彭潔 鄧孟勝 張杰 劉石鋒 羅李飛 王西瑤

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，成都 611130；2.樂(lè)山市種子管理站，樂(lè)山 614000）

馬鈴薯（Solanum tuberosum）是茄科茄屬植物，適應(yīng)性廣、產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，是繼水稻、小麥、玉米后的全球第四大糧食作物，在保障我國(guó)糧食可持續(xù)供給中扮演著十分重要的角色［1-3］。馬鈴薯貯藏是馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，每年因貯藏造成的損失高達(dá)25%，嚴(yán)重制約著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展以及貧困地區(qū)的脫貧致富。休眠是貯藏調(diào)控的關(guān)鍵生理環(huán)節(jié)，對(duì)休眠的調(diào)控直接影響著貯藏效率的高低。研究馬鈴薯塊莖休眠的分子機(jī)理對(duì)于控制馬鈴薯塊莖休眠和馬鈴薯塊莖貯藏至關(guān)重要［4］。

研究表明，馬鈴薯休眠和發(fā)芽受多種激素的共同調(diào)控，尤其是ABA（abscisic acid）/GA（gibberellin）的平衡是決定塊莖休眠到萌芽轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵，而油菜素內(nèi)酯（brassinolide，BR）、乙烯（ethylene，ETH）以及細(xì)胞分裂素（cytokinin，CTK）等激素主要通過(guò)影響該平衡，進(jìn)而調(diào)控休眠［5-6］。ABA是馬鈴薯塊莖休眠的主要調(diào)控因子，人為去除內(nèi)源ABA可以打破馬鈴薯的休眠［7］，提高內(nèi)源ABA含量顯著抑制馬鈴薯發(fā)芽，而增強(qiáng)SnRK2s、ABI5、ABF等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)同樣能延長(zhǎng)休眠期［8-10］。GA、BR等激素能夠拮抗ABA維持種子休眠的作用，外源GA處理抑制ABA水平，并且GA促進(jìn)RGL2降解進(jìn)而抑制ABI5的體內(nèi)積累，BR也能通過(guò)調(diào)控ABI5的穩(wěn)定性拮抗ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［9］。

Snakin/GASA（Gibberellic Acid-Stimulated in Arabidopsis）是一類受赤霉素誘導(dǎo)的基因，但也發(fā)現(xiàn)部分基因受到ABA的調(diào)控，在成花誘導(dǎo)、根的形成與生長(zhǎng)、果實(shí)成熟等多種器官的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用［11］。每個(gè)植物中均含有多個(gè)GASA蛋白，擬南芥中共有15個(gè)GASA成員，玉米中有13個(gè)GASA蛋白，水稻中有11個(gè)［12］。GASA蛋白氨基酸組成一般是80-120個(gè)，GASA主要由12個(gè)高度保守的半胱氨基酸殘基構(gòu)成（C末端），N末端的18-29個(gè)氨基酸殘基組成信號(hào)肽，而中間由7-31個(gè)極性氨基酸組成的可變化親水區(qū)［11］。大多數(shù)GASA蛋白定位于細(xì)胞壁或質(zhì)外體，如牽牛GIP2、GIP5定于細(xì)胞壁［13］，擬南芥GASA5定位于細(xì)胞壁或者胞外基質(zhì)［14］，但水稻GSR1卻定位在質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中［15］，馬鈴薯SN1在質(zhì)膜上發(fā)揮功能［16］。

StSN2屬于Snakin/GASA家族，前人研究表明其在防御病害中表現(xiàn)出重要作用。Nahirnak等［16］發(fā)現(xiàn)Snakin1、Snakin2、Snakin3的表達(dá)受細(xì)菌和外界傷害的影響，Berrocal-Lobo等［17］也證明StSN2可以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。近期研究表明，馬鈴薯Snakin調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育，Northern雜交表明StSN1在莖和花芽中表達(dá)量最高，而StSN2在塊莖和心皮中表達(dá)量最高。通過(guò)地上部特異表達(dá)StSN2導(dǎo)致莖段變粗變高、葉面積增加，而沉默StSN21后組培苗矮小白化、最終致死［18-20］，并推測(cè)該基因是馬鈴薯生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因，在馬鈴薯細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成中起重要作用。SN2同源蛋白SN1在調(diào)控馬鈴薯細(xì)胞分裂、植株高度等發(fā)育表現(xiàn)出作用，且已有研究發(fā)現(xiàn)GASA成員GASA6參與ABA、GA對(duì)擬南芥種子萌發(fā)的調(diào)控［21］，但關(guān)于StSN2在調(diào)控馬鈴薯休眠與萌芽的研究未見(jiàn)報(bào)道。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院馬鈴薯研究與開(kāi)發(fā)中心課題組前期轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組研究表明，塊莖休眠時(shí)StSN2表達(dá)量最高，而萌芽時(shí)表達(dá)量最低，表明StSN2可能在塊莖休眠上具有作用。

