李正剛，曲涵婷，李本淳，王路宏，趙 艷﹡

(1.四平市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 四平 136000；2.四平市社會(huì)精神病院，吉林 四平 136000)

何首烏為蓼科植物PolygonaummultiflorumThunb.何首烏的干燥塊根[1]。生品味苦、澀，性甘、微溫。歸肝、心、腎經(jīng)。功能主治為：解毒、消癰、戒瘧、潤(rùn)腸通便，用于瘡癰、瘰疬、風(fēng)疹瘙癢、久虐體虛、腸燥便秘。經(jīng)過(guò)黑豆和黃酒炮制后，其功能主治發(fā)生變化，具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨、化濁降脂作用。用于血虛萎黃、眩暈耳鳴．須發(fā)早白、腰膝酸軟、肢體麻木、崩漏帶下、久瘧體虛、高脂血癥[2]。現(xiàn)代研究多集中于《中華人民共和國(guó)藥典》中的黑豆汁制法研究，而黑豆汁和黃酒共制的研究報(bào)道甚少[3-9]。黑豆酒炙的方法首載于我國(guó)現(xiàn)存最早的一部骨傷科專著——唐代蘭道人所撰的《仙授理傷續(xù)斷秘方》[10]。明代的《仁術(shù)便覽》明確記載黑豆酒制何首烏的炮制方法：“何首烏酒浸軟，切大片，黑豆一層，何首烏一層，蒸曬各七遍，聽(tīng)用”。[11]現(xiàn)炮制方法收載在《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》2008版[2]和《河南省中藥飲片炮制規(guī)范》2005版中[12]。其炮制方法為《中華人民共和國(guó)藥典》2015版四部通則0213中的燉法，但以上標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)都僅做了一般原則性的規(guī)定，未規(guī)定其關(guān)鍵炮制工藝參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以二苯乙烯苷含量、游離蒽醌含量指標(biāo)，綜合評(píng)分法優(yōu)化何首烏黑豆酒炙的炮制工藝，以確定最佳炮制工藝參數(shù)，為實(shí)際生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

電子天平BT125D型(北京賽多利斯儀器天平有限公司)；電子天平BS323S型(北京賽多利斯儀器天平有限公司)；Agilent LC1260高效液相色譜儀；色譜柱：安捷倫ZORBAX SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm。

1.2 材料

藥材：何首烏片購(gòu)自于河北保定中藥材市場(chǎng)，經(jīng)本所副主任藥師梁帥鑒定為蓼科植物PolygonaummultiflorumThunb.何首烏的干燥塊根加工成的何首烏片，并按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015版一部何首烏飲片項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)合格。

炮制所用輔料為黑豆和黃酒。黑豆執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部[13]；黃酒執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 對(duì)照品

2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110844-201814)；大黃素(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110756-201913)；大黃素甲醚(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110758-201817)。

1.4 試劑

水(自制蒸餾水)，乙腈(色譜純)，甲醇(色譜純)，磷酸二氫鉀(分析純)。

2 方法

2.1 黑豆汁制備

取黑豆10 kg，加水適量，煮約4 h，熬汁約15 kg，豆渣再加水煮約3 h，熬汁約10 kg，合并黑豆汁約25 kg。

2.2 炮制工藝研究

2.2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)考察 平行稱取生何首烏片3份，分別加黑豆汁和黃酒拌勻(每100 kg何首烏片，用黑豆汁25 kg、黃酒25 kg)，分別燉制3、6、9 h，自然放涼7 h后，取出，于70 ℃干燥10 h?？疾炫谥坪箫嬈男誀?，具體見(jiàn)表1。

表1 何首烏炮制工藝預(yù)實(shí)驗(yàn)考察情況

2.2.3 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化 對(duì)何首烏片的燉制時(shí)間、放涼時(shí)間和干燥溫度，這3個(gè)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳炮制工藝。經(jīng)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果，燉制時(shí)間9 h，性狀可以達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，本次正交實(shí)驗(yàn)擬考察隔水燉制時(shí)間8、12、16 h；同時(shí)對(duì)放涼時(shí)間考察0、4、8 h，烘干溫度60 ℃，70 ℃，80 ℃。選用L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 何首烏炮制工藝因素水平

2.3 考察指標(biāo)測(cè)定

2.3.1 外觀性狀 參考《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》2008版制何首烏性狀標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合樣品實(shí)際情況，以表面黑褐色或棕褐色，質(zhì)堅(jiān)硬，斷面角質(zhì)樣，棕褐色或黑色，氣微，味微甘而苦澀，為符合要求。經(jīng)過(guò)考察，9個(gè)正交實(shí)驗(yàn)樣品性狀均能夠滿足性狀要求。

2.3.2 浸出物含量 照醇溶性浸出物測(cè)定法(《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版 四部通則 2201)項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定，用乙醇作溶劑。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 炮制后飲片浸出物含量

2.3.3 二苯乙烯苷含量 參考《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》2008年版制何首烏標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下二苯乙烯苷含量測(cè)定方法，采用高效液相色譜法，紫外檢測(cè)器。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 炮制后飲片二苯乙烯苷含量

