徐子涵 劉倩 苗大鵬 陳躍 胡鳳榮
(1.南京林業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院,南京 210037;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所,杭州 310021)
葉片是植物最重要的器官之一,同時(shí)也是植物進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所,葉片的形態(tài)、大小、數(shù)目均在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。在現(xiàn)代的分子育種研究中,模式植物具有生長(zhǎng)迅速、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、表型明顯等眾多優(yōu)點(diǎn),從中獲取葉片發(fā)育特性的定量信息較為容易[1],對(duì)植物發(fā)育研究具有一定的實(shí)際意義。春蘭(Cymbidium goeringii)是蘭科(Orchidaceae)蘭屬的一類(lèi)地生蘭,是國(guó)蘭中最具代表性的品種之一,其葉線(xiàn)條優(yōu)美,花朵素雅、花型各異,兼具觀賞和藥用價(jià)值[2]。目前對(duì)于國(guó)蘭的研究主要集中于形態(tài)觀察、生理生化和組織培養(yǎng)方面,對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的分子研究較少,且包括春蘭在內(nèi)的蘭科植物基本全為喜陰植物,栽培養(yǎng)護(hù)較為困難。因此,通過(guò)模式植物研究春蘭葉片發(fā)育及光合特性的分子調(diào)控機(jī)理,對(duì)探究其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和品質(zhì)形成十分必要。
miR396是植物體內(nèi)的一類(lèi)保守的miRNA,與植物生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān),其主要靶向一類(lèi)重要的生長(zhǎng)調(diào)控因子(growth-regulating factor,GRF),在擬南芥、水稻、玉米等不同物種中均發(fā)現(xiàn)其保守序列的存在[3-4]。已有眾多研究發(fā)現(xiàn),miR396通過(guò)調(diào)控GRF轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)葉片、莖、種子和心皮等組織和器官的生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮著重要的作用,尤其對(duì)葉片的研究報(bào)道居多,參與調(diào)控葉片的大小、細(xì)胞增殖、葉片衰老、葉綠素合成及光合作用等一系列過(guò)程[5-6]。但目前來(lái)看,miR396在蘭科植物中的研究極少,其對(duì)蘭科植物葉片發(fā)育和其他性能的影響也尚不清楚。鑒于此,本研究將春蘭miR396基因前體cgo-MIR396在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中過(guò)表達(dá),觀察其葉片的生長(zhǎng)表型變化及其光合相關(guān)指標(biāo)的響應(yīng),結(jié)合對(duì)其在生長(zhǎng)不同時(shí)期表達(dá)模式的分析,為春蘭的栽培應(yīng)用及優(yōu)良品種選育提供科學(xué)依據(jù)。
試驗(yàn)所用春蘭“宋梅”種植于浙江省農(nóng)科院園藝所蘭花組實(shí)驗(yàn)室,選擇生長(zhǎng)健壯的品種“宋梅”植株,分別剪取營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期和生殖生長(zhǎng)期兩個(gè)階段的葉片,用于分析miR396在不同葉發(fā)育時(shí)期的特異性表達(dá),并進(jìn)行其前體基因的克隆和超表達(dá)載體構(gòu)建。材料取好后裝入已標(biāo)記的干凈離心管中,立即置于液氮中,隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。
轉(zhuǎn)基因所用擬南芥為本實(shí)驗(yàn)室自存的野生型哥倫比亞(Columbia,Col),在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培育,生長(zhǎng)條件為:溫度(22±1)℃,濕度70%,光周期16 h光照/8 h黑暗,光照強(qiáng)度6 000-8 000 lx。
