趙祝躍 申狀狀 王一帆 楊亞杰 榮二花 吳玉香

（山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，太谷 030801）

棉花屬雙子葉植物錦葵科（Malvaceae）、棉屬（Gossypium），是世界上最重要的經(jīng)濟作物之一，也是種植面積最廣的纖維作物。最新提出的棉屬分類系統(tǒng)為4個亞屬，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有52個種（變種），9個組，其中5個為異源四倍體棉種（2n=4X=52）［1］，分別是陸地棉（G.hirsutum，［AD］1）、海島棉（G.barbadense，［AD］2）、達爾文氏棉（G.darwinii，［AD］5）、夏威夷棉（G.tomentosum，［AD］3）和黃褐棉（G.mustelinum，［AD］4），其基因組為AD組，其余46個為二倍體棉種（2n=2X=26），其基因組分別為A、B、C、D、E、F、G和K［2］。棉屬廣泛分布于澳洲、美洲、非洲和阿拉伯半島等地區(qū)，經(jīng)過了不同地域長期的自然選擇和人工選擇后，產(chǎn)生了許多的栽培棉種和眾多的野生棉種［3］。陸地棉（G.hirsutum）為AD染色體組異源四倍體栽培棉，是目前中國乃至世界栽培范圍最廣的棉種。在部分其他地區(qū)，海島棉、草棉和亞洲棉等也有種植。棉屬栽培種和野生種是自然界豐富的種質資源，但栽培棉種缺乏部分野生種的優(yōu)良特性。因此，將野生棉的優(yōu)良性狀導入栽培棉，從而創(chuàng)造出多抗優(yōu)異新種質，對于棉花遺傳育種有著重要意義。

遠緣雜交就是不同種屬間甚至親緣關系更遠的物種之間的雜交。棉花遠緣雜交育種在一定程度上打破了物種間的界限，綜合各棉種的優(yōu)良特性到一個雜種中，從而創(chuàng)造出新的優(yōu)異種質資源。目前，國內外的很多學者已經(jīng)成功地將野生棉的部分優(yōu)良基因導入到栽培棉中，選育出一批優(yōu)良的陸地棉品種［4］。美國南卡羅萊那州Pee Dee農(nóng)業(yè)試驗站將亞洲棉和瑟伯氏棉（G.thurberi）遠緣雜交，進行基因重組，培育成纖維品質優(yōu)異的PD系統(tǒng)品種［5］。中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所通過用亞洲棉（G.arboreum）、斯特提棉（G.sturtianum）和陸地棉（G.hirsutum）雜交育成了中G2、中G3等兼抗枯、抗黃萎病新品系［6］。肖松華等［7］（2011-2012）通過對陸地棉與異常棉（G.anomalum）、辣根棉（G.armourianum）、旱地棉（G.aridum）、雷蒙德氏棉（G.raimondii）、黃褐棉（G.mustelinum）等野生棉的遠緣雜交和回交后育成的65份陸地棉為背景遠緣種質系然后進行篩選，獲得了抗黃萎病的棉花新種質，為我國抗病新品種的選育提供了材料。近年來，我國棉花種質資源的數(shù)量位居世界第四，但棉花資源的遺傳多樣性并不高。因此，棉花遠緣雜交是創(chuàng)造異源新種質最有效的辦法，也是棉花新品種選育的主要途徑。此外，還要積極和棉花種質資源的富集國開展更多的交流［8］。

陸地棉屬于AD染色體組異源四倍體栽培棉，原產(chǎn)于中美洲墨西哥的高地及加勒比海地區(qū)，亦稱高原棉，最早因在美洲大陸種植而聞名，具有產(chǎn)量高、適應性廣、結鈴性強、皮棉產(chǎn)量高等優(yōu)良品質［9］。野生斯特提棉（G.sturtianum，C組，2n=2X=26）原產(chǎn)于澳大利亞的中部和南部，具有許多優(yōu)良性狀如抗寒、抗萎病、生長勢強、纖維優(yōu)質、早熟等，尤其是植株有腺體種子無腺體的特性是重要的農(nóng)藝性狀，是現(xiàn)有栽培棉種所不具備的。斯特提棉的棉籽仁中沒有色素腺體，待幼苗時色素腺體出現(xiàn)在植株的莖葉、花蕾等器官上［10］。通過遠緣雜交以期將斯特提棉有益特性轉入栽培種陸地棉中，創(chuàng)造綜合父母本優(yōu)良性狀的新種質。

