周麗萍，韓 嘯，李曉晨，丁昕瑤，包永睿，李 鑫，趙 琳*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600；2.朝陽(yáng)市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，遼寧 朝陽(yáng) 122000)

白花敗醬草(Patriniavillosa(Thunb.)Juss.)始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是敗醬科敗醬屬植物，其性味苦、寒、無(wú)毒，具清熱利濕、活血化瘀、清心安神等功效[1]，臨床上常用于治療潰瘍性結(jié)腸炎、慢性胃炎、腫瘤等疾病[2]。白花敗醬草主要含有黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)、酚酸類(lèi)等多種成分，除抗炎、抗菌、鎮(zhèn)靜等藥理作用外還具有抗腫瘤活性，但其具體活性成分尚不清晰。中藥譜效關(guān)系研究是指將中藥指紋圖譜技術(shù)與藥效學(xué)相結(jié)合[3-6]，通過(guò)灰色關(guān)聯(lián)度分析[7]、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、偏最小二乘回歸分析[8-10]等系統(tǒng)揭示中藥藥效活性成分，為中藥的藥效物質(zhì)研究起到了基礎(chǔ)性作用[11-12]。

本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法測(cè)定白花敗醬草不同極性部位成分對(duì)人腸癌細(xì)胞Caco-2抑制作用，通過(guò)比較后發(fā)現(xiàn)白花敗醬草總黃酮純化物對(duì)腸癌細(xì)胞Caco-2的抑制作用最好。采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，建立白花敗醬草總黃酮純化物總離子流圖譜，同時(shí)，通過(guò)灰色關(guān)聯(lián)分析及偏最小二乘回歸分析方法篩選白花敗醬草抗腸腫瘤活性成分[13]，為進(jìn)一步探討白花敗醬草藥材的藥效活性物質(zhì)配伍提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 1290型快速高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；Agilent Q-TOF-MS質(zhì)譜 (安捷倫科技有限公司)；酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；冷凍離心儀(美國(guó)Thermo公司)；US AUTOFLOW型CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)NUAIRE公司)。

1.2 試劑與藥材

質(zhì)譜級(jí)甲醇、乙腈 (德國(guó)Merck KGaA公司)；純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；質(zhì)譜級(jí)甲酸(美國(guó)Thermo公司，批號(hào)：141831A)；乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇 (天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；胎牛血清(上海Excell Bio公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；EDTA (天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司)；青霉素(國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司)；鏈霉素(大連美羅大藥廠(chǎng))；碳酸氫鈉，氯化鈉，氯化鉀，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鈉均為分析級(jí)別。蘆丁(批號(hào)：18012310)；芹菜素(批號(hào)：17011701)；異葒草苷(批號(hào)：140329)；槲皮素(批號(hào)：17121531)；野黃芩苷(批號(hào)：17212722)；咖啡酸(批號(hào)：17122804)；綠原酸(批號(hào)：110753-200413)；阿魏酸(批號(hào)：17120702)；異牡荊苷(批號(hào)：130924)；木犀草素(批號(hào)：17120702)；金合歡素(批號(hào)：17102401)；對(duì)照品均購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度≥98%；敗醬草飲片(批號(hào)：20140501)，亳州市中亳中藥飲片廠(chǎng)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)許亮教授鑒定為白花敗醬Patriniavillosa(Thunb).Juss.的干燥全草)。

1.3 細(xì)胞株

人腸癌細(xì)胞株Caco-2，購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 白花敗醬草提取液制備

稱(chēng)取藥材適量，以15倍量，60%乙醇回流提取3次，放冷，濾過(guò)，合并提取液，回收乙醇至無(wú)醇味，加純水稀釋至濃度為0.1 g(生藥量)·mL-1溶液，備用。

2.1.1 不同極性白花敗醬草提取物的制備 量取100 mL白花敗醬草提取液，采用HPD-300樹(shù)脂進(jìn)行純化，收集洗脫液，40 ℃真空旋蒸至濃稠，70 ℃水浴蒸干即得白花敗醬草總黃酮純化物[14]。精密稱(chēng)取白花敗醬草總黃酮純化物5 mg，用甲醇定容至10 mL容量瓶?jī)?nèi)，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，濃縮至10 mL，得到白花敗醬草總黃酮純化物溶液。

再分別量取5份100 mL白花敗醬草提取液，其中一份置于燒杯內(nèi)，水浴濃縮至10 mL，其余4份分別置于分液漏斗中，各加入1∶1(v/v)的乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇，輕輕振蕩搖勻，靜置分層，取上層溶液，水浴濃縮至10 mL。

上述6份濃縮液均置于-80 ℃ 冰箱內(nèi)冷凍24 h，取出迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的凍干儀中，凍干24 h，分別得到白花敗醬草全成分、總黃酮純化物、乙醚層、二氯甲烷層、正丁醇層、乙酸乙酯層的凍干粉，備用。

2.2 白花敗醬草不同極性部位抗腸腫瘤體外藥效實(shí)驗(yàn)