1.2.1 基因表達(dá)量的測(cè)定 將春蘭營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的幼葉、成熟葉及生殖生長(zhǎng)時(shí)期的成熟葉片在液氮中研磨成粉末,用MiniBEST Universal RNA提取試劑盒(TaKaRa,上海)提取各樣本的Total Small RNA,再以800 ng上述各樣品的RNA為模板,用HiScriptⅢ 1stStrand cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾維贊,南京)莖環(huán)法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到miR396成熟體cDNA第一鏈,反轉(zhuǎn)錄引物為:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGT CCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTTCA-3′。以該cDNA為模板,用ChamQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(諾維贊,南京)進(jìn)行反應(yīng)溶液的配制,在Applied Biosystems 型實(shí)時(shí)熒光定量分析儀上運(yùn)行PCR程序,以檢測(cè)春蘭miR396在不同生長(zhǎng)時(shí)期葉片中的表達(dá)量。根據(jù)基因序列,用miRNA Design軟件(諾維贊,南京)設(shè)計(jì)引物,上游引物 :5′-GCGCGTTCCACAGCTTTCT-3′,下游引物 :5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′,反應(yīng)條件 :95℃ 5 min;95℃ 10 s,60℃ 30 s,循環(huán) 40 次 ;95℃15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束通過(guò)StepOne Software v2.3導(dǎo)出數(shù)據(jù),以春蘭18S基因?yàn)閮?nèi)參,根據(jù)CT值用2-△△Cq相對(duì)定量法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)時(shí)期的葉片設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù),3次技術(shù)重復(fù)。
1.2.2 基因轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因株系篩選 將春蘭葉片用液氮研磨呈粉末,用MiniBEST Plant Genomic DNA提取試劑盒(TaKaRa,上海)提取gDNA,以其為模板克隆得到miR396前體cgo-MIR396的全長(zhǎng),連接pBI121植物表達(dá)載體,測(cè)序成功后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101(酶普利斯,南京)。將含有重組質(zhì)粒pBI121- MIR396的農(nóng)桿菌,對(duì)野生型擬南芥Col(WT)進(jìn)行轉(zhuǎn)化,記為T(mén)0代,待其種子成熟收取后,均勻播種在含卡那霉素的MS培養(yǎng)基上,篩選得到T1代轉(zhuǎn)基因植株,待小苗長(zhǎng)出4片真葉后移栽入盆土(營(yíng)養(yǎng)土與育苗基質(zhì)1∶1混合)中繼續(xù)培養(yǎng),單株收取種子,繼續(xù)進(jìn)行抗性篩選,直至獲得T3代轉(zhuǎn)基因純合株系。
1.2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥檢測(cè)及形態(tài)指標(biāo)測(cè)定 選取生長(zhǎng)時(shí)期相同的擬南芥野生型Col及篩選得到的miR396過(guò)表達(dá)植株,取其移栽后狀態(tài)穩(wěn)定植株的葉片組織剪碎,采用2×T5 Direct PCR試劑盒(擎科,南京)的加熱裂解法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因擬南芥的DNA鑒定。另外選取生長(zhǎng)時(shí)期一致的轉(zhuǎn)基因與野生型植株,分別在移栽后第20天和40天時(shí)統(tǒng)計(jì)葉片數(shù)目,并測(cè)量位于相同部位的葉片長(zhǎng)度、寬度、葉面積、葉片數(shù)目等,第60天高度生長(zhǎng)基本停止時(shí)測(cè)量株高。每個(gè)株系取5個(gè)植株進(jìn)行測(cè)量,每株植株測(cè)量3片葉片,下同。
