭miR396基因前體cgo-MIR396在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中過(guò)表達(dá)，觀察其葉片的生長(zhǎng)表型變化及其光合相關(guān)指標(biāo)的響應(yīng)，結(jié)合對(duì)其在生長(zhǎng)不同時(shí)期表達(dá)模式的分析，為春蘭的栽培應(yīng)用及優(yōu)良品種選育提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
試驗(yàn)所用春蘭“宋梅”種植于浙江省農(nóng)科院園藝所蘭花組實(shí)驗(yàn)室，選擇生長(zhǎng)健壯的品種“宋梅”植株，分別剪取營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期和生殖生長(zhǎng)期兩個(gè)階段的葉片，用于分析miR396在不同葉發(fā)育時(shí)期的特異性表達(dá)，并進(jìn)行其前體基因的克隆和超表達(dá)載體構(gòu)建。材料取好后裝入已標(biāo)記的干凈離心管中，立即置于液氮中，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。
轉(zhuǎn)基因所用擬南芥為本實(shí)驗(yàn)室自存的野生型哥倫比亞（Columbia，Col），在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培育，生長(zhǎng)條件為：溫度（22±1）℃，濕度70%，光周期16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度6 000-8 000 lx。
1.2 方法
1.2.1 基因表達(dá)量的測(cè)定 將春蘭營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的幼葉、成熟葉及生殖生長(zhǎng)時(shí)期的成熟葉片在液氮中研磨成粉末，用MiniBEST Universal RNA提取試劑盒（TaKaRa，上海）提取各樣本的Total Small RNA，再以800 ng上述各樣品的RNA為模板，用HiScriptⅢ 1stStrand cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（諾維贊，南京）莖環(huán)法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到miR396成熟體cDNA第一鏈，反轉(zhuǎn)錄引物為：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGT CCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTTCA-3′。以該cDNA為模板，用ChamQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix試劑盒（諾維贊，南京）進(jìn)行反應(yīng)溶液的配制，在Applied Biosystems 型實(shí)時(shí)熒光定量分析儀上運(yùn)行PCR程序，以檢測(cè)春蘭miR396在不同生長(zhǎng)時(shí)期葉片中的表達(dá)量。根據(jù)基因序列，用miRNA Design軟件（諾維贊，南京）設(shè)計(jì)引物，上游引物 ：5′-GCGCGTTCCACAGCTTTCT-3′，下游引物 ：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′，反應(yīng)條件 ：95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，循環(huán) 40 次 ；95℃15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束通過(guò)StepOne Software v2.3導(dǎo)出數(shù)據(jù)，以春蘭18S基因?yàn)閮?nèi)參，根據(jù)CT值用2-△△Cq相對(duì)定量法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)時(shí)期的葉片設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。
1.2.2 基因轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因株系篩選 將春蘭葉片用液氮研磨呈粉末，用MiniBEST Plant Genomic DNA提取試劑盒（TaKaRa，上海）提取gDNA，以其為模板克隆得到miR396前體cgo-MIR396的全長(zhǎng)，連接pBI121植物表達(dá)載體，測(cè)序成功后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101（酶普利斯，南京）。將含有重組質(zhì)粒pBI121- MIR396的農(nóng)桿菌，對(duì)野生型擬南芥Col（WT）進(jìn)行轉(zhuǎn)化，記為T(mén)0代，待其種子成熟收取后，均勻播種在含卡那霉素的MS培養(yǎng)基上，篩選得到T1代轉(zhuǎn)基因植株，待小苗長(zhǎng)出4片真葉后移栽入盆土（營(yíng)養(yǎng)土與育苗基質(zhì)1∶1混合）中繼續(xù)培養(yǎng)，單株收取種子，繼續(xù)進(jìn)行抗性篩選，直至獲得T3代轉(zhuǎn)基因純合株系。