本研究以“川芋10號(hào)”為材料，克隆StSN2編碼序列，運(yùn)用生物信息學(xué)的方法對(duì)其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行分析，結(jié)合qRT-PCR分析StSN2在馬鈴薯各組織表達(dá)特異性，并檢測(cè)StSN2對(duì)休眠萌芽相關(guān)激素的響應(yīng)情況，旨為進(jìn)一步探究StSN2與馬鈴薯塊莖休眠的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為“川芋10號(hào)”，TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Revert Aid First Strand cDNA ynthesis購(gòu)自Thermo公 司， 高 保 真Prime STAR? Max DNA Polymerase酶、SYBR Green Master mix購(gòu)自寶生物公司，DNA凝膠純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、pMD19-T載體購(gòu)自天根生化科技有限公司，大腸桿菌DH5α購(gòu)自博邁德基因技術(shù)有限公司，引物合成、測(cè)序由擎科梓熙生物科技有限公司完成，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或者化學(xué)純。

1.2 方法

1.2.1 取樣 播種后第2周開(kāi)始，分別提取馬鈴薯“川芋10號(hào)”塊莖不同時(shí)期新鮮組織（幼薯、休眠塊莖、萌芽塊莖、芽，以及花蕾、幼葉、成熟葉、葉柄、莖和根）的總RNA，按照First Strand cDNA Synthesis Kit Revertra Acc逆轉(zhuǎn)錄的方法合成cDNA。

1.2.2 StSN2的克隆 從馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Potato genome sequencing consortium public data release，PGSC）中找到StSN2的CDS序列，利用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物并由成都擎科梓熙生物科技有限公司合 成 引 物（StSN2-F：5′-GGATCCAATGGCCATTCGAAAGCTCT-3′，StSN2-R ：5′-CCCGGGTTAAGGGCATTTACGTT TGT-3′）。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為2×PrimeSTAR Max Premix 25 μL、上下游引物（10 μmol/L）各 1.5 μL、cDNA 2 μL 和ddH2O 20 μL；反應(yīng)程序?yàn)?98℃ 3 min；98℃ 30 s；58℃ 30 s；72℃ 2min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min?；厥漳康臈l帶，并與pMD19-T載體連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑取陽(yáng)性單克隆進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，然后送測(cè)序。

1.2.3 StSN2的生物信息學(xué)分析 將測(cè)得的序列通過(guò)NCBI的BLAST比對(duì)同源序列（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）；利 用 ProtParam 程 序（http：//web.expasy.org/protparam/）在線預(yù)測(cè)氨基酸序列分子量、理論等電點(diǎn)（pI）、不穩(wěn)定系數(shù)等；通過(guò)SOPMA軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，運(yùn)用SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/interactive）進(jìn)行三維建模，使用在線工具M(jìn)EG7軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

1.2.4 StSN2的亞細(xì)胞定位 將之前擴(kuò)增的StSN2與PBWA（V）HS-codb-GLosgfp載體酶切連接，PCR檢測(cè)陽(yáng)性菌落，測(cè)序，轉(zhuǎn)化到GV3101農(nóng)桿菌中，注射煙草葉片，處理48 h后，用激光共聚焦顯微鏡對(duì)處理的煙草葉片進(jìn)行直接觀察，并拍照記錄。

1.2.5 qRT-PCR分析馬鈴薯不同組織的StSN2表達(dá)量 利用之前提取的馬鈴薯“川芋10號(hào)”莖塊不同時(shí)期的CDNA，選擇EF1αL作為內(nèi)參，qRT-PCR法測(cè)StSN2表達(dá)量。根據(jù)馬鈴薯數(shù)據(jù)庫(kù)（PGSC）設(shè)計(jì)引物。EF1αL-F：5′-CTTGTACACCACGTAAGGAG-3′，EF1αL-R ：5′-GTCAATGCAAACCATTCCTTG-3′，StSN2定量引物設(shè)計(jì)根據(jù)全場(chǎng)CDNA序列來(lái)設(shè)計(jì) ：qStSN2-F ：5′-CTCCTTGCTCCTTCTCCG-3′，qStSN2-R ：5′-TAGCAAGGGCAAGTCTCAG-3′。熒 光定量PCR反應(yīng)體系為2×Ssofast Eva Green 5 μL、上下游引物（10 μmol/L）各 0.4 μL、cDNA 4.2 μL ；反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 3 min；95℃ 5 s，56℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，65-95℃ 1 min做熔解曲線，各溫度以0.5℃上升，并停5 s。每個(gè)試驗(yàn)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，基因表達(dá)量用2-△△Ct方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2013整理和作圖，Data Processing System 7.05統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并用LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 StSN2的克隆