本研究以申狀狀等［11］前期合成的陸地棉與野生斯特提棉遠緣雜種為材料，與其親本陸地棉和斯特提棉進行初步形態(tài)性狀比較，然后對雜種進行細胞遺傳學研究，旨在觀察不育雜種F1減數(shù)分裂異常行為，分析出現(xiàn)異常現(xiàn)象的原因，并對雜種進行SSR分子標記鑒定，以期為雜種提供更加直觀的分子遺傳學證據(jù)，進一步為棉花遺傳育種和種質創(chuàng)新提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

母本栽培種陸地棉品種中棉所16，父本野生種斯特提棉（表1），以及本實驗室前期合成的陸地棉和斯特提棉的遠緣雜種F1。將材料同時種植于溫室的花盆中進行后期觀察和鑒定。

表1 供試材料及其地理分布Table 1 Materials and their geographical distribution

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學鑒定 以當年種成的植株為材料，取完全成熟的同齡器官和組織，分別記錄植株、葉片和花等形態(tài)性狀，并和父母本做比較，從形態(tài)學上分析鑒定雜種的真實性。從父本、母本和雜種植株的相同位置取完全展開的葉片進行觀察并測量分析，包括形狀、大小、短柔毛和腺體顏色等性狀。在開花期，將雜種植株的完全展開花的形態(tài)特征與其親本進行比較分析，包括小苞片、花萼、花冠、柱頭、雄蕊、花粉和雌蕊等，記錄并進行相關性狀描述。

1.2.2 細胞遺傳學鑒定

1.2.2.1 取材與固定 從雜種植株選取不同發(fā)育階段的花蕾，并立即固定在新制備的Carnoy液（乙醇∶乙酸= 3∶1，V / V）中，24 h后將固定的花蕾轉移到70%乙醇中并在4℃下儲存，用于細胞遺傳學觀察。

1.2.2.2 制片 首先，取成熟植株上的花蕾，在干凈濾紙上用解剖針和鑷子輕輕的剝開，取花蕾中大約5-7顆花藥置于蒸餾水清洗過的載玻片上，然后滴加少量改良卡寶品紅［12］（原液A：3 g堿性品紅＋100 mL 70%乙醇，原液B：10 mL原液A＋90 mL 5%苯酚水溶液，充分混勻，置37℃溫箱中2-4 h，原液C：55 mL原液B＋6 mL冰乙酸＋6 mL甲醛，充分混勻，染色液：10-20 mL原液C＋80 mL 45%乙酸＋1 g山梨醇）溶液，用鑷子充分擠壓花藥將花粉母細胞擠出，去除可見雜質，蓋上蓋玻片，最后將濾紙放在蓋破片上，用大拇指在其正上方垂直按壓玻片吸去多余的染液。

1.2.2.3 鏡檢 使用具有自動相機的Olympus BX60顯微鏡從新制備的載玻片中觀察并照相，選取至少500個花粉母細胞進行減數(shù)分裂行為觀察，記錄并做統(tǒng)計分析。