2.2.1 含藥培養(yǎng)基制備 精密稱(chēng)定不同極性部位的白花敗醬草提取物，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基為溶劑制成濃度為1.0 mg·mL-1的溶液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

2.2.2 Caco-2腫瘤細(xì)胞抑制試驗(yàn) 取人腸癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞株，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)SOP規(guī)定，按常規(guī)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法，于DMEM高糖培養(yǎng)基中(含有10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素)，在溫度37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，每2～3天換液1次。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人腸癌細(xì)胞Caco-2，經(jīng)PBS清洗，胰酶消化后于細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，加培養(yǎng)液稀釋至細(xì)胞濃度為5×104個(gè)·mL-1。接種于96孔板，每孔各100 μL，待細(xì)胞密度增加至孔板面積的70 %左右時(shí)棄去上清液，分別設(shè)置給藥孔，空白孔(加細(xì)胞但不加藥物)，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。給藥孔加入含1.0 mg·mL-1敗醬草不同極性部位提取物的藥物培養(yǎng)液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后100 μL的10%CCK-8溶液，輕輕搖勻，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后置于酶標(biāo)儀內(nèi)檢測(cè)，波長(zhǎng)為450 nm，記錄每孔吸光度A。

表1 不同極性部位敗醬草成分對(duì)人腸癌細(xì)胞 Caco-2抑制率

2.3 白花敗醬草總黃酮純化物圖譜的建立

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent poroshell 120 SB-C18色譜柱(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)，流動(dòng)相A為0.1%甲酸水，B為乙腈：甲醇(95∶5)，梯度洗脫，0～20 min，5%～100%(B)，流速0.8 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量0.8 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(Dual AJS ESI)，采用正、負(fù)離子模式測(cè)定，毛細(xì)管電壓(Vcap)為4 000 V，干燥氣體溫度(Drying Gas Temp)為250 ℃，鞘氣溫度(Sheath Gas Temp)為350 ℃，干燥氣體流速(Drying Gas Flow)為13 L·min-1，鞘氣流速(Sheath Gas Flow)為11 L·min-1，霧化器壓力(Neulizer pressure)為45psig，碎裂電壓(Fragmentor)為125 V，質(zhì)量范圍(Mass Range)為100～1 500m/z，碰撞能量20 eV，40 eV。

2.3.3 供試品溶液制備 精密稱(chēng)取白花敗醬草總黃酮純化物的凍干粉20 mg，置于10 mL量瓶?jī)?nèi)，甲醇超聲溶解，稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

2.3.4 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取上述對(duì)照品各適量，分別置10 mL棕色量瓶?jī)?nèi)，加入甲醇溶解定容，制成每1 mL含有0.1 mg的溶液即得。

2.4 方法學(xué)考察

按“2.1”項(xiàng)下方法，“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行方法學(xué)考察，精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性RSD值均小于3.0%，表明該方法可行。

2.5 主要色譜峰篩選

精密吸取白花敗醬草總黃酮純化物溶液0.8 μL，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，得到白花敗醬草黃酮部位組分圖譜，從色譜圖中篩選出分離度與對(duì)稱(chēng)性較好的24個(gè)色譜峰，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 白花敗醬草黃酮部位總離子流

2.6 灰色關(guān)聯(lián)度分析

根據(jù)白花敗醬草總黃酮純化物的指紋圖譜，從中篩選出分離度較好的色譜峰。首先將影響整體行為的數(shù)據(jù)進(jìn)行分列，以反映系統(tǒng)藥效行為特征的數(shù)據(jù)序列為參考數(shù)列，以影響系統(tǒng)藥效行為的因素?cái)?shù)據(jù)序列(白花敗醬草黃酮部位提取物的不同峰面積經(jīng)歸一化處理)為比較數(shù)列，即子系列。采用灰色關(guān)聯(lián)度分軟件(Grey ModeLing_V3.0)進(jìn)行分析，根據(jù)灰色相對(duì)關(guān)聯(lián)度的計(jì)算公式進(jìn)行計(jì)算，得出不同極性藥材色譜峰與體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 敗醬黃酮部位純化物的色譜峰峰面積以及關(guān)聯(lián)系數(shù)

2.7 偏最小二乘回歸分析

為了進(jìn)一步明確白花敗醬草化學(xué)成分和藥效之間的相關(guān)性，本研究以歸一化后的24個(gè)主要色譜峰為自變量(X)，藥效數(shù)據(jù)為因變量(Y)，對(duì) 1.0 mg·mL-1給藥濃度時(shí)的數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘回歸分析(PLS)，所得擬合模型前5個(gè)潛在因子累計(jì)可以解釋自變量100%的信息，解釋因變量100%的信息，說(shuō)明潛在因子的信息綜合解釋能力較好?；貧w系數(shù)結(jié)果見(jiàn)圖2。1.0 mg·mL-1給藥濃度時(shí)得到方程：Y=0.139-0.081X1+0.039X2-0.025X3-0.000X4-0.052X5-0.026X6+0.06X7+0.008X8+0.020X9+0.085X10-0.026X11-0.002X12-0.026X13-0.024X14+0.052X15-0.047X16-0.031X17+0.053X18+0.013X19+0.012X20-0.051X21-0.006X22-0.009X23+0.085X24，其中回歸系數(shù)的正、負(fù)代表各成分對(duì)抗腸腫瘤的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，回歸系數(shù)絕對(duì)值越大，表明該自變量對(duì)癌細(xì)胞影響越大。綜合累積變量重要性結(jié)果，可見(jiàn)2、7、8、9、10、15、18、19、20、24號(hào)共10個(gè)色譜峰對(duì)藥效貢獻(xiàn)起到正向促進(jìn)作用。

