方雅莉

（廣東醫(yī)科大學科研服務管理中心，廣東 東莞523808）

新煙堿類殺蟲劑是一類高效的殺蟲劑，目前在世界上應用廣泛[1]。它的獨特優(yōu)勢在于其具備一定的選擇性，殺蟲高效避免了很多害蟲對氨基甲酸酯等傳統(tǒng)類別的殺蟲劑所產(chǎn)生的抗藥性，因此被廣泛使用于瓜果蔬菜等糧食作物的除蟲。人們一度認為新煙堿類殺蟲劑對哺乳類動物風險較低，是因為它與哺乳動物的乙酰膽堿受體的親和力低。但經(jīng)過研究表明，新煙堿類殺蟲劑對哺乳動物不像當初設計的那么安全。由于此類殺蟲劑在瓜果蔬菜等農(nóng)作物中大范圍使用，使得其在水體和土壤中的積累量逐年增加，通過膳食和飲水攝入成為人群暴露于新型煙堿類殺蟲劑的主要途徑。由于大范圍的使用已對人群造成潛在的風險。據(jù)研究表明，吡蟲啉和啶蟲脒是樣品中檢出率最高的新煙堿類殺蟲劑，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第199 號公告明確禁止使用殺蟲脒這一類高毒殺蟲劑[2]。生態(tài)流行病學調(diào)查顯示, 長期接觸殺蟲脒的工人膀胱癌發(fā)生率是普通工人的72 倍[3]，并在他們的尿中檢出了代謝產(chǎn)物4-氯鄰甲苯胺。同樣，據(jù)研究顯示，吡蟲啉能夠延緩部分動物胚胎的發(fā)育[4,5]，啶蟲脒能夠明顯降低鳥類的精子密度[6]。因此，建立一種快速高效的對血液中的啶蟲脒、吡蟲啉、殺蟲脒殘留量檢測方法很有必要，目前，應用最廣泛的樣品前處理方法是固相萃取[7-13]與液液萃取[14-18]。固相萃取重現(xiàn)性好且萃取柱價格適宜，一般較受青睞，但是上樣前要將萃取柱活化、平衡及清洗，使的樣品前處理步驟變得復雜，費時耗力，樣品量少時可以使用。液液萃取利用目標物在兩相中溶解度不同，來達到有效分離的目的，常用的有機溶劑有乙酸乙酯、二氯甲烷等，但是液液萃取需要的溶劑多，萃取過程中需要不斷的充分振蕩、離心，操作復雜，且液液萃取容易發(fā)生乳化現(xiàn)象，導致重現(xiàn)性差。綜上可知，固相萃取和液液萃取兩種前處理方法都無法滿足流行病學調(diào)查中大量樣本處理的需求。因此，急需一種簡單易行的前處理方法來檢驗全血中的啶蟲脒、吡蟲啉、殺蟲脒。固相支撐液液萃取柱的填料為惰性處理的硅藻土，具有疏松多孔的特點，加之表面活性低，比表面積高，相比傳統(tǒng)的液液萃取方法，能夠提供更大的液液分配支撐界面。傳統(tǒng)液液萃取方法容易發(fā)生乳化現(xiàn)象，導致回收率偏低，除雜效果差，容易發(fā)生交叉污染，固相支撐液液萃取方法能夠有效避免傳統(tǒng)液液萃取的不足，操作過程僅需上樣、靜置、洗脫三步，省去了振蕩、離心，取上層溶液等操作，整個過程不形成乳濁液，是生物、食品和環(huán)境樣品的理想選擇。相較于液液萃取、固相萃取等傳統(tǒng)的樣品前處理方法，固相支撐液液萃取能有效提高樣品中目標物的提取富集效率，在人體生物樣品的前處理上廣泛應用[29-24]，而且能夠?qū)δ繕宋镞M行高通量的分析。本文采用固相支撐液液萃取作為前處理方法，以人體血液中的啶蟲脒、殺蟲脒、吡蟲啉為目標物，利用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對目標物進行定性定量檢驗，結果表明，可以對生物體液中的啶蟲脒、殺蟲脒、吡蟲啉進行快速高效的檢驗。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正戊烷、乙醚、乙腈、甲醇(色譜級，99.9%，德國Merck 公司) ; 醋酸鈉和甲酸 ( 99.97 %，美國Tedia 公司) ; HCl( 質(zhì)量分數(shù)為37%，德國Sigma-Aldrich 公司) ;實驗用水為超純水( 18.2 MΩ·cm) ; 吡蟲啉（德國Dr 公司）；啶蟲脒（中國ANPEL 公司）；殺蟲脒（德國Dr 公司）；空白血1 份。