1.2.3 SSR分子標記鑒定 使用CTAB法提取來自遠緣雜種植株的基因組DNA及其親本種質DNA，DNA 擴增的總體積為 20 μL，含有 2 μL10× 緩沖液，1.6 μL MgCl2（25 mmol/L），0.2 μL dNTPs（10 mmol/L），6 μL 模板 DNA（50 ng /μL），2 μL 正向和反向引物（2.5 μmol/L），0.2 μL Taq 聚合酶（5 U/μL）和8 μL ddH2O。篩選出5對多態(tài)性簡單序列重復（SSR）引物進行擴增，94℃預變性3 min，94℃變性50 s，58℃復性50 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)，72℃延伸10 min。通過PAGE分離擴增的片段（20 μL）并通過銀染分離照相，對擴增清晰的條帶進行分析，參考申狀狀等［13］進行銀染檢測。SSR引物序列來自http：//www.cottonmarker.org，由北京賽百盛基因技術有限公司合成。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 在膠片觀察燈下讀帶，按照條帶清晰，重復性好的標準進行了篩選，每次實驗均重復2次，只有2次重復均相同的擴增帶才被用于統(tǒng)計分析。記錄雜種和親本的相同和差異條帶。

2 結果

2.1 遠緣雜種F1的形態(tài)性狀分析

母本陸地棉植株形態(tài)特征為：主莖干直立粗壯，為深綠色，下部枝葉較少或沒有，嫩枝或嫩葉被有稀或密的茸毛，也有無茸毛的，花瓣為乳白色。父本斯特提棉植株枝條纖細，為青綠色，葉片比較小，呈梨形，葉脈弧形。雜種植株具有較強的生長勢，株高高于雙親，主莖干直立且硬，翠綠色，枝葉繁茂，植株色素腺體多，莖毛短（圖1）。

圖1 親本與雜種的植株比較Fig.1 Plant comparison between parents and hybrid

對雜種及其親本的葉片進行分析比較發(fā)現(xiàn)（圖2），母本陸地棉的葉片為掌狀、三裂片、裂片呈寬三角形、銳尖、基部不收縮、顏色為深綠；父本斯特提棉的葉片比較小、呈梨形、葉脈弧形、顏色為翠綠色；雜種F1的葉片大于雙親，葉色與父本接近為翠綠色，葉面積比父本大比母本小，掌狀，三裂，葉裂刻較深，葉片整體形態(tài)趨于母本陸地棉，葉脈深淺介于雙親之間，葉片茸毛較短。

圖2 親本與雜種的葉片比較（標尺：20 mm）Fig.2 Leaf comparison between parents and hybrid(Ruler: 20 mm)

對雜種及其親本的花進行比較分析發(fā)現(xiàn)（圖3），母本陸地棉花瓣為乳白色，基部無紅斑；父本斯特提棉花冠較小，花瓣顏色為淡紫色，花瓣基部有深紫色花斑，花絲深紫色；雜種F1的花瓣顏色為粉紅色，基部花斑與父本相近，顏色為深紅色且基斑較大，花藥為乳白色，雌蕊柱頭乳白色像母本，柱頭長度比母本長但比父本短。

圖3 親本與雜種的花朵比較Fig.3 Flower comparison between parents and hybrid

2.2 遠緣雜種細胞遺傳學鑒定

為了研究雜種的細胞遺傳特性，本實驗對雜種的花粉母細胞（PMC）減數(shù)分裂行為進行觀察。結果表明：雜種的減數(shù)分裂出現(xiàn)許多異常行為，觀察分別發(fā)現(xiàn)PMC的異常二分體（圖4-A）、PMC的三分體（圖4-B）、PMC的異常四分體（圖4-C）、PMC的部分正常四分體（圖4-D）和PMC的多分體（圖4-E-H）等，以至于最后形成許多異常的花粉粒（圖5），分析其原因是由于雜種減數(shù)分裂后期I的非同步和不均等染色體分離造成的。通過統(tǒng)計觀察，在500個多分體中，分別有120個二分體（24.00%）、52個三分體（10.40%）、203個四分體（40.60%）和125個其他多分體（25.00%）（表2）。其中在觀察到的203個四分體中，148個是正常四分體（占72.91%），55個是異常四分體（占27.09%）。異常的三分體、異常四分體、異常多分體都不能形成正常的花粉粒，因此本研究也同時觀察到各種異常花粉粒，包括發(fā)育不良的花粉粒、畸形的花粉粒和花粉粒破裂等（圖5）。在500個選定觀察的花粉粒中，有380個花粉粒（占76.00%）是正常的，120個（占24.00%）為異?；ǚ哿?，觀察發(fā)現(xiàn)大部分異常的花粉粒都屬于未發(fā)育完全的類型。