1.2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥檢測(cè)及形態(tài)指標(biāo)測(cè)定 選取生長(zhǎng)時(shí)期相同的擬南芥野生型Col及篩選得到的miR396過(guò)表達(dá)植株，取其移栽后狀態(tài)穩(wěn)定植株的葉片組織剪碎，采用2×T5 Direct PCR試劑盒（擎科，南京）的加熱裂解法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因擬南芥的DNA鑒定。另外選取生長(zhǎng)時(shí)期一致的轉(zhuǎn)基因與野生型植株，分別在移栽后第20天和40天時(shí)統(tǒng)計(jì)葉片數(shù)目，并測(cè)量位于相同部位的葉片長(zhǎng)度、寬度、葉面積、葉片數(shù)目等，第60天高度生長(zhǎng)基本停止時(shí)測(cè)量株高。每個(gè)株系取5個(gè)植株進(jìn)行測(cè)量，每株植株測(cè)量3片葉片，下同。
1.2.4 葉綠素含量的測(cè)定 選取與測(cè)量生長(zhǎng)指標(biāo)相同位置和發(fā)育階段（生殖生長(zhǎng)階段，下同）的野生型及轉(zhuǎn)基因葉片，稱(chēng)取0.05 g，采用無(wú)水乙醇與無(wú)水丙酮1∶1混合液浸提法，利用分光光度計(jì)測(cè)定663 nm、646 nm和470 nm下的OD值，根據(jù)公式求出葉綠素的含量。計(jì)算公式：葉綠素a含量（mg/g）=（12.21 A663- 2.81 A646）·Vt/ 1 000W；葉綠素b含量（mg/g）=（20.13 A646- 5.03A663）·Vt/ 1 000 W ；葉綠素總量（mg/g）= 葉綠素a含量 + 葉綠素b含量。其中，A663、A646分別為葉綠素溶液在波長(zhǎng)663和646 nm時(shí)的吸光度；Vt是總提取液體積，為10 mL；W為葉片重量，即0.05g。
1.2.5 光合指標(biāo)及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定 用CIRAS-3（PP-system，英國(guó)）便攜式光合儀進(jìn)行葉片光合指標(biāo)的測(cè)定。測(cè)定時(shí)，設(shè)置光合有效輻射強(qiáng)度為80 μmol·m-2·s-1，與培養(yǎng)箱內(nèi)光照基本一致，控制葉室溫度為25℃，CO2濃度為420-450 μmol/mol，相對(duì)濕度為（50±10）%，記錄凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（gs）等光合生理參數(shù)。
使用Handy PEA（Hansatech，英國(guó)）進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定。將葉片平展夾在熒光夾4 mm2的暗測(cè)試孔中，暗反應(yīng)20 min后進(jìn)行測(cè)定，獲得OJIP熒光誘導(dǎo)曲線(xiàn)及初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、可變熒光（Fv）、PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、及性能指數(shù)（PI）等一系列參數(shù)。
1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2010和SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素（one-way ANOVA）和Duncan法進(jìn)行方差分析和多重比較（α=0.05），Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析。圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
2 結(jié)果
2.1 春蘭miR396在不同葉發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)
采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)春蘭營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的幼嫩葉片、成熟葉片，以及花期成熟葉片中miR396基因的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果（圖1）顯示該基因在花期葉片中表達(dá)量最高，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期葉片的表達(dá)量均較低。
圖1 春蘭miR396在不同葉發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression of cgo-miR396 in different leaf development stages
2.2 春蘭miR396過(guò)表達(dá)株系的檢測(cè)
過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建完成并通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥中后，以含Kana抗生素的MS培養(yǎng)基對(duì)三代轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行陽(yáng)性篩選，得到純合的T3代陽(yáng)性株系，然后以植物基因組DNA為模板，利用來(lái)自35S啟動(dòng)子和MIR396的篩選引物初步鑒定轉(zhuǎn)基因株系（圖2）。結(jié)果表明，MIR396基因已成功轉(zhuǎn)入擬南芥植株中。