1.2 儀器

液相色譜儀( LC，日本島津公司) -三重四極桿質(zhì)譜儀( MS /MS，美國AB SCIEX 公司) ;臺式離心機(美國Thermo Fisher 公司); 氮吹儀(瑞典Biotage 公司);6 孔固相萃取裝置(中國?？乒? ;超純水儀(美國Millipore 公司) ; 振蕩器（德國IKA 公司）;0.22 μm 尼龍膜濾頭(德國CNW 公司) ; 5 mL SLE 固相支撐液液萃取小柱(瑞典Biotage 公司)。

1.3 溶液配制

混合標準工作溶液的配制：精確稱取殺蟲脒、啶蟲脒、吡蟲啉對照品適量，分別置于50 mL 的容量瓶中，用甲醇溶解并定容，充分搖勻的基礎上超聲促溶，配制成1 mg/mL 標準儲備液，用移液槍各取適量標準儲備液于甲醇水（V/V 1:1）中，配制成100 μg/mL 的標準工作液，備用。Ph 為10 的緩沖溶液配制：準確稱取KH2PO40.064 g，Na2HPO45.020 g，于1000 mL 容量瓶中，用去離子水溶解并定容，充分搖勻，配制成Ph 為10 的緩沖鹽溶液。

1.4 樣品前處理

將樣品解凍后，準確量取1 mL，加入1mL Ph 為10 緩沖溶液，振蕩3 min，8000 r/min 離心5 min，取上清液，加入20ng 內(nèi)標SKF525a，充分混勻。將樣品加入固相支撐液液萃取小柱中，1 分鐘內(nèi)上樣完畢，等待5 min，使樣品分散并充分吸附于填料表面。以4 mL 乙酸乙酯沖洗萃取柱，連續(xù)洗脫2 次，將兩次收集的洗脫液合并氮吹并吹干，以甲醇定容至400 μL。用0.22 μm 的尼龍膜過濾后，備檢。

1.5 儀器分析

UPLC 色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1mm×50mm，ID 1.7μm，美國Waters 公司）；流動相A：0.1%甲酸+5mmol/L 乙酸銨的超純水；流動相B：乙腈；流速：0.3 mL/min；進樣體積：1μL；梯度洗脫程序：0～2 min，90 % B; 2～2.5 min，90 %～50% B; 2.5～3 min，50 % B; 3～3.5 min，50 %～90 %B; 3.5～6 min，90%B。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI )，正離子模式，多掃描方式：多反應監(jiān)測（MRM）。質(zhì)譜離子源參數(shù)：CUR：35；CAD：Medium；IS ：5500；TEM：450；GSI：50；GS2：50。

各目標化合物保留時間和定性定量離子對見表1。

表1 殺蟲脒、吡蟲啉、啶蟲脒的質(zhì)譜參數(shù)及色譜保留時間

2 實驗條件優(yōu)化

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

結合殺蟲脒、啶蟲脒、吡蟲啉的化學結構式，選擇ESI(+)的電離模式，使用注射針泵分別注入500 ng/mL 的藥物標準品。殺蟲脒、啶蟲脒、吡蟲啉的分子量分別為196，222，255，在m/z 100-500 的掃描范圍內(nèi)進行全掃描，在一級全掃描質(zhì)譜中得到母離子質(zhì)量數(shù)[M+H]+的分子離子峰。調(diào)節(jié)儀器參數(shù)，分別選擇[M+H]+作為母離子進行二級質(zhì)譜掃描分析，自動優(yōu)化確定最高及次高響應的二級離子m/z 以及相應的DP、CE、CXP 等參數(shù)，具體見表2。（質(zhì)譜參數(shù)表1）。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本論文分別研究了含有0.1%甲酸、5 mmol/L 醋酸銨和0.1%甲酸、5 mmol/L 醋酸銨的超純水作水相；乙腈、甲醇作為有機相，以靈敏度和峰形作為評判條件，最終發(fā)現(xiàn)含有5 mmol/L 醋酸銨和0.1%甲酸的超純水作水相，乙腈作為有機相，選擇梯度洗脫，以相對高的流速低比例的有機相作為起始流動相，提高分析效率和靈敏度。