圖4 雜種的正常和異常減數(shù)分裂行為（標尺：20 μm）Fig.4 Normal and abnormal meiosis behavior of G.hirsutum×G.sturtianum F1 hybrid (Ruler: 20 μm)

表2 雜種減數(shù)第二次分裂末期的多分體數(shù)量及比例Table 2 Number of multispores in telophase II of ADC hybrid meiosis

圖5 雜種減數(shù)分裂后的正常和異?；ǚ哿＃顺撸?0 μm）Fig.5 Various normal and abnormal pollen grains after meiosis of F1 hybrid (Ruler: 20 μm)

2.3 遠緣雜種SSR分子標記鑒定

通過對陸地棉、斯特提棉和其雜種在Marker2000下的SSR引物篩選和多態(tài)性分析，最后從中挑選出5對在三者間存在多態(tài)性的引物（圖6）。為了更加深入的了解雜種和親本之間在分子水平上的差異，使用5對多態(tài)性SSR引物進行了雜種和兩個親本的SSR分析。結果顯示，在陸地棉和斯特提棉的雜種中存在26條清晰的多態(tài)性帶。其中，在引物NAU1085中有6條清晰的條帶，2條與母本陸地棉相同，另外4條則為父母本都沒有的雜種新擴增出的特異性條帶；在引物NAU1209中，觀察到擴增出3條清晰的條帶，其中一條與母本相同，一條與父本相同，也就是雙親的互補條帶，剩余1條是雜種的特異性條帶；在引物NAU3405中有5條清晰的條帶，其中1條只與母本陸地棉相同，2條雙親的互補條帶，另外2條是雜種擴增出的特異性條帶；在引物TMB1125中，共找到7條清晰的條帶，其中有3條只與母本陸地棉相同，2條同時與父母本相同，1條與父本斯特提棉相同，1條是雜種的特異性條帶；在最后一對引物NAU2026中，有5條清晰的條帶，其中有2條只與母本陸地棉相同，2條雙親的互補條帶，還有一條是雜種的特異性條帶。因此，在引物NAU1085、引物NAU1209、引物NAU3405、引物TMB1125和引物NAU2026中，共找到9條雜種新擴增出的特異性條帶。除此之外，在這5對引物中有3對引物條帶的分子量范圍在100 bp-250 bp之間，有2對引物條帶的分子量范圍在250 bp-500 bp之間。

所有引物都擴增出了多態(tài)性產(chǎn)物。在這些擴增產(chǎn)物中，雜種通過引物NAU1209、引物NAU3405和引物NAU2026中擴增的條帶結果表明其中有來自兩個親本的互補條帶，在這5對引物中，都擴增出親本所沒有雜種的特異性條帶。在這26條清晰的條帶中，其中9條與母本陸地棉相同，2條與父本斯特提棉相同，6條是雙親的互補帶，還有9條是兩個親本所沒有的雜種新擴增出的特異性條帶，所占的遺傳成分比例分別是 34.62%、7.69%、23.07%和34.62%（表3）。結果初步表明了在母本陸地棉和父本斯特提棉的雜交過程中可能引起了染色體重組和片段交換，后續(xù)驗證還在進行中。結果也表明陸地棉和斯特提棉的雜種中存在豐富的遺傳變異，SSR分子標記鑒定結果分析證明該雜種是陸地棉和斯特提棉的真雜種。