2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥形態(tài)指標(biāo)的變化
從MS培養(yǎng)基移至土壤中第20天，植株尚未抽莖開(kāi)花時(shí)，對(duì)野生型Col和過(guò)表達(dá)miR396擬南芥幼苗植株的冠幅、葉片數(shù)、葉長(zhǎng)和葉寬進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的某些形態(tài)指標(biāo)雖相較野生型（WT）有小幅度的增加，但總體來(lái)看，二者之間尚未出現(xiàn)明顯差異（圖3）。
圖2 過(guò)表達(dá)株系DNA檢測(cè)Fig.2 DNA detection of overexpressed line
而在植株處于生殖生長(zhǎng)階段時(shí)的觀測(cè)結(jié)果則表明，miR396過(guò)表達(dá)后，擬南芥株高增加，葉面積、葉長(zhǎng)和葉寬乃至基生葉片數(shù)目均增大（圖4），而莖生葉片數(shù)目未發(fā)現(xiàn)明顯的改變。在這些形態(tài)指標(biāo)中，葉面積的變化最為明顯，經(jīng)測(cè)量的野生型擬南芥平均葉面積為330.57 mm2，而不同的轉(zhuǎn)基因株系Line1、Line 2、Line3和Line4的平均葉面積分別為558.35、527.45、533.24和600.31 mm2，均與野生型的該項(xiàng)指標(biāo)呈現(xiàn)顯著性變化。
2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥葉綠素含量的變化
圖3 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期形態(tài)指標(biāo)觀測(cè)（Bar=1 cm）Fig.3 Morphological index observation during vegetative growth period
MIR396過(guò)表達(dá)顯著降低了葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量，其中與野生型對(duì)照相比，Line1到Line4株系葉綠素總量分別下降了27.79%、29.11%、27.66%、16.50%，在Line2株系處出現(xiàn)最小值，而葉綠素a與b的比值未發(fā)生明顯變化（表1）。
2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥光合指標(biāo)的變化
圖5顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥的凈光合速率（Pn）較野生型高出8.50%-19.52%，但尚未構(gòu)成顯著差異。而從氣孔導(dǎo)度（gs）和蒸騰速率（Tr）兩個(gè)指標(biāo)來(lái)看，各轉(zhuǎn)基因株系間未發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別，但均顯著低于野生型，氣孔導(dǎo)度下降幅度最大，在Line2株系處出現(xiàn)最小值，比野生型下降了74.8%；蒸騰速率則在Line1處出現(xiàn)最小值，平均值比野生型低46.75%。與之不同的是，隨著氣孔導(dǎo)度的減小，在過(guò)表達(dá)植株與對(duì)照的胞間二氧化碳濃度（Ci）的比較中，只Line2株系顯著低于野生型，但僅下降了9.58%。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，MIR396過(guò)表達(dá)后，葉片的水分利用效率（WUE）增大，在Line1與Line2株系處呈現(xiàn)顯著差異。
2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化
由表2可知，野生型與各轉(zhuǎn)基因株系間的葉綠素?zé)晒鈪?shù)雖略有差異，如Line2和Line3株系的PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、PSⅡ的潛在光化學(xué)效率（Fv/Fo）相對(duì)較低，但均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著水平，表明過(guò)表達(dá)CgMIR396后，擬南芥葉片的捕光及光能轉(zhuǎn)化能力未發(fā)生明顯變化。
圖4 生殖生長(zhǎng)期形態(tài)指標(biāo)觀測(cè)（Bar=1 cm）Fig.4 Morphological index observation during reproductive growth period
表1 葉綠素含量的測(cè)定Table 1 Determination of chlorophyll content
圖5 葉片光合指標(biāo)的測(cè)定Fig.5 Determination of photosynthetic indexes in leaves
表2 快速葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定Table 2 Rapid determination of chlorophyll fluorescence parameters
2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片能量分配比率的變化