1.2.4 葉綠素含量的測(cè)定 選取與測(cè)量生長(zhǎng)指標(biāo)相同位置和發(fā)育階段(生殖生長(zhǎng)階段,下同)的野生型及轉(zhuǎn)基因葉片,稱(chēng)取0.05 g,采用無(wú)水乙醇與無(wú)水丙酮1∶1混合液浸提法,利用分光光度計(jì)測(cè)定663 nm、646 nm和470 nm下的OD值,根據(jù)公式求出葉綠素的含量。計(jì)算公式:葉綠素a含量(mg/g)=(12.21 A663- 2.81 A646)·Vt/ 1 000W;葉綠素b含量(mg/g)=(20.13 A646- 5.03A663)·Vt/ 1 000 W ;葉綠素總量(mg/g)= 葉綠素a含量 + 葉綠素b含量。其中,A663、A646分別為葉綠素溶液在波長(zhǎng)663和646 nm時(shí)的吸光度;Vt是總提取液體積,為10 mL;W為葉片重量,即0.05g。
1.2.5 光合指標(biāo)及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定 用CIRAS-3(PP-system,英國(guó))便攜式光合儀進(jìn)行葉片光合指標(biāo)的測(cè)定。測(cè)定時(shí),設(shè)置光合有效輻射強(qiáng)度為80 μmol·m-2·s-1,與培養(yǎng)箱內(nèi)光照基本一致,控制葉室溫度為25℃,CO2濃度為420-450 μmol/mol,相對(duì)濕度為(50±10)%,記錄凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(gs)等光合生理參數(shù)。
使用Handy PEA(Hansatech,英國(guó))進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定。將葉片平展夾在熒光夾4 mm2的暗測(cè)試孔中,暗反應(yīng)20 min后進(jìn)行測(cè)定,獲得OJIP熒光誘導(dǎo)曲線(xiàn)及初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)、可變熒光(Fv)、PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、及性能指數(shù)(PI)等一系列參數(shù)。
1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2010和SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素(one-way ANOVA)和Duncan法進(jìn)行方差分析和多重比較(α=0.05),Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析。圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)春蘭營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的幼嫩葉片、成熟葉片,以及花期成熟葉片中miR396基因的表達(dá)進(jìn)行分析,結(jié)果(圖1)顯示該基因在花期葉片中表達(dá)量最高,營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期葉片的表達(dá)量均較低。
圖1 春蘭miR396在不同葉發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression of cgo-miR396 in different leaf development stages
過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建完成并通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥中后,以含Kana抗生素的MS培養(yǎng)基對(duì)三代轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行陽(yáng)性篩選,得到純合的T3代陽(yáng)性株系,然后以植物基因組DNA為模板,利用來(lái)自35S啟動(dòng)子和MIR396的篩選引物初步鑒定轉(zhuǎn)基因株系(圖2)。結(jié)果表明,MIR396基因已成功轉(zhuǎn)入擬南芥植株中。
從MS培養(yǎng)基移至土壤中第20天,植株尚未抽莖開(kāi)花時(shí),對(duì)野生型Col和過(guò)表達(dá)miR396擬南芥幼苗植株的冠幅、葉片數(shù)、葉長(zhǎng)和葉寬進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因植株的某些形態(tài)指標(biāo)雖相較野生型(WT)有小幅度的增加,但總體來(lái)看,二者之間尚未出現(xiàn)明顯差異(圖3)。
圖2 過(guò)表達(dá)株系DNA檢測(cè)Fig.2 DNA detection of overexpressed line