3 討論

3.1 野生斯特提棉的育種利用價值

棉屬野生種具有很多栽培種所沒有的優(yōu)良品質，如豐產(chǎn)基因源，提高結鈴性的有比克氏棉、瑟伯氏棉等；優(yōu)質纖維基因源，其纖維品質主要的指標是長度、細度和強度，可以提高強度的有瑟伯氏棉、斯特提棉和毛棉等；抗病基因源，含有抗黃萎病基因的棉花主要有斯特提棉、澳洲棉、比克氏棉以及哈克尼西棉等。除此以外，棉屬野生種還具有抗蟲抗逆基因，細胞質雄性不育基因，無腺體基因，早苞落葉基因和致死基因［14］。野生斯特提棉具有抗根腐病，耐0-5℃低溫及改進纖維強力的潛在特性，是棉花品種改良的優(yōu)質材料，同時也具有抗蟲、抗寒、抗霜、對光周期不敏感、抗黃萎病、枯萎病、生長勢強、纖維優(yōu)質和早熟等優(yōu)良性狀［15］。除此以外，F(xiàn)xyxell［10］發(fā)現(xiàn)斯特提棉還具有許多陸地棉所沒有的優(yōu)良性狀，如種子腺體延緩發(fā)育，種子在休眠狀態(tài)時無腺體，在萌發(fā)后腺體開始形成，植株有腺體。

表3 雜種SSR的多態(tài)性來源分布Table 3 Source distribution of SSR polymorphisms in hybrid

圖6 SSR引物在雜種及父母本中的擴增結果Fig.6 Amplification results of SSR primers in hybrid and parents

因此，將斯特提棉的優(yōu)良性狀導入陸地棉中，創(chuàng)造出有育種價值的新材料。研究報道梁理民等［16］通過棉屬種間雜交獲得陸地棉×斯特提棉可育雜種，經(jīng)過兩次回交后，選育出優(yōu)質、抗病性強、抗病大鈴、抗病高衣分、抗病抗旱和抗黃萎病等多種優(yōu)良新種質，又從陸地棉×斯特提棉雜種后代中育成抗病、優(yōu)質、高產(chǎn)、抗旱、耐鹽堿的棉花新品種秦遠4號和抗病新種質6類24份，對豐富棉花遺傳資源起到了重要的作用。崔淑芳等［17］利用海島棉、陸地棉及野生棉進行棉屬種間遠緣雜交培育而成遺傳基礎豐富、高產(chǎn)、優(yōu)質、抗病品種冀棉25，它的育成克服了遠緣雜交障礙，拓寬了品種遺傳基礎。目前，從我國棉花遠緣雜交所取得的成果看來，棉花的種質資源得到了創(chuàng)新，有大批已經(jīng)或者即將進入棉花的原始資料庫，許多野生棉的有利基因也已經(jīng)進入基因庫中，為棉花的種質創(chuàng)新提供了新材料［18］。

3.2 遠緣雜種不育機理及育性恢復方法探討

植物遠緣雜交產(chǎn)生的雜種不育指的是雜種的第一代或者第二代植株雖然可以正常生長，但是因為遠緣雜交不親和，雙親的親緣關系比較遠，遺傳差異大造成的染色體不平衡，在生理上也不協(xié)調，這些都會影響到雌雄配子不能形成合子，而導致不能生殖的現(xiàn)象［19］。遠緣雜交不親和的原因主要是親緣關系較遠的雙親在結構上、生理上還有遺傳上的差異，染色體組間不協(xié)調等從而不能完成正常的受精，雙親的基因組成也對親和性有影響［20］。李靈嬌［21］通過對草雷雜種進行細胞遺傳學鑒定發(fā)現(xiàn)草雷雜種高度不育的原因主要是雜種花粉母細胞減數(shù)分裂行為異常，同源染色體不能正常配對和不均等分離，形成許多異常孢子，導致大部分花粉粒敗育。