對(duì)塊莖總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示（圖1-A），28S和18S條帶明亮清晰，且亮度接近2∶1，表明總RNA質(zhì)量好，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。以新合成的cDNA為模板，擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)CDS序列300 bp左右（圖1-B），并構(gòu)建T載體（圖1-C），測(cè)序結(jié)果顯示StSN2的CDS總長(zhǎng)為315 bp（圖2）。

圖1 馬鈴薯總RNA的提取和StSN2的擴(kuò)增Fig.1 Extraction of total RNA and amplification of StSN2 in S.tuberosum

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 StSN2氨基酸序列分析 StSN2編碼104個(gè)氨基酸（圖2），結(jié)構(gòu)域分析顯示，StSN2包括12個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基區(qū)域，典型的Snakin/GASA超家族結(jié)構(gòu)。

2.2.2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 使用ProtParam軟件對(duì)StSN2蛋白進(jìn)行在線分析可知，StSN2蛋白的分子式為C461H767N141O146S13，原子總數(shù)為1 528個(gè)，相對(duì)分子質(zhì)量為11.034 kD，推測(cè)該蛋白應(yīng)該是一個(gè)比較穩(wěn)定的、呈弱堿性的蛋白，主要是依據(jù)其理論的等電點(diǎn)和不穩(wěn)定的系數(shù)分別為8.91及39.73，根據(jù)其平均親水系數(shù)為-0.031，可知這一蛋白質(zhì)應(yīng)該屬于親水性的蛋白質(zhì)。

圖2 StSN2的編碼序列及氨基酸序列分析Fig.2 Coding sequence and amino acid sequence analysis of StSN2

2.2.3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 對(duì)StSN2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)在線分析可知，該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲2種（圖3），且占的比例分別達(dá)到了35.5%及60.5%，然后是β-折疊，但其所占比例較小，僅為3.85%。并以馬鈴薯SN1為模型，構(gòu)建SN2三維結(jié)構(gòu)模型圖（圖4-A），與StSN1序列一致性為40.32%，其結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)較為一致。

2.2.4 跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 通過(guò)TMHMMServerv.2.0 在線網(wǎng)站對(duì)StSN2 蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)域分析（圖4-B），從預(yù)測(cè)的結(jié)果來(lái)看，該蛋白為分泌蛋白，作用于膜外，亞細(xì)胞定位通過(guò)lncLocator（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/lncLocator/）在線軟件預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，StSN2 蛋白主要存在于細(xì)胞核（73%）和細(xì)胞質(zhì)（21%），利用 SignalP5.0 信號(hào)肽預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示StSN2蛋白存在信號(hào)肽的可能性為0.996，這和跨膜分析相一致，該蛋白是分泌蛋白的可能性極大。

2.2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析 運(yùn)用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖5），結(jié)果表明馬鈴薯StSN2與番茄、辣椒、煙草等茄科植物親緣關(guān)系較近，而與番薯、黃瓜等植物次之，與菊科向日葵、葫蘆科南瓜等親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，以上系統(tǒng)進(jìn)化的親緣關(guān)系與物種進(jìn)化基本一致。

2.2.6 StSN2蛋白的亞細(xì)胞定位 以Pbwa（v）hsccdb-Glosgfp載體，構(gòu)建StSN2-GFP融合表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)果顯示（圖6），StSN2-GFP和GFP均在葉片中成功表達(dá)，進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)StSN2-GFP主要分布在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上，而空白對(duì)照熒光主要在細(xì)胞質(zhì)膜，表明StSN2蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核，但在細(xì)胞膜上可能也有定位。

2.2.7 StSN2組織的表達(dá)分析 基因的組織表達(dá)與功能密切相關(guān)，如StSN1在莖中表達(dá)量最高，而下調(diào)期表達(dá)顯著矮化了植株。本試驗(yàn)通過(guò)qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，StSN2在各組織具有表達(dá)（圖7），以塊莖、葉片、根等組織表達(dá)量最高，其次是葉片、根，在莖、花蕾、葉柄最低，尤其是在塊莖中，StSN2表達(dá)量是莖、花蕾表達(dá)量的100倍以上，即使是在表達(dá)量第二的成熟葉片中，StSN2表達(dá)量也只有塊莖的19.6%，表明StSN2可能在塊莖以及葉片中表現(xiàn)出顯著作用。