而在植株處于生殖生長(zhǎng)階段時(shí)的觀測(cè)結(jié)果則表明,miR396過(guò)表達(dá)后,擬南芥株高增加,葉面積、葉長(zhǎng)和葉寬乃至基生葉片數(shù)目均增大(圖4),而莖生葉片數(shù)目未發(fā)現(xiàn)明顯的改變。在這些形態(tài)指標(biāo)中,葉面積的變化最為明顯,經(jīng)測(cè)量的野生型擬南芥平均葉面積為330.57 mm2,而不同的轉(zhuǎn)基因株系Line1、Line 2、Line3和Line4的平均葉面積分別為558.35、527.45、533.24和600.31 mm2,均與野生型的該項(xiàng)指標(biāo)呈現(xiàn)顯著性變化。
圖3 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期形態(tài)指標(biāo)觀測(cè)(Bar=1 cm)Fig.3 Morphological index observation during vegetative growth period
MIR396過(guò)表達(dá)顯著降低了葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量,其中與野生型對(duì)照相比,Line1到Line4株系葉綠素總量分別下降了27.79%、29.11%、27.66%、16.50%,在Line2株系處出現(xiàn)最小值,而葉綠素a與b的比值未發(fā)生明顯變化(表1)。
圖5顯示,轉(zhuǎn)基因擬南芥的凈光合速率(Pn)較野生型高出8.50%-19.52%,但尚未構(gòu)成顯著差異。而從氣孔導(dǎo)度(gs)和蒸騰速率(Tr)兩個(gè)指標(biāo)來(lái)看,各轉(zhuǎn)基因株系間未發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別,但均顯著低于野生型,氣孔導(dǎo)度下降幅度最大,在Line2株系處出現(xiàn)最小值,比野生型下降了74.8%;蒸騰速率則在Line1處出現(xiàn)最小值,平均值比野生型低46.75%。與之不同的是,隨著氣孔導(dǎo)度的減小,在過(guò)表達(dá)植株與對(duì)照的胞間二氧化碳濃度(Ci)的比較中,只Line2株系顯著低于野生型,但僅下降了9.58%。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),MIR396過(guò)表達(dá)后,葉片的水分利用效率(WUE)增大,在Line1與Line2株系處呈現(xiàn)顯著差異。
由表2可知,野生型與各轉(zhuǎn)基因株系間的葉綠素?zé)晒鈪?shù)雖略有差異,如Line2和Line3株系的PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、PSⅡ的潛在光化學(xué)效率(Fv/Fo)相對(duì)較低,但均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著水平,表明過(guò)表達(dá)CgMIR396后,擬南芥葉片的捕光及光能轉(zhuǎn)化能力未發(fā)生明顯變化。
圖4 生殖生長(zhǎng)期形態(tài)指標(biāo)觀測(cè)(Bar=1 cm)Fig.4 Morphological index observation during reproductive growth period
表1 葉綠素含量的測(cè)定Table 1 Determination of chlorophyll content
圖5 葉片光合指標(biāo)的測(cè)定Fig.5 Determination of photosynthetic indexes in leaves
表2 快速葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定Table 2 Rapid determination of chlorophyll fluorescence parameters
擬南芥轉(zhuǎn)基因后量子產(chǎn)額和能量分配比率的變化趨勢(shì),如圖6所示,其暗適應(yīng)后的最大光化學(xué)效率(φPo)并未發(fā)生較大變化;而在反應(yīng)中心捕獲的激子中,用來(lái)推動(dòng)電子傳遞到電子傳遞鏈中超過(guò)QA的其他電子受體的激子占用來(lái)推動(dòng)QA還原激子的比率(ψo(hù))在轉(zhuǎn)基因后略有減小,其中Line2株系與野生型呈現(xiàn)顯著差異,即照光2 ms時(shí)有活性的反應(yīng)中心開(kāi)放程度顯著變小;另外,Line2與Line3株系反應(yīng)中心吸收的光能用于電子傳遞的量子產(chǎn)額(φEo)也顯著降低,下降比例分別為10.01%和8.29%。
圖6 葉片量子產(chǎn)額和能量分配比率的變化Fig.6 Variations of leaf quantum yield and energy distribution ratio