2.3 前處理方法優(yōu)化

生物樣品成分復雜，一般對目標物的干擾比較大，前處理的目的就是為了最大限度除去干擾，保證儀器性能的同時，獲得較高的目標物回收率。本實驗分別對比了3 種常用的前處理方法。(1)蛋白沉淀法：取0.5 mL 樣品，加入2.0 mL 90 %（V/V）乙腈水沉淀蛋白，充分振蕩10.0min 后，8000r/min 離心取上清液，過0.22μm 濾膜后直接進行儀器檢測。(2) HLB 固相萃取法：準確移取血液0.5mL，加入pH=6 的緩沖溶液0.5mL。振蕩1.0 min 后將混合液8000r/min離心取上清液，HLB 萃取住活化后，上樣淋洗后先在5 000 r/min下離心5 min，然后氮吹吹干，乙酸乙酯洗脫，洗脫液氮吹吹干后用初始流動相溶解，過0.22 μm 尼龍濾膜后直接上樣。(3) 固相支撐液液萃取法：準確移取樣品血液0.5 mL，加入pH = 10 的緩沖溶液0.5mL。充分振蕩1min 后上樣，1min 內(nèi)要完成上樣全過程，使得樣品全部均勻分散在填料上后，靜置5.0 min 左右。用4mL*2 乙酸乙酯洗脫萃取柱，輕微加壓，流速在1.0 mL/min 左右。合并兩次洗脫液氮氣吹干，用初始流動相定容至0.5 mL，過0.22 μm 尼龍膜，濾液供UPLC-MS/MS 分析。對比上述3 種前處理方法，乙腈直接沉淀蛋白法，容易產(chǎn)生基質(zhì)效應，結果不穩(wěn)定，回收率約為65 %，固相萃取法稍有不慎便會堵塞柱子，耗時長，回收率約為60 %?？v觀固相支撐液液萃取法，提取效率高，操作簡單，回收率能達到90% 以上，滿足實際使用要求。

2.4 固相支撐液液萃取柱洗脫溶劑的選擇

本實驗選取了環(huán)己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚作為洗脫溶劑進行優(yōu)化，通過3 種目標物的回收率進行評價。相關結果見表2，二氯甲烷溶解性較大，易洗脫部分非目標物，乙醚沸點太低，易揮發(fā)，綜合考慮，洗脫溶劑選擇乙酸乙酯。

表2 固相支撐液液萃取柱洗脫溶劑的優(yōu)化

2.5 方法評價

2.5.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限

上述實驗條件優(yōu)化好后，進行方法學的考察。取空白全血5 份各0.5 mL，分別配制成5、10、50、100、500 ng/mL 標準品。經(jīng)過固相支撐液液萃取法進行前處理后，進行儀器分析。以不同濃度目標物的峰面積進行線性回歸，結果表明啶蟲脒、吡蟲啉、殺蟲脒3 種藥物在5～500 ng/mL 范圍內(nèi)有良好線性關系，相關系數(shù)為0.9983～0.9992，以3 倍信噪比（S/N）對應的添加水平作為檢出限（LOD），10倍信噪比（S/N）對應的添加作為定量限（LOQ），結果見表3。

表3 三種藥物的線性方程、相關系數(shù)、檢出限

2.5.2 方法回收率和精密度

方法采用空白血樣添加標準混合目標物方式，在空白血樣中分別添加5.0、50.0、500.0 ng/mL 標準品，每個濃度血樣平行配制3 份樣品。按照上述的方法進行處理。通過對比峰面積計算回收率，見表4。

表4 三種藥物的回收率和精密度

3 結論

本實驗采用固相支撐液液萃取進行樣品前處理，以UPLC-MS/MS 對血液中的啶蟲脒、吡蟲啉、殺蟲脒同時進行分析。通過對質(zhì)譜條件和前處理方法的優(yōu)化，建立了同時檢測全血中啶蟲脒、吡蟲啉、殺蟲脒，LLE-UPLC-MS/MS 分析方法。本方法快速靈敏、回收率高，能夠滿足實際使用需求。