夏景富，龍明豪，吳曉勇

(1.貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 苗醫(yī)藥科，貴州 貴陽 550001； 2.貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 風濕血液科，貴州 貴陽 550001)

黑骨藤是貴州常用苗藥，為蘿藦科杠柳屬植物西南杠柳(PeriplocaforresttiSchltr)的干燥根或全株，性溫，味辛、苦，具有祛風除濕、活血消癰的功效，常用于治療風濕痹痛、跌打損傷等癥[1-2]。黑骨藤主要含有強心苷類、C21甾類，以及黃酮類、三萜類、香豆素類等成分[3]，現代藥理研究表明黑風藤具有抗炎鎮(zhèn)痛[4]、強心[5]、抗腫瘤[6]等活性。

類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、炎癥性的自身免疫性疾病，其典型特征為滑膜炎、滑膜細胞增生以及軟骨組織損傷等[7]。中醫(yī)認為RA屬于“痹證”“頑痹”范疇，在治療中主要使用祛風通絡、清熱除濕、活血化瘀、化痰散結等藥物[8]。近年來，黑骨藤被廣泛應用于RA的治療。據報道，黑骨藤治療RA的活性部位為黃酮類與苷類[9]，但活性成分尚不明確。此外，文獻研究表明黑骨藤治療RA的作用機制與調節(jié)免疫器官功能及下調促炎因子水平有關[10]，但具體的作用機制還有待進一步研究。本研究將采用網絡藥理學的方法預測黑骨藤治療RA的有效成分及作用機制，以期為黑骨藤的深入研究及其臨床應用提供參考。

1 方法

1.1 數據庫及軟件

中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺(TCMSP)、Swiss Target Prediction、Genecards、David數據庫、人類基因和基因表型綜合數據庫(OMIM)、KEGG信號通路、PPI、Cytoscape 3.6.1軟件、String數據庫。

1.2 活性成分篩選

在CNKI、PubMed、《中華本草：苗藥卷》、《中藥大辭典》、《中草藥匯編》、TCMSP中檢索黑骨藤中含有的全部化學成分。將ADME參數OB≥30%及DL≥0.15作為篩選標準。

1.3 藥物靶點的篩選

通過TCMSP數據庫和Swiss Target Prediction數據庫，篩選黑骨藤活性成分的作用靶點，共得603個靶點，建立成分靶點數據集。

1.4 疾病靶點篩選

在Genecards數據庫、OMIM數據庫中，檢索與RA相關的基因及蛋白靶點4 157個，建立疾病靶點數據集。

1.5 收集疾病相關基因

在Genecards、OMIM數據庫中，檢索與APL相關的基因及蛋白靶點，建立疾病靶點數據集。將成分靶點數據集與疾病靶點數據集進行映射，繪制韋恩圖，取兩個數據集的交集，即為黑骨藤治療RA的共同靶點。

1.6 網絡構建與分析

在Cytoscape 3.6.1軟件中導入黑骨藤活性成分及成分-疾病共同靶點數據，構建“藥物-成分-疾病-靶點”網絡，網絡圖中的節(jié)點代表藥物、活性成分、疾病或靶點，邊表示節(jié)點之間的相互關系。對網絡圖進行可視化分析，以Degree、Betweenness centrality、Closeness centrality三個拓撲參數值為標準篩選黑骨藤治療RA的關鍵靶點。在String數據庫中導入關鍵靶點，構建PPI網絡圖。

1.7 關鍵靶點GO、KEGG通路富集分析

利用KEGG信號通路數據庫中的KEGG Mapper功能分析與疾病密切相關的信號通路上的關鍵靶點，在David數據庫作關鍵靶點的GO、KEGG通路富集分析。

2 結果

2.1 活性成分篩選

通過查閱文獻，篩選黑骨藤的活性化學成分結果見表1。黑骨藤治療RA的活性成分主要為甾類(如杠柳毒甙、胡蘿卜甙、β-谷甾醇等)與萜類(熊果酸、齊墩果酸等)。此外，還有少量黃酮類(如山奈酚)與多酚類(咖啡酸乙酯)等。

表1 黑骨藤活性化學成分

2.2 成分靶點與疾病靶點收集

將藥物靶點與疾病靶點映射取交集，繪制韋恩圖，得到352個共同靶點，見圖1。利用String數據庫對韋恩圖中的352個共同靶點進行蛋白互作關系分析，構建PPI網絡圖，見圖2。

圖1 黑骨藤-類風濕性關節(jié)炎靶點韋恩圖

圖2 關鍵靶點PPI網絡圖

2.3 網絡構建與分析

將藥物靶點與疾病靶點導入Cytoscape 3.6.1軟件，構建“藥物-成分-疾病-靶點”網絡圖，見圖3。圖中菱形表示靶點，多邊形表示疾病，三角形表示有效成分，橢圓形表示藥物。對該網絡圖進行可視化分析，選擇Degree、Betweenness centrality、Closeness centrality三個拓撲參數均大于各自中位數值的靶點作為關鍵靶點，表2展示了Degree值靠前的10個核心靶點拓撲數值，Degree值越高，靶點與疾病的關聯(lián)性越大。