通過(guò)對(duì)光合機(jī)構(gòu)比活性的分析發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因株系在單位反應(yīng)中心吸收的光能(ABS/RC)及耗散掉的能量(DIo/RC,在t=0時(shí))僅在Line3株系處出現(xiàn)較明顯的變化,分別高出野生型6.25%和14.45%;但單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA的能量(TRo/RC,在t=0時(shí))和用于電子傳遞的能量(ETo/RC,在t=0時(shí))未發(fā)生明顯變化(圖7)。
圖7 葉片比活性參數(shù)的變化Fig.7 Variations of specific activity parameters in leaves
以吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)(PIABS)和推動(dòng)力(DFABS)能夠更為準(zhǔn)確地反映植物葉片光合機(jī)構(gòu)的狀態(tài),在圖8中可以看出,轉(zhuǎn)基因株系的PIABS及DFABS均呈現(xiàn)下降趨勢(shì),其中在DFABS中反應(yīng)的變化更為明顯,Line1到Line4株系分別較野生型下降了18.06%、60.22%、54.95%和7.18%,在Line2和Line3處呈現(xiàn)顯著差異,并在Line2株系處達(dá)到最小值。
圖8 葉片性能指數(shù)及推動(dòng)力的變化Fig.8 Variations of performance index and driving force
傳統(tǒng)Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,擬南芥葉面積、葉長(zhǎng)和葉寬之間的相關(guān)性呈現(xiàn)極顯著水平,這三者均與氣孔導(dǎo)度(gs)之間呈顯著相關(guān);胞間二氧化碳濃度(Ci)、氣孔導(dǎo)度(gs)和水分利用效率(WUE)三者之間也達(dá)到極顯著相關(guān)水平,凈光合速率(Pn)則與其他光合指標(biāo)間無(wú)明顯相關(guān)性;而葉綠素?zé)晒飧黜?xiàng)指標(biāo)之間大多均存在一定的相關(guān)性,尤其是快速熒光參數(shù)Fo、Fm與Fv及其比值,與DIo/RC、φPo、φEo、PIABS、DFABS之間多數(shù)達(dá)到顯著相關(guān)甚至極顯著相關(guān)(表3)。
miR396及其靶基因GRF對(duì)植物各組織器官的發(fā)育都具有顯著的調(diào)控作用,尤其以控制葉片發(fā)育方面的研究居多[5]。目前的研究結(jié)果表明,該模塊主要是通過(guò)控制細(xì)胞增殖來(lái)調(diào)節(jié)葉細(xì)胞形態(tài)乃至葉片的表觀形態(tài)。本研究中發(fā)現(xiàn),春蘭miR396基因在擬南芥中的過(guò)量表達(dá)能夠促進(jìn)生殖生長(zhǎng)時(shí)期的葉片生長(zhǎng)、降低葉綠素含量,進(jìn)而影響其光合、葉綠素?zé)晒獾纫幌盗袇?shù)的變化。
表3各單項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)矩陣Table 3 Correlation coefficient matrix of each single index
在對(duì)葉片形態(tài)的觀測(cè)中,cgo-miR396基因過(guò)表達(dá)株系的葉片發(fā)育受到促進(jìn),呈現(xiàn)出與擬南芥、番茄、歐洲油菜等雙子葉植物在miR396-GRF模塊中不一致的研究趨勢(shì);但Wu等[7]在玉米中對(duì)ZmGRF10的研究結(jié)果則表明,該基因的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致了玉米葉面積和株高的減小,這與本研究的結(jié)果較為相似。通過(guò)前期對(duì)春蘭miR396的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),其與高粱、甘蔗等單子葉植物的同源性最高,因此,單雙子葉植物之間基因功能的差異,以及蘭科植物自身的特異性,均暗示著該作用模塊可能發(fā)揮的特殊功能。
