胡子毅，張 平，李人亮，易 瑩，賴俊宇，陳麗莎

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 急診科，江西 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330004；3.江西中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330004；4.江西中醫(yī)藥大學(xué) 心血管病科，江西 南昌 33006)

痛風(fēng)是由單鈉尿酸鹽(MSU)沉積所致的晶體相關(guān)性關(guān)節(jié)病，與嘌呤代謝紊亂和(或)尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥直接相關(guān)，特指急性特征性關(guān)節(jié)炎和慢性痛風(fēng)石疾病，主要包括急性發(fā)作性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)石形成、痛風(fēng)石性慢性關(guān)節(jié)炎、尿酸炎腎病和尿酸性尿路結(jié)石，重者可出現(xiàn)關(guān)節(jié)殘疾和腎功能不全[1-2]。原發(fā)性痛風(fēng)的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，發(fā)病多與遺傳和環(huán)境因素相關(guān)。在我國(guó)各地區(qū)痛風(fēng)的患病率為0.03%～10.47%[3]。目前臨床上對(duì)此病的干預(yù)主要依靠使用藥物和飲食控制相配合，嚴(yán)重者需行手術(shù)治療[4]。

消痛湯系蔣小敏教授治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的經(jīng)驗(yàn)方，其藥物組成：炒杜仲30 g，粉萆薢15 g，白術(shù)10 g，百合25 g，漢防己10 g，金錢草15 g，車前草15 g，威靈仙20 g土茯苓10 g，黃柏10 g，牡丹皮10 g，伸筋草15 g，忍冬藤30 g，生甘草6 g[5]。本課題組曾運(yùn)用消痛湯加味對(duì)40例急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者進(jìn)行臨床研究，結(jié)果表明消痛湯治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎具有較好的療效，且具有一定的降尿酸作用[6]。但由于中藥復(fù)方具有成分復(fù)雜和作用機(jī)理不清楚的特點(diǎn)，因此本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法來(lái)探尋消痛湯中治療痛風(fēng)可能存在的關(guān)鍵活性成分和作用機(jī)制。

1 研究?jī)?nèi)容與方法

1.1 消痛湯活性成分的獲取及靶點(diǎn)篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)對(duì)消痛湯中中藥的全部化學(xué)成分進(jìn)行收集，通過(guò)限制口服吸收利用度(OB≥30%)、藥物相似性(DL≥0.18)對(duì)中藥的活性成分進(jìn)行篩選[7]。然后將篩選好的候選活性成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和SwissTarget Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//swisstargetprediction.ch/)中收集蛋白靶點(diǎn)。最后通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.uniprot.org/)進(jìn)一步將收集到的蛋白靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的基因名稱，獲取與活性成分作用相關(guān)的蛋白靶點(diǎn)(人源)。

1.2 痛風(fēng)的靶點(diǎn)篩選

以“gout”“gouty”“Acute Gouty Arthritis”為關(guān)鍵詞，在Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//omim.org/)、PharmGkb數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.pharmgkb.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.drugbank.ca/)中進(jìn)行檢索，收集痛風(fēng)的相關(guān)基因。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將獲取到消痛湯活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與痛風(fēng)疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行Venn(維恩)分析，篩選出“藥物-疾病”的交集基因。應(yīng)用Cytoscape 3.8.0 軟件構(gòu)建消痛湯的“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，探究消痛湯活性成分和相關(guān)靶點(diǎn)的相互作用。然后從Tools工具欄中“NetworkAnalyzer”模塊選擇Analyze Network功能，對(duì)藥物進(jìn)行拓?fù)浞治觥Ｔ赟tring 數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//stringdb.org/)，通過(guò)交集得到的靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。物種設(shè)為“Homo sapiens” (人類)，最低相互作用閾值設(shè)為最高置信度0.9 “highest confidence”，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。然后把PPI網(wǎng)絡(luò)計(jì)算出的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件，利用其Apps工具欄中的CytoNCA功能對(duì)其進(jìn)行打分，篩選出核心基因。

1.4 基因本體論(GO)與京都基因和基因組百科全書(shū)(KEGG)富集分析

應(yīng)用 R 4.0.2軟件中的BiocManager軟件包對(duì)上述交集基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選及靶點(diǎn)篩選