圖3 StSN2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of secondary structure of StSN2 protein

圖4 StSN2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of tertiary structure of StSN2 protein

2.2.8 激素調(diào)控塊莖StSN2的表達(dá) 用20 mg/L GA3、250 nmol/L BR和4 mg/L ABA處理馬鈴薯塊莖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20 mg/L GA3、250 nmol/L BR都能提高馬鈴薯的發(fā)芽率，以GA3的效果最為明顯，而ABA顯著抑制了塊莖的萌發(fā)（圖8-A）。為進(jìn)一步分析StSN2表達(dá)量對(duì)休眠萌芽激素的響應(yīng)情況，qRT-PCR分析了不同時(shí)期StSN2的表達(dá)水平。結(jié)果表明，ABA、GA3以及BR影響了塊莖中StSN2的表達(dá)，GA3、BR處理能夠促進(jìn)塊莖休眠的打破，同時(shí)也下調(diào)了StSN2水平；值得注意的是，4 mg/L ABA明顯的改變了塊莖中StSN2原有的表達(dá)水平，在7、14和28 d時(shí)ABA處理下，StSN2表達(dá)量提高了50%左右，表明StSN2表達(dá)受到ABA上調(diào)，并且很可能參與ABA對(duì)塊莖休眠的維持。

圖5 StSN2系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 StSN2 phylogenetic tree

圖6 亞細(xì)胞定位圖Fig.6 Subcellular localization

圖7 馬鈴薯不同組織中StSN2的表達(dá)分析Fig.7 Analysis of StSN2 expression in different tissues of S.tuberosun

3 討論

馬鈴薯塊莖從休眠到休眠解除的過(guò)程十分復(fù)雜，受到基因、激素和環(huán)境的共同調(diào)節(jié)作用。馬鈴薯休眠難調(diào)控的問(wèn)題長(zhǎng)期制約著其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，目前主要是利用物理、化學(xué)的方法進(jìn)行馬鈴薯的貯藏調(diào)控，過(guò)度使用催芽劑和抑芽劑，不但會(huì)造成環(huán)境污染，而且殘存在馬鈴薯塊莖的化學(xué)試劑對(duì)人體也有副作用，不利于人體健康。對(duì)馬鈴薯塊莖休眠的分子機(jī)制進(jìn)行研究，對(duì)于馬鈴薯產(chǎn)后貯藏以及調(diào)控種薯發(fā)芽具有重要的科學(xué)價(jià)值。

GASA（gibberellic acid stimulated Arabidopsis）蛋白對(duì)植物生長(zhǎng)和抗逆發(fā)揮著關(guān)鍵作用，參與種子萌發(fā)、側(cè)根的產(chǎn)生、莖的伸長(zhǎng)以及開(kāi)花等。近期研究表明，馬鈴薯Snakin調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育，地上部特異表達(dá)StSN2導(dǎo)致莖段變粗變高、葉面積增加，而沉默StSN2后組培苗矮小白化、最終致死，SN1在調(diào)控馬鈴薯細(xì)胞分裂、植株高度等發(fā)育表現(xiàn)出作用［21-22］。因此，本研究通過(guò)克隆馬鈴薯“川芋10號(hào)”StSN2并分析其表達(dá)的特性，對(duì)后續(xù)休眠萌芽研究具有重要作用。本研究克隆到StSN2開(kāi)放閱讀框315 bp，編碼104個(gè)氨基酸，與前期馬鈴薯全基因組和轉(zhuǎn)錄組研究一致。氨基酸序列結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，StSN2具有Snakin/GASA家族共有的12個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，表明克隆到的StSN2序列屬于Snakin/GASA家族。理化性質(zhì)分析表明StSN2等電點(diǎn)為8.91，而前期研究鑒定到的StSN2等電點(diǎn)為9.6，可能存在不同品種間的差異。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，StSN2主要以無(wú)規(guī)卷曲和α-螺旋為主，這與前期研究結(jié)果是一致的。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，馬鈴薯塊莖中StSN2蛋白和辣椒、番茄、茄子等茄科中的進(jìn)化關(guān)系最近，具有高度相似的保守結(jié)構(gòu)域，預(yù)示著馬鈴薯SN2可能與番茄等近緣物種基因在功能上存在相似性，且已有研究報(bào)道StSN2與SlSN2同樣在調(diào)控植物抗菌抗病性上表現(xiàn)出作用；而與黑麥、筍瓜親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，符合植物在進(jìn)化中的關(guān)系，對(duì)多物種的SN2功能研究為豐富和完善SN2的功能提供了基礎(chǔ)支撐。