光合作用是植物最為重要的物質(zhì)和能量來(lái)源,春蘭作為一種重要的觀賞和藥用植物,探究光合作用不僅能夠更好的保障其生長(zhǎng)和發(fā)育所需的優(yōu)質(zhì)物質(zhì)來(lái)源,還可對(duì)其栽培所需環(huán)境、葉片形態(tài)發(fā)育及觀賞價(jià)值等方面的研究提供指導(dǎo)。在本研究中,隨著轉(zhuǎn)基因植株葉片面積和長(zhǎng)寬的增加,葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量均呈下降趨勢(shì)。從前人的分析來(lái)看,miR396導(dǎo)致葉片增大的主要原因是由于細(xì)胞增殖導(dǎo)致葉細(xì)胞數(shù)目的增多或體積的增大[8-9],本研究結(jié)果可能與周厚君等[10]的研究結(jié)果相似,即miR396導(dǎo)致了細(xì)胞體積的擴(kuò)張,且可能并未增加葉綠體的數(shù)目,從而使得葉綠素分布較為分散,單位重量的葉綠素含量明顯下降、且葉綠素a/b的比值保持不變。從光合指標(biāo)來(lái)看,相較野生型來(lái)說(shuō),cgo-miR396的過(guò)表達(dá)雖導(dǎo)致氣孔導(dǎo)度顯著下降,乃至蒸騰速率降低,但其Ci指標(biāo)表明其用于光合作用的CO2仍能達(dá)到飽和狀態(tài),水分利用效率也上升,最終使凈光合效率呈上升趨勢(shì),促進(jìn)了擬南芥的生長(zhǎng)。另外,本研究中光合各項(xiàng)指標(biāo)的組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大,參考張治平等[11]對(duì)于煙草轉(zhuǎn)基因葉片光合作用的研究來(lái)看,不同葉位間光合指標(biāo)的差異,是導(dǎo)致該因素產(chǎn)生的主要原因。
本研究的4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系相較野生型來(lái)看,雖PSⅡ最大光化學(xué)效率及潛在光化學(xué)效率等葉綠素?zé)晒鈪?shù)未發(fā)生顯著變化,但Appenroth等[12]和Heerden等[13]的研究表明,性能指數(shù)和推動(dòng)力能夠更準(zhǔn)確的反映植物光合機(jī)構(gòu)的狀態(tài),通過(guò)圖8中對(duì)二者的分析來(lái)看,miR396的過(guò)表達(dá)很可能對(duì)擬南芥葉片的光合機(jī)構(gòu)造成了一定程度的破壞,尤其體現(xiàn)在Line2與Line3株系中。且對(duì)量子產(chǎn)額和能量分配比率的分析也表明,轉(zhuǎn)基因株系的能量在PSII反應(yīng)中心中的分配比率發(fā)生了變化,照光2ms時(shí)有活性反應(yīng)中心的開(kāi)放程度也相應(yīng)減小,說(shuō)明PSⅡ受體側(cè)發(fā)生了改變[14]。
最后,通過(guò)對(duì)這24個(gè)指標(biāo)進(jìn)行的Pearson相關(guān)性分析來(lái)看,各指標(biāo)間均存在一定的相關(guān)性,一些指標(biāo)間呈現(xiàn)顯著相關(guān),有的甚至達(dá)到極顯著相關(guān)。從形態(tài)指標(biāo)來(lái)看,葉面積與葉長(zhǎng)、葉寬均呈極顯著相關(guān),且與葉寬的相關(guān)性更高,表明miR396主要是通過(guò)增大葉寬來(lái)增大葉片大?。贿@三者也與氣孔導(dǎo)度(gs)呈現(xiàn)一定的相關(guān)性,結(jié)合上述分析來(lái)看,推測(cè)葉片細(xì)胞的增殖或許導(dǎo)致了氣孔數(shù)目的增多,但因光合所需CO2已達(dá)飽和狀態(tài),因此氣孔開(kāi)合程度遵循自主調(diào)節(jié)機(jī)制而顯著下降,在后續(xù)研究中可對(duì)葉片表皮結(jié)構(gòu)進(jìn)一步觀察以得出結(jié)論。各光合指標(biāo)分析表明,凈光合速率與其他因素并無(wú)顯著相關(guān)性,表明葉面積、氣孔及水分可能不是影響光合速率的主要原因,因此在這些轉(zhuǎn)基因植株中,葉片中各種光合酶的活性或其他內(nèi)部因子可能已經(jīng)發(fā)生了改變。另外,雖然葉綠素與類(lèi)胡蘿卜素是植物吸收光能的基礎(chǔ),但相關(guān)性分析表明,葉綠素與光合能力的變化也并不存在正相關(guān),這與葉子飄等[15]的研究結(jié)果一致,說(shuō)明植物電子傳遞的速率不僅與葉綠素含量有關(guān),還與捕光色素分子的特性,如光能吸收截面、激子傳遞效率等密切相關(guān)[16]。
春蘭miR396的過(guò)表達(dá)對(duì)擬南芥生殖生長(zhǎng)時(shí)期葉片生長(zhǎng)發(fā)育的形態(tài)指標(biāo)和光合指標(biāo)均產(chǎn)生了一定的影響,與前人在雙子葉植物中的研究存在較大差異,并在此基礎(chǔ)上對(duì)其葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行了分析發(fā)現(xiàn),該基因在保證植物凈光合效率、促進(jìn)葉片生長(zhǎng)的同時(shí),適當(dāng)降低了植物葉片的氣孔導(dǎo)度及PSII受體側(cè)的部分性能。