馬榮坤，潘孝青

（1.鎮(zhèn)江希瑪牧業(yè)有限責(zé)任公司，江蘇鎮(zhèn)江 212100；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇南京 210014；3.農(nóng)業(yè)部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210014）

1 前言

高溫堆肥發(fā)酵可顯著提高畜禽糞污中有機(jī)大分子的分解，一定程度上降低病原微生物數(shù)量，是糞污無害化處理的關(guān)鍵技術(shù)[1]。但高溫條件下，微生物種群及相關(guān)酶活性顯著受到抑制，極大地限制了大分子難降解物質(zhì)的快速降解。高溫菌具有代謝快、活性高、酶的熱穩(wěn)定性高、營(yíng)造高溫條件殺死病原菌等特點(diǎn)，對(duì)于高溫環(huán)境下有機(jī)物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化具有重要作用，與常溫菌相比具有更高的微生物代謝活性和有機(jī)物降解速率，在畜禽糞污處理及資源化利用領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，通過接種高溫降解菌可以增加堆肥高溫期微生物的數(shù)量，加速難降解糞污中有機(jī)物質(zhì)的快速轉(zhuǎn)化，有效提高糞污處理效率[2-3]。

目前對(duì)于高溫堆肥發(fā)酵菌的研究大多僅關(guān)注一種大分子物質(zhì)的降解，對(duì)于能同時(shí)降解多種有機(jī)物的高溫菌研究較少。本文從高溫堆積發(fā)酵的糞污中分離篩選耐高溫發(fā)酵菌并擴(kuò)培制成混合菌劑，篩選具有同時(shí)降解纖維素、蛋白質(zhì)、淀粉三種有機(jī)大分子能力的高溫菌，旨在為規(guī)模豬場(chǎng)糞污快速處理提供優(yōu)良菌株，有效的促進(jìn)豬糞糞污快速腐解、縮短處理周期，提高糞污的腐熟程度，降低糞污中病原微生物數(shù)量。

2 材料與方法

2.1 材料

高溫堆肥發(fā)酵菌篩選材料來源于高溫堆積發(fā)酵階段的糞污。

2.2 培養(yǎng)基

2.2.1 馴化培養(yǎng)基。牛肉膏10g，NaCl 5g，蛋白胨5g，H2O 1 000ml，pH7.0，121℃滅菌20min。

2.2.2 選擇培養(yǎng)基。纖維素剛果紅培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉1.88g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O 0.25g，明膠2.0g，剛果紅0.2g，植物凝膠10g，瓊脂15g，H2O 1 000mL pH 7.0～7.2g，121℃滅菌20min。

蛋白選擇培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，酪蛋白5g，CaCl20.1g，L—酪氨酸0.1g，植物凝膠15g，H2O 1 000mL，pH 7.0～7.2，121℃滅菌冷卻至60℃，加入 1%115℃滅菌的吐溫80。

淀粉選擇培養(yǎng)基：可溶性淀粉10g，蛋白胨 10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，pH 7.0，植物凝膠20g，曲利苯藍(lán)0.05g，H2O 1 000mL，121℃滅菌30 min。

2.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基。纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉5g，NaNO3 2.5g，KH2PO41g，MgSO40.6g，NaCl 0.1g，CaCl20.1g，F(xiàn)eCl30.01g，明膠2g，酵母粉0.1g，H2O 1 000mL，pH 6.8-7.2。蛋白發(fā)酵培養(yǎng)基：干酪素5%，Mandel A鹽10%，Mandel B鹽1%，pH6.0Mandel A鹽：KH2PO42g/L，（NH4）2SO41.4g/L，MgSO40.3g/L，CaCl20.3g/L；MandelB鹽：FeSO45mg/L，MnSO41.6mg/L，ZnSO4·7H2O 1.4mg/L，CoCl 2mg/L。

2.3 篩選

2.3.1 初篩。樣品制成懸浮液經(jīng)75℃高溫富集后，將樣品懸浮液制成不同稀釋度的菌液并涂布于馴化培養(yǎng)基平板上，倒置于75℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。將形態(tài)特征不同的菌落挑出，再次在馴化培養(yǎng)基平板上經(jīng)過5次劃線純化，分離得到耐高溫純菌株。將分離得到的耐高溫菌株分別接種至纖維素剛果紅培養(yǎng)基、淀粉選擇培養(yǎng)基、蛋白選擇培養(yǎng)基中，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明水解圈。若出現(xiàn)透明水解圈說明該種底物已經(jīng)被水解，菌株具有降解該種底物的能力。

2.3.2 復(fù)篩。將初篩得到的菌株接種至纖維素、淀粉、蛋白液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，75℃靜止培養(yǎng)72h后，取發(fā)酵液6 000rpm離心8min，得到粗酶液。分別用DNS法、改良的Yoo法和福林試劑法測(cè)定菌株的纖維素酶活力、淀粉酶活力和蛋白酶活力。