本研究中通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得消痛湯中杜仲、粉萆薢、白術(shù)、百合、防己、金錢草、車前草、威靈仙、土茯苓、黃柏、牡丹皮、伸筋草和甘草13味藥物中的化學(xué)成分，通過(guò)限定OB≥30%和DL≥0.18進(jìn)行篩選，共得到234個(gè)活性成分，其中杜仲28個(gè)、粉萆薢2個(gè)、白術(shù)7個(gè)、百合7個(gè)、防己3個(gè)、金錢草10個(gè)、車前草10個(gè)、威靈仙7個(gè)、土茯苓15個(gè)、黃柏37個(gè)、牡丹皮11個(gè)、伸筋草5個(gè)和甘草92個(gè)。剔除未找到靶點(diǎn)的化學(xué)成分后，共得到156個(gè)，見(jiàn)表1。

表1 消痛湯“中藥-活性成分-預(yù)測(cè)靶標(biāo)”信息

2.2 疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果

通過(guò)Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)、PharmGkb數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)和DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出與痛風(fēng)疾病相關(guān)基因830個(gè)。

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與結(jié)果分析

將所得到的溫膽湯的藥物靶點(diǎn)與痛風(fēng)疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到146個(gè)共有靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。借助Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。對(duì)藥物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩赃M(jìn)行分析，篩選出度值與介數(shù)均大于平均值的化合物，結(jié)果篩選出槲皮素、山柰酚、木樨草素、柚皮素、吳茱萸次堿等15種化合物，提示這些成分可能是消痛湯治療痛風(fēng)疾病的主要活性成分，見(jiàn)表2。利用String數(shù)據(jù)庫(kù)將映射所得的146個(gè)靶點(diǎn)制作成 PPI 網(wǎng)絡(luò)，限定其置信度為0.9，其產(chǎn)生相互作用的網(wǎng)絡(luò)有142個(gè)節(jié)點(diǎn)、558條邊，平均節(jié)點(diǎn)度：7.86，平均局部聚類系數(shù)：0.526，見(jiàn)圖 3。應(yīng)用Cytoscape軟件的Apps工具欄中的CytoNCA功能對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出12個(gè)核心基因，即TNF、IL1B、IL6、IL10、CCL2、CCL5、TIMP1、STAT3、CXCL1、PF4、CXCL8、VEGFA，說(shuō)明這12個(gè)基因可能是消痛湯治療痛風(fēng)的關(guān)鍵靶標(biāo)，見(jiàn)圖4。

圖1 消痛湯與痛風(fēng)的共有靶點(diǎn)

注：靶點(diǎn)；○成分。分別代表：1.白術(shù)；2.車前草；3.杜仲；4.防己；5.粉萆薢；6.甘草；7.黃柏；8.金錢草；9.牡丹皮；10.伸筋草；11.土茯苓；12.威靈仙

表2 化合物拓?fù)浞治鼋Y(jié)果

圖 3 消痛湯治療痛風(fēng)疾病的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖 4 PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因

2.4 GO和KEGG通路富集分析

應(yīng)用R軟件的BiocManager軟件包對(duì)消痛湯治療痛風(fēng)的交集基因進(jìn)行GO分類富集和 KEGG通路富集分析。依據(jù)P<0.05 進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，其中富集靶標(biāo)越多、P值越小的通路，與消痛湯治療痛風(fēng)的關(guān)系越密切，分別篩選出前10條GO條目和前20條KEGG通路。GO分類富集分析包括細(xì)胞組分(cellular component，CC)、生物過(guò)程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)3個(gè)部分。通過(guò)GO分類富集分析確定了2 319個(gè)條目，其中涉及生物過(guò)程2 160條，主要參與對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)、細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控、肽基-酪氨酸磷酸化的正調(diào)控、肽分泌的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)、蛋白質(zhì)分泌的調(diào)節(jié)、受體信號(hào)通路通過(guò)JAK-STAT的正調(diào)控等；涉及細(xì)胞組分44條，主要包括質(zhì)膜的外側(cè)面、囊腔、分泌顆粒腔、胞質(zhì)小泡腔、血小板α顆粒管腔、血小板α顆粒、含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔、MHC蛋白復(fù)合物、三級(jí)顆粒腔等；涉及分子功能114條，主要包括受體配體活性、信號(hào)受體激活劑活性、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、氧化還原酶活性、類固醇羥化酶活性、生長(zhǎng)因子活性、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合、血紅素結(jié)合等，見(jiàn)圖5。通過(guò)KEGG 通路富集分析，找到了112條信號(hào)通路，主要包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體間質(zhì)、炎癥性腸病、IL-17信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路、結(jié)核病、美洲錐蟲(chóng)病、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用、甲型流感、JAK-STAT信號(hào)通路、人巨細(xì)胞病毒感染、利什曼病、Th17細(xì)胞分化、NOD樣受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、弓形蟲(chóng)病、瘧疾、百日咳、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路、阿莫伊比阿斯病、NF-κB信號(hào)通路、化學(xué)致癌作用、HIF-1信號(hào)通路等，見(jiàn)圖6。