2.3.4 游離蒽醌含量 參考《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部制何首烏標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下含量游離蒽醌測(cè)定方法，采用高效液相色譜法 。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 炮制后飲片游離蒽醌含量

3 綜合評(píng)價(jià)結(jié)果

綜合指標(biāo)的計(jì)算在多指標(biāo)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，需對(duì)各個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合考慮和權(quán)衡。故設(shè)計(jì)一個(gè)綜合指標(biāo)“隸屬度”，將各個(gè)指標(biāo)統(tǒng)一綜合考察，以綜合指標(biāo)進(jìn)行直觀分析和方差分析[14]。在計(jì)算綜合指標(biāo)之前，需先將各指標(biāo)進(jìn)行“隸屬度”計(jì)算。對(duì)于欲達(dá)到最大值的指標(biāo)(如浸出物、二苯乙烯苷、游離蒽醌)其指標(biāo)隸屬度=(指標(biāo)值-指標(biāo)最小值)/(指標(biāo)最大值-指標(biāo)最小值)。指標(biāo)最大值的隸屬度為1，而最小值隸屬度為0，所以0≤指標(biāo)隸屬度≤ 1。如果各指標(biāo)的重要性一樣，就直接將各指標(biāo)隸屬度相加作為綜合分?jǐn)?shù)；如不一樣就要求計(jì)算出加權(quán)和作為綜合分?jǐn)?shù)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，正交實(shí)驗(yàn)9個(gè)樣品，性狀均符合標(biāo)準(zhǔn)要求，浸出物無(wú)顯著差異，雖然性狀和浸出物為飲片重要質(zhì)量項(xiàng)目，但是對(duì)最終差異評(píng)價(jià)無(wú)貢獻(xiàn)，故不參加結(jié)果評(píng)估。以二苯乙烯苷含量和游離蒽醌含量?jī)蓚€(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。兩個(gè)指標(biāo)在炮制后的何首烏飲片中的重要性相同，各占50%。于是正交實(shí)驗(yàn)每個(gè)實(shí)驗(yàn)的綜合分?jǐn)?shù)=二苯乙烯苷隸屬度×50% + 游離蒽醌隸屬度×50%，滿分為1.00。評(píng)分結(jié)果以綜合分?jǐn)?shù)作為總指標(biāo)進(jìn)行直觀分析，結(jié)果見(jiàn)表6，方差分析見(jiàn)表7。

表6 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與綜合評(píng)分情況

表7 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表

由方差分析結(jié)果可知，各考察因數(shù)對(duì)制何首烏的質(zhì)量影響大小順序?yàn)锳>C>B，燉制時(shí)間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。放涼時(shí)間、干燥溫度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)考慮傳統(tǒng)炮制工藝和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最佳工藝：燉制12 h，自然放涼8 h，于80 ℃干燥。

4 不同產(chǎn)地考察

選用不同產(chǎn)地生何首烏片炮制3批樣品，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表8。炮制后飲片質(zhì)量均符合標(biāo)準(zhǔn)要求，證明工藝穩(wěn)定，合理可行。

表8 不同產(chǎn)地何首烏炮制驗(yàn)證結(jié)果 (%)

5 討論

何首烏采用不同炮制輔料加工后的飲片名稱均為“制何首烏”，難以分辨，給臨床應(yīng)用帶來(lái)麻煩，因此規(guī)范不同炮制方式的何首烏飲片名稱非常有必要，建議國(guó)家藥典委員會(huì)針對(duì)何首烏飲片能夠進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范命名，加以區(qū)分。

何首烏黑豆酒炙的炮制方法主要應(yīng)用在《中國(guó)藥典》2015版一部收載的中成藥平肝舒絡(luò)丸、養(yǎng)血榮筋丸，以及執(zhí)行國(guó)家衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)和注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)的益腎烏發(fā)口服液、婦寶金丸、換骨丸、活絡(luò)丸、理氣定喘丸、益血膏、產(chǎn)靈丹、益腎強(qiáng)身丸等品種中。中成藥廠家何首烏(黑豆酒炙)飲片標(biāo)準(zhǔn)大部分執(zhí)行《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》2008年版，部分廠家執(zhí)行企業(yè)自擬的標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)不一致，因此有必要規(guī)范統(tǒng)一的炮制標(biāo)準(zhǔn)，為中成藥的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

何首烏中有效成分二苯乙烯苷不穩(wěn)定，在炮制過(guò)程中含量會(huì)不斷下降。結(jié)合性蒽醌是何首烏致瀉的副作用成分，含量隨著炮制時(shí)間延長(zhǎng)而減少，游離蒽醌開(kāi)始時(shí)增加，結(jié)合蒽醌向游離蒽醌轉(zhuǎn)化，12 h后游離蒽醌不再增加，相對(duì)穩(wěn)定。由此可知，炮制時(shí)間不到，游離蒽醌達(dá)不到要求，而現(xiàn)在仍然有效的《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》2008年版制何首烏并未規(guī)定游離蒽醌含量，建議標(biāo)準(zhǔn)增加游離蒽醌含量項(xiàng)目。