2.4 應(yīng)用

2.4.1 發(fā)酵底物與堆積發(fā)酵。選擇通透性強(qiáng)、吸濕性好的木屑、稻殼，與糞污進(jìn)行重量比3：7進(jìn)行混合堆積，高度為1 m。添加復(fù)篩獲得的粗酶液后進(jìn)行混合攪拌，每隔12h進(jìn)行翻堆操作，連續(xù)監(jiān)測(cè)7d床體20 cm處溫度。

2.4.2 發(fā)酵效果分析。對(duì)復(fù)篩獲得菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后噴曬至糞污中，按2.4.1方式進(jìn)行接種發(fā)酵處理，對(duì)高溫發(fā)酵后30d的糞肥進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)測(cè)定，有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀法測(cè)定，TN采用凱氏定氮法測(cè)定，TP采用鉬黃比色法測(cè)定，K元素測(cè)定：用硝酸：高氯酸=4：1在130℃～200℃條件下消煮，采用ICP-MS電感耦合等離子體質(zhì)譜儀感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定。

3 結(jié)果

3.1 高溫發(fā)酵菌酶活力測(cè)定結(jié)果

樣品經(jīng)80℃高溫富集培養(yǎng)后，10個(gè)樣品中分離得到9株耐高溫細(xì)菌。經(jīng)選擇性培養(yǎng)基篩選，其中5株細(xì)菌具有降解至少一種底物的能力，分別命名為GW01—GW 05，將5株菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定粗酶液纖維素、蛋白、淀粉酶活，酶活力測(cè)定結(jié)果見表1。如表1所示，篩選獲得的GW03菌種的纖維素酶活力及淀粉酶活力在5株菌種中屬最優(yōu)，GW02菌種的蛋白酶活力最優(yōu)。

表1 酶活力測(cè)定結(jié)果

3.2 不同高溫發(fā)酵菌劑的堆肥過程溫度特性

如表2所示，GW03菌種在堆肥發(fā)酵過程中2d達(dá)到70℃，與其他篩選菌種相比，最高溫度達(dá)79.1℃；GW05菌種3d達(dá)到70℃，與其他篩選菌種相比，最高溫度持續(xù)17d。

表2 不同高溫發(fā)酵菌劑的堆肥過程溫度特性

3.3 不同高溫發(fā)酵菌劑處理豬糞污腐熟糞肥營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比較

如表3所示，不同高溫發(fā)酵菌劑處理豬糞污后形成的腐熟糞肥中，GW04菌種有機(jī)質(zhì)、氮素、P2O5含量最高，其中有機(jī)質(zhì)、氮素含量與其他四種菌種相比，差異顯著（P＜0.05）；GW02、GW04菌種處理豬糞污后形成的腐熟糞肥中，K2O含量最高，與其他三種菌種相比，差異顯著（P＜0.05）。

表3 不同高溫發(fā)酵菌劑處理豬糞污后腐熟糞肥營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比較

4 討論

菌劑對(duì)糞污處理時(shí)發(fā)酵溫度的影響是評(píng)價(jià)糞污處理效果的重要指標(biāo)之一，溫度過低或高溫持續(xù)時(shí)間太短，糞污不能完全腐熟，同時(shí)不能有效地殺死糞污中的病原菌。相關(guān)研究表明[4-5]，添加復(fù)合腐解菌劑可以加速堆體升溫，并可以維持較長(zhǎng)的高溫期。本研究從高溫堆積發(fā)酵的糞污中分離篩選耐高溫發(fā)酵菌種并擴(kuò)培制成混合菌劑，進(jìn)行糞污堆積發(fā)酵試驗(yàn)，得到的高溫發(fā)酵菌劑在豬糞污堆肥發(fā)酵過程中2d即達(dá)到70℃，最高溫度可達(dá)79.1℃，最高溫度持續(xù)17d，表明本文所述的高溫菌種篩選方法和糞污發(fā)酵方案可以用于豬糞污快熟處理。

氮素是微生物生長(zhǎng)代謝的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，氮素含量的改變能顯著影響糞污腐熟效率。本研究分離篩選到的耐高溫發(fā)酵菌種GW04進(jìn)行糞污堆積發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)腐熟后的糞肥中有機(jī)質(zhì)、氮素含量顯著高于其他四種菌種，這一結(jié)果與張雪辰[6]、李敬波[7]相似，表明本文所述篩選方法篩選到的高溫發(fā)酵菌劑對(duì)熟化后的糞肥含氮量有明顯提升作用，保氮效果好，一定程度上減少N損失，減輕N素外排造成的環(huán)境脅迫。