圖3 “藥物-成分-疾病-靶點”網絡圖

表2 核心靶點相關拓撲參數

2.4 關鍵靶點GO和KEGG分析

在David數據庫中對核心靶點進行GO生物學過程分析及KEGG通路富集分析，以P≤0.01(P值越小顯著性越高)作為篩選標準，顯著性最高的前10個生物學過程及通路結果見表3、表4。GO生物過程主要包括PI3K信號通路的調控、抑制細胞凋亡、促進NO合成、血小板激活等。KEGG通路富集結果顯示，黑骨藤治療RA的靶點主要富集在癌癥相關通路、PI3K-AKT、ErbB、催乳素、雌激素、HIF-1等信號通路。

表3 GO生物學過程分析結果

表4 KEGG通路富集分析結果

2.5 構建通路圖

利用KEGG數據庫的KEGG Mapper功能，將核心靶點標注在與疾病密切相關的信號通路上，見圖4。藥物-疾病的共同靶點352個，如AKT1、IL-6、VEGF、MAPK3等，涉及細胞凋亡、一氧化氮(NO)合成、血小板激活、蛋白磷酸化、細胞增殖、T細胞聚集等多個GO生物過程，以及PI3K-AKT、ErbB、催乳素、雌激素、VEGF等多個信號通路。

圖4 核心靶點在疾病相關信號通路上的標注圖

3 討論

本次研究應用網絡藥理學方法，預測黑骨藤治療RA的活性部位集中在甾類、萜類、黃酮類，包含杠柳毒甙、蘿藦甙元、熊果酸、胡蘿卜甙等10種活性成分。藥物-疾病的共同靶點352個，如AKT1、IL-6、VEGF、MAPK3等，核心靶點主要富集在PI3K/AKT、ErbB以及催乳素、雌激素信號通路。其中PI3K信號通路主要參與調控及抑制細胞凋亡、促進NO合成、血小板激活、促進蛋白磷酸化、促進細胞增殖、T細胞聚集等GO生物過程，其分子功能涉及蛋白激酶活性的激活、蛋白與酶的結合、ATP結合、蛋白激酶間的結合、轉錄因子結合、MAP激酶活性的激活等。

PI3K/AKT通路是參與細胞間信號傳遞的重要通路，對細胞增殖、凋亡等具有調控作用。而RA的病理變化包括滑膜炎癥、軟骨破壞與骨侵蝕、血管翳等，在這些病理過程中，PI3K/AKT可通過調節(jié)促炎因子水平而介導炎癥反應，還可刺激TNF-α及IL-7等因子水平促進破骨細胞的生成、分化、遷移，最終破壞軟骨與骨質，進一步加重RA。此外，PI3K/AKT通路還可通過調節(jié)HIF-1α及VEGF水平，促進RA血管生成，抑制滑膜對骨頭的營養(yǎng)供給，同時釋放多種炎癥因子與蛋白水解酶對關節(jié)軟骨等組織進行破壞，使得RA病情加重[11]。ErbB基因與多種自身免疫性疾病的易感性有關[12]，還參與腫瘤細胞的形成、遷移、入侵、擴散及增殖的各項過程[13]，但該靶點與RA的關聯(lián)鮮有文獻報道。催乳素與RA疾病嚴重程度具有一定相關性，其可激活MAPK信號通路從而促進IL-6的分泌[14]。RA的發(fā)生發(fā)展與雌激素水平也有一定關系，與正常人群相比，RA患者體內雌激素顯著升高，雌激素還可延緩粒細胞凋亡進程，促進嗜酸性粒細胞浸潤，并促進中性粒細胞分泌NO，增強抗炎作用[15]。雌激素可通過MAPK通路促進CD40的表達，從而參與到炎癥反應的調控中[16]。此外，雌激素還可通過調節(jié)CD16的表達影響單核巨噬細胞釋放細胞因子、調節(jié)IL-2影響T細胞的耐受與分化，促進Th2細胞的免疫應答，破壞Th1/Th2平衡，促進IL-4、IL-5、IL-12等因子的表達[17-19]。有研究表明，黑骨藤可能通過抑制MAPK通路、降低NF-κB活性、抑制炎癥反應從而發(fā)揮抗RA活性[20]。

本研究采用網絡藥理學的研究方法分析了黑骨藤治療RA的作用機制，預測了黑骨藤治療RA的有效成分及其關鍵靶點、作用通路，體現了多成分、多靶點、多通路的作用特點，為黑骨藤治療RA的作用機制研究提供了一定參考，今后可深入研究以上核心靶點及作用通路，進一步明確黑骨藤治療RA的作用機制。