圖2 1.0 mg·mL-1 給藥濃度標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)

3 討論

中藥所含化學(xué)成分種類(lèi)繁多，基于譜效關(guān)系研究是最常用的方法之一。本實(shí)驗(yàn)對(duì)白花敗醬草黃酮部位純化物開(kāi)展抗腸腫瘤活性成分篩選研究，篩選出的24個(gè)化合物對(duì)腸

癌細(xì)胞Caco-2均具有一定的抑制作用。指紋圖譜與藥效灰色關(guān)聯(lián)度結(jié)果顯示，24個(gè)色譜峰與藥效的關(guān)聯(lián)度為0.639 8～0.965 7，表明各成分與藥效的關(guān)聯(lián)度相差不大，顯示白花敗醬草發(fā)揮抗腫瘤功效是其有效物質(zhì)成分群共同作用的結(jié)果。相關(guān)系數(shù)大于0.8的色譜峰有9個(gè)，分別為7、10、15、18、19、20、21、22、24號(hào)色譜峰，相關(guān)排序?yàn)?4t h>10 th>20 th>15 >18 th>7 th>19 th>22 th>21 th。從灰色關(guān)聯(lián)度分析的結(jié)果得出這9個(gè)活性成分對(duì)抑制腸癌細(xì)胞增殖起到重要的作用，進(jìn)一步說(shuō)明白花敗醬草發(fā)揮藥效是其多種成分共同作用的結(jié)果。同時(shí)應(yīng)用偏最小二乘回歸分析法，按照回歸系數(shù)絕對(duì)值大小排序，可知各成分對(duì)腸癌細(xì)胞Caco-2抑制作用的影響由大到小依次為：峰 2、7、8、9、10、15、18、19、20、24。

通過(guò)兩種分析方法篩選色譜峰求交集，通過(guò)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)以及文獻(xiàn)報(bào)道的方式，根據(jù)化合物分子量、碎片信息和裂解規(guī)律對(duì)以上篩選出的色譜峰進(jìn)行化學(xué)成分解析，推測(cè)出7個(gè)化合物，并通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，確定了敗醬草黃酮部位純化物抗腸腫瘤活性較強(qiáng)的成分色譜峰分別為7(綠原酸)、10(咖啡酸)、15(野黃芩苷)、18(異葒草苷)、19(木犀草素)、20(異牡荊素)、24(芹菜素)。

本研究通過(guò)前期的白花敗醬草黃酮部位抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株的初步篩選實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與其他人結(jié)腸癌細(xì)胞株比較，Caco-2細(xì)胞對(duì)白花敗醬黃酮部位純化物的敏感性較強(qiáng)，白花敗醬黃酮部位對(duì)Caco-2細(xì)胞的抑制作用較明顯，因此選用Caco-2細(xì)胞作為模型來(lái)研究白花敗醬黃酮部位抗腸腫瘤的作用機(jī)制。

本研究在對(duì)白花敗醬草樣品主要色譜峰進(jìn)行指認(rèn)的基礎(chǔ)上，明確了白花敗醬黃酮類(lèi)成分抗腸腫瘤的活性成分?；谇捌趯?shí)驗(yàn)室研究，分析其單一活性物質(zhì)體內(nèi)(外)入血成分抗腸腫瘤作用不顯著，說(shuō)明中藥發(fā)揮治療作用具有多成分、多靶點(diǎn)特點(diǎn)，發(fā)揮藥效是其多種成分共同作用的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)采用灰色關(guān)聯(lián)度分析和偏最小二乘回歸分析法進(jìn)行譜效相關(guān)分析，表明白花敗醬草黃酮類(lèi)有效組分群對(duì)藥效均有貢獻(xiàn)，只是每種成分貢獻(xiàn)率不同，進(jìn)一步說(shuō)明了白花敗醬草抗腸腫瘤作用是多成分協(xié)同作用的結(jié)果，揭示了白花敗醬草抗腸腫瘤作用的藥效物質(zhì)(群)，該結(jié)果為基于白花敗醬草藥材安全有效的現(xiàn)代化抗腸腫瘤藥物開(kāi)發(fā)、藥效保障及質(zhì)量控制提供了一定的參考依據(jù)，并且為白花敗醬草的深入研究打下基礎(chǔ)。