圖 5 GO分類富集分析結(jié)果

3 討論

本研究篩選出消痛湯與痛風(fēng)疾病的交集基因有146個(gè)，構(gòu)建出藥物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖后，通過(guò)拓?fù)浞治稣页鲩纹に?、山柰酚、木樨草素?5種主要活性成分。黃嘌呤氧化酶(XOD)是人體內(nèi)產(chǎn)生尿酸的關(guān)鍵酶，其抑制劑可用于治療高尿酸血癥和痛風(fēng)，研究表明槲皮素對(duì)XOD催化的尿酸和超氧陰離子自由基(O2-)的生成有可逆性抑制作用[8-9]。ARSHAD MEHMOOD等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在黃酮類化合物中木犀草素和黃芩素具有較強(qiáng)的抑制作用，黃酮醇類化合物中山奈酚、槲皮素、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷具有抑制作用。尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(URAT1)是一種生理上重要的腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在尿酸鹽重吸收中起重要作用[11]。沈瑞明等[12]研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可通過(guò)下調(diào)TLR/MyD88/NF-κB通路減輕急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)。YU TOYODA等[13]研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素對(duì)URAT1具有強(qiáng)烈的抑制作用，能降低尿酸鹽相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

圖 6 KEGG通路富集分析結(jié)果

本研究將146個(gè)藥物-疾病交集基因構(gòu)建出PPI網(wǎng)絡(luò)，再根據(jù)CytoNCA功能篩選出了IL1B、IL6、TNF等12個(gè)核心基因。晶體相關(guān)的關(guān)節(jié)疾病通常與全身炎癥癥狀有關(guān)[14]。全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)表明，高尿酸血癥的遺傳基礎(chǔ)是由含尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因座主導(dǎo)的，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了腎臟和腸道排泄尿酸鹽的過(guò)程；候選基因研究已經(jīng)檢測(cè)到編碼影響NLRP3(NOD-，LRR-和含吡啶多聚體-3)炎癥體的激活和活性的基因與痛風(fēng)的關(guān)聯(lián)[15]。白細(xì)胞介素-1β(IL1B)在痛風(fēng)的炎癥發(fā)生過(guò)程中起重要作用，并且已知在MSU晶體刺激后，從巨噬細(xì)胞中大量釋放[16]。內(nèi)源性細(xì)胞因子IL-6參與MSU介導(dǎo)的NLRP3炎性小體活化和隨后的先天免疫細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β，并且在MSU晶體誘導(dǎo)的滑膜炎癥中起關(guān)鍵作用。腫瘤壞死因子(TNF)在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，其機(jī)制包括誘導(dǎo)IL-1活化、增強(qiáng)白細(xì)胞介素-6(IL-6)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、激活核因子(NF-κB)炎癥信號(hào)通路、參與慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的骨骼破壞與侵蝕，以及與中性粒細(xì)胞的相互作用[17]。

本研究通過(guò)KEGG通路富集分析找到了與痛風(fēng)密切相關(guān)的信號(hào)通路，如IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、NOD樣受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、NF-kB信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等。這些通路在痛風(fēng)的炎癥發(fā)生以及代謝性障礙中起重要作用。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)消痛湯治療痛風(fēng)進(jìn)行了分析，初步揭示了消痛湯治療痛風(fēng)的潛在活性成分、作用網(wǎng)絡(luò)和潛在作用機(jī)制，為進(jìn)一步探討其發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制提供了研究方向，其后續(xù)研究尚需系統(tǒng)的靶點(diǎn)驗(yàn)證和體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)其功效網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)在關(guān)聯(lián)和作用靶點(diǎn)集合。