圖8 3種不同的激素處理下馬鈴薯的發(fā)芽率及StSN2的表達(dá)分析Fig.8 Germination rate and StSN2 expression analysis of S.tuberosun treated with three different hormones

大多數(shù)GASA蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜或質(zhì)外體，如牽牛GIP2、GIP5、擬南芥GASA5等，但本實(shí)驗(yàn)亞細(xì)胞定位顯示StSN2定位在細(xì)胞核中，在質(zhì)膜上也可能定位信號(hào)，與大部分Snakin/GASA家族蛋白定位是不同的。但在野生大豆中發(fā)現(xiàn)GsGASA1定位于細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核［23］；同樣地，水稻GSR1也定位在質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，可能StSN2與GsGASA、OsGSR1在定位于細(xì)胞核中表現(xiàn)出相似地功能。本研究中，與空載體熒光（細(xì)胞膜周圍）對(duì)照發(fā)現(xiàn)，StSN2同樣在細(xì)胞膜位置有熒光信號(hào)，并且StSN2-GFP熒光信號(hào)顯著強(qiáng)于空載熒光信號(hào)，表明StSN2在細(xì)胞膜上可能也存在熒光信號(hào)。且已有研究報(bào)道，擬南芥GASA14定位于質(zhì)膜［16，24］；在馬鈴薯中，StSN1就是定位在質(zhì)膜，且StSN2與StSN1同屬于馬鈴薯中的Snakin蛋白，可能存在某些功能的相似性，但究竟StSN2蛋白是否定位到質(zhì)膜上還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

馬鈴薯Snakin調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育，在Northern雜交表明StSN1在莖和花芽中表達(dá)量最高，沉默StSN1顯著影響了細(xì)胞的分裂和大小，并造成了葉面積的改變；但StSN2與StSN1組織表達(dá)特異性不同的是，StSN2在塊莖和心皮中mRNA水平最高，這與我們的研究結(jié)果是一致的，表明StSN2可能在塊莖中作用更大。更值得一提的是，不同的塊莖發(fā)育時(shí)期StSN2表達(dá)量也存在較大差異，尤其是在休眠期塊莖中StSN2最高，表明StSN2可能在調(diào)控塊莖休眠中具有一定作用；而在莖、葉柄等組織表達(dá)量低，Oliveira-Lima等［12］研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在心皮中StSN2豐度較高，而本研究發(fā)現(xiàn)StSN2花蕾中幾乎不表達(dá)，但這可能存在一定的組織差異，是否在心皮中表達(dá)有待深入分析。

激素是決定塊莖休眠及其釋放的關(guān)鍵因子，ABA、ETH等維持休眠，GA、BR等激素促進(jìn)休眠的釋放［6，25-26］，本試驗(yàn)也證明4 mg/L ABA顯著維持了塊莖休眠，而20 mg/L GA3和250 nmol/L BR均顯著促進(jìn)了塊莖休眠的釋放，這與前期研究結(jié)果較為接近。也有研究表明4 mg/L ABA只能在處理前期降低塊莖發(fā)芽率，而對(duì)休眠期的影響不顯著。前期研究表明，Snakin/GASA受GA、ABA等激素調(diào)控，擬南芥GASA6參與GA、ABA對(duì)種子休眠的調(diào)控［12，18］，但馬鈴薯Snakin是否調(diào)控塊莖休眠仍有待進(jìn)一步研究，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)StSN2受到以上激素的顯著影響，尤其是4 mg/L ABA顯著誘導(dǎo)了塊莖中StSN2的表達(dá)，這與Marta等［27］研究發(fā)現(xiàn)的ABA誘導(dǎo)StSN2的表達(dá)，而GA抑制StSN2的表達(dá)結(jié)果一致。250 nmol/L BR對(duì)StSN2的表達(dá)具有雙向調(diào)控的作用，這也可能與BR在調(diào)控塊莖萌芽上表現(xiàn)出多面性。綜上表明，StSN2在調(diào)控馬鈴薯塊莖休眠中具有重要作用，并可能參與休眠萌芽激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響休眠期。

4 結(jié)論

從馬鈴薯品種“川芋10號(hào)”中克隆到StSN2，其全長(zhǎng)315 bp，編碼104個(gè)氨基酸，含有Snakin/GASA家族高度保守的12個(gè)半胱氨酸殘基，與番茄、辣椒、煙草等茄科植物親緣關(guān)系較近。StSN2受ABA等休眠激素誘導(dǎo)，可能參與馬鈴薯的休眠。