擬南芥轉(zhuǎn)基因后量子產(chǎn)額和能量分配比率的變化趨勢(shì)，如圖6所示，其暗適應(yīng)后的最大光化學(xué)效率（φPo）并未發(fā)生較大變化；而在反應(yīng)中心捕獲的激子中，用來(lái)推動(dòng)電子傳遞到電子傳遞鏈中超過(guò)QA的其他電子受體的激子占用來(lái)推動(dòng)QA還原激子的比率（ψo(hù)）在轉(zhuǎn)基因后略有減小，其中Line2株系與野生型呈現(xiàn)顯著差異，即照光2 ms時(shí)有活性的反應(yīng)中心開(kāi)放程度顯著變小；另外，Line2與Line3株系反應(yīng)中心吸收的光能用于電子傳遞的量子產(chǎn)額（φEo）也顯著降低，下降比例分別為10.01%和8.29%。
圖6 葉片量子產(chǎn)額和能量分配比率的變化Fig.6 Variations of leaf quantum yield and energy distribution ratio
2.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥PS Ⅱ反應(yīng)中心活性參數(shù)的變化
通過(guò)對(duì)光合機(jī)構(gòu)比活性的分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系在單位反應(yīng)中心吸收的光能（ABS/RC）及耗散掉的能量（DIo/RC，在t=0時(shí)）僅在Line3株系處出現(xiàn)較明顯的變化，分別高出野生型6.25%和14.45%；但單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA的能量（TRo/RC，在t=0時(shí)）和用于電子傳遞的能量（ETo/RC，在t=0時(shí)）未發(fā)生明顯變化（圖7）。
圖7 葉片比活性參數(shù)的變化Fig.7 Variations of specific activity parameters in leaves
2.9 轉(zhuǎn)基因擬南芥性能指數(shù)及推動(dòng)力的變化
以吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)（PIABS）和推動(dòng)力（DFABS）能夠更為準(zhǔn)確地反映植物葉片光合機(jī)構(gòu)的狀態(tài)，在圖8中可以看出，轉(zhuǎn)基因株系的PIABS及DFABS均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中在DFABS中反應(yīng)的變化更為明顯，Line1到Line4株系分別較野生型下降了18.06%、60.22%、54.95%和7.18%，在Line2和Line3處呈現(xiàn)顯著差異，并在Line2株系處達(dá)到最小值。
圖8 葉片性能指數(shù)及推動(dòng)力的變化Fig.8 Variations of performance index and driving force
2.10 轉(zhuǎn)基因擬南芥形態(tài)、光合及葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)的相關(guān)性分析
傳統(tǒng)Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，擬南芥葉面積、葉長(zhǎng)和葉寬之間的相關(guān)性呈現(xiàn)極顯著水平，這三者均與氣孔導(dǎo)度（gs）之間呈顯著相關(guān)；胞間二氧化碳濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（gs）和水分利用效率（WUE）三者之間也達(dá)到極顯著相關(guān)水平，凈光合速率（Pn）則與其他光合指標(biāo)間無(wú)明顯相關(guān)性；而葉綠素?zé)晒飧黜?xiàng)指標(biāo)之間大多均存在一定的相關(guān)性，尤其是快速熒光參數(shù)Fo、Fm與Fv及其比值，與DIo/RC、φPo、φEo、PIABS、DFABS之間多數(shù)達(dá)到顯著相關(guān)甚至極顯著相關(guān)（表3）。
3 討論
miR396及其靶基因GRF對(duì)植物各組織器官的發(fā)育都具有顯著的調(diào)控作用，尤其以控制葉片發(fā)育方面的研究居多［5］。目前的研究結(jié)果表明，該模塊主要是通過(guò)控制細(xì)胞增殖來(lái)調(diào)節(jié)葉細(xì)胞形態(tài)乃至葉片的表觀形態(tài)。本研究中發(fā)現(xiàn)，春蘭miR396基因在擬南芥中的過(guò)量表達(dá)能夠促進(jìn)生殖生長(zhǎng)時(shí)期的葉片生長(zhǎng)、降低葉綠素含量，進(jìn)而影響其光合、葉綠素?zé)晒獾纫幌盗袇?shù)的變化。
表3各單項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)矩陣Table 3 Correlation coefficient matrix of each single index
在對(duì)葉片形態(tài)的觀測(cè)中，cgo-miR396基因過(guò)表達(dá)株系的葉片發(fā)育受到促進(jìn)，呈現(xiàn)出與擬南芥、番茄、歐洲油菜等雙子葉植物在miR396-GRF模塊中不一致的研究趨勢(shì)；但Wu等［7］在玉米中對(duì)ZmGRF10的研究結(jié)果則表明，該基因的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致了玉米葉面積和株高的減小，這與本研究的結(jié)果較為相似。通過(guò)前期對(duì)春蘭miR396的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其與高粱、甘蔗等單子葉植物的同源性最高，因此，單雙子葉植物之間基因功能的差異，以及蘭科植物自身的特異性，均暗示著該作用模塊可能發(fā)揮的特殊功能。