長期以來國內外的棉花學家都將重點放在棉屬種間雜交和棉花遠緣雜種育性恢復探討上，克服遠緣雜交不親和性。雜種育性恢復的主要方法有染色體加倍。在棉花育種中，也有很多遠緣雜種由于雙親染色體組或染色體數(shù)目的不同而缺少了同源性，導致F1在減數(shù)分裂時染色體不能進行聯(lián)會，從而不能形成足夠數(shù)量有生活力的配子而導致不育。其主要解決方法是通過染色體誘導加倍和大量的回交和自交恢復其育性。如陸地棉×司篤克氏棉得到雜種三倍體F1不育，將其誘變加倍成異源六倍體恢復其育性［22］；亞洲棉×司篤克氏棉得到雜種二倍體，將其誘變加倍成異源四倍體恢復其育性［23］；以及本課題組前期合成陸地棉×斯特提棉雜種三倍體F1，申狀狀等［11］用0.2%的秋水仙堿瓊脂凝膠涂抹生長點將其誘導加倍成異源六倍體，通過對M0、M1的育性統(tǒng)計結果分析發(fā)現(xiàn)，隨著倍性的增加，育性正在逐漸恢復。鄭赟等［24］通過陸地棉和C組野生澳洲棉遠緣雜交獲得雜種F1，對其進行染色體加倍，將加倍的異源六倍體再與B組野生綠頂棉雜交，產(chǎn)生陸地棉、澳洲棉、綠頂棉的異源四倍體雜種，進一步探討有效的育性恢復方法。張伯靜等［25］也采用染色體加倍和大量回交的方法獲得了亞洲棉、比克氏棉和陸地棉的穩(wěn)定可育的異源四倍體種質。雷蒙德氏棉、斯特提棉和陸地棉通過遠緣雜交獲得其三元雜種，并通過人工授粉與親本進行的大量的回交和自交得到穩(wěn)定的遺傳后代［26］。吳玉香等［27］報道多年活體保存也是解決棉花種間雜種不育的途徑之一，由于異源雙親染色體組的不同，造成了4個栽培種種間四元雜種高度不育，通過嫁接繁殖的方法延長雜種的時間，經(jīng)過15年的生理協(xié)調，其雌雄配子的育性都得到了部分恢復，并對保存了15年的四元雜種從細胞學方面進行了鑒定，觀察發(fā)現(xiàn)染色體的構型逐漸協(xié)調，染色體組趨于平衡。這一結果說明延長種間雜種活體的保存時間對于雜種的育性恢復是有利的。

3.3 遠緣雜種SSR分子標記鑒定分析探討

SSR（simple sequence repeats）是簡單重復序列長度多態(tài)性標記，以PCR為基礎快速簡便，品種間多態(tài)性豐富，對雜交種及其親本的鑒定更具優(yōu)勢。近年來，SSR分子標記因其具有高豐度性、成本低、耗時少、多態(tài)性高和重復性好，已廣泛應用于棉花種質鑒定中［28］。石建斌等［29］采用前期篩選出的26對SSR核心引物，對收集保存的58份棉花種質資源進行純度檢測和遺傳多樣性分析。趙程杰等［30］利用SSR標記對53個棉花品種進行純度檢測和真實性鑒定。Larbouga等［31］利用SSR分子標記多態(tài)性對121份棉花種質資源的遺傳多樣性進行了分析。申狀狀等［13］對亞瑟遠緣雜種進行了SSR分子鑒定，進一步印證了雜種的真實性。王一帆等［32］對雜交育成的亞擬雜種進行SSR分子標記鑒定，進一步從分子水平證明了雜種是組合亞洲棉和擬似棉遺傳成分的真雜種。本實驗對陸地棉和斯特提棉的遠緣雜種也進行了SSR分子標記鑒定，結果表明：雜種F1不僅擴增出雙親的互補帶，還擴增出雙親沒有的特異性條帶，遺傳成分比例分別為：父本占7.69%，母本占34.62%，雙親的互補帶占23.07%，特異性新帶占34.62%，既表明在雜交過程中可能引起了染色體重組和片段交換，也從分子水平證實了該雜種是陸地棉和斯特提棉的真雜種，同時為棉花遺傳育種和種質創(chuàng)新提供了有價值的材料。

4 結論

本研究對陸地棉與野生斯特提棉遠緣雜種進行了形態(tài)學、細胞遺傳學以及SSR分子標記分析和鑒定，形態(tài)性狀表明雜種介于雙親之間，并表現(xiàn)出顯著的雜種優(yōu)勢；細胞遺傳學進一步揭示了雜種不育的主要原因；SSR分子標記從分子水平證實了遠緣雜種的真實性，同時表明在雜交過程中發(fā)生了基因重組。