光合作用是植物最為重要的物質(zhì)和能量來(lái)源，春蘭作為一種重要的觀賞和藥用植物，探究光合作用不僅能夠更好的保障其生長(zhǎng)和發(fā)育所需的優(yōu)質(zhì)物質(zhì)來(lái)源，還可對(duì)其栽培所需環(huán)境、葉片形態(tài)發(fā)育及觀賞價(jià)值等方面的研究提供指導(dǎo)。在本研究中，隨著轉(zhuǎn)基因植株葉片面積和長(zhǎng)寬的增加，葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量均呈下降趨勢(shì)。從前人的分析來(lái)看，miR396導(dǎo)致葉片增大的主要原因是由于細(xì)胞增殖導(dǎo)致葉細(xì)胞數(shù)目的增多或體積的增大［8-9］，本研究結(jié)果可能與周厚君等［10］的研究結(jié)果相似，即miR396導(dǎo)致了細(xì)胞體積的擴(kuò)張，且可能并未增加葉綠體的數(shù)目，從而使得葉綠素分布較為分散，單位重量的葉綠素含量明顯下降、且葉綠素a/b的比值保持不變。從光合指標(biāo)來(lái)看，相較野生型來(lái)說(shuō)，cgo-miR396的過(guò)表達(dá)雖導(dǎo)致氣孔導(dǎo)度顯著下降，乃至蒸騰速率降低，但其Ci指標(biāo)表明其用于光合作用的CO2仍能達(dá)到飽和狀態(tài)，水分利用效率也上升，最終使凈光合效率呈上升趨勢(shì)，促進(jìn)了擬南芥的生長(zhǎng)。另外，本研究中光合各項(xiàng)指標(biāo)的組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，參考張治平等［11］對(duì)于煙草轉(zhuǎn)基因葉片光合作用的研究來(lái)看，不同葉位間光合指標(biāo)的差異，是導(dǎo)致該因素產(chǎn)生的主要原因。
本研究的4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系相較野生型來(lái)看，雖PSⅡ最大光化學(xué)效率及潛在光化學(xué)效率等葉綠素?zé)晒鈪?shù)未發(fā)生顯著變化，但Appenroth等［12］和Heerden等［13］的研究表明，性能指數(shù)和推動(dòng)力能夠更準(zhǔn)確的反映植物光合機(jī)構(gòu)的狀態(tài)，通過(guò)圖8中對(duì)二者的分析來(lái)看，miR396的過(guò)表達(dá)很可能對(duì)擬南芥葉片的光合機(jī)構(gòu)造成了一定程度的破壞，尤其體現(xiàn)在Line2與Line3株系中。且對(duì)量子產(chǎn)額和能量分配比率的分析也表明，轉(zhuǎn)基因株系的能量在PSII反應(yīng)中心中的分配比率發(fā)生了變化，照光2ms時(shí)有活性反應(yīng)中心的開(kāi)放程度也相應(yīng)減小，說(shuō)明PSⅡ受體側(cè)發(fā)生了改變［14］。
最后，通過(guò)對(duì)這24個(gè)指標(biāo)進(jìn)行的Pearson相關(guān)性分析來(lái)看，各指標(biāo)間均存在一定的相關(guān)性，一些指標(biāo)間呈現(xiàn)顯著相關(guān)，有的甚至達(dá)到極顯著相關(guān)。從形態(tài)指標(biāo)來(lái)看，葉面積與葉長(zhǎng)、葉寬均呈極顯著相關(guān)，且與葉寬的相關(guān)性更高，表明miR396主要是通過(guò)增大葉寬來(lái)增大葉片大?。贿@三者也與氣孔導(dǎo)度（gs）呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，結(jié)合上述分析來(lái)看，推測(cè)葉片細(xì)胞的增殖或許導(dǎo)致了氣孔數(shù)目的增多，但因光合所需CO2已達(dá)飽和狀態(tài)，因此氣孔開(kāi)合程度遵循自主調(diào)節(jié)機(jī)制而顯著下降，在后續(xù)研究中可對(duì)葉片表皮結(jié)構(gòu)進(jìn)一步觀察以得出結(jié)論。各光合指標(biāo)分析表明，凈光合速率與其他因素并無(wú)顯著相關(guān)性，表明葉面積、氣孔及水分可能不是影響光合速率的主要原因，因此在這些轉(zhuǎn)基因植株中，葉片中各種光合酶的活性或其他內(nèi)部因子可能已經(jīng)發(fā)生了改變。另外，雖然葉綠素與類(lèi)胡蘿卜素是植物吸收光能的基礎(chǔ)，但相關(guān)性分析表明，葉綠素與光合能力的變化也并不存在正相關(guān)，這與葉子飄等［15］的研究結(jié)果一致，說(shuō)明植物電子傳遞的速率不僅與葉綠素含量有關(guān)，還與捕光色素分子的特性，如光能吸收截面、激子傳遞效率等密切相關(guān)［16］。
4 結(jié)論
春蘭miR396的過(guò)表達(dá)對(duì)擬南芥生殖生長(zhǎng)時(shí)期葉片生長(zhǎng)發(fā)育的形態(tài)指標(biāo)和光合指標(biāo)均產(chǎn)生了一定的影響，與前人在雙子葉植物中的研究存在較大差異，并在此基礎(chǔ)上對(duì)其葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行了分析發(fā)現(xiàn)，該基因在保證植物凈光合效率、促進(jìn)葉片生長(zhǎng)的同時(shí)，適當(dāng)降低了植物葉片的氣孔導(dǎo)度及PSII受體側(cè)的部分性能。
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