尹 麗，梁海蓮，陸萬冰，盧海嘯

(玉林師范學(xué)院，廣西 玉林 537000)

崗松(BaeckeafrutescensL.)屬桃金娘科崗松屬植物，又名掃把枝、鐵掃把、香柴、石松草等[1]，在《廣西壯藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)匯編》有收載，全株均可入藥，具有化瘀止痛、清熱解毒、利尿通淋、殺蟲止癢的功效[2-5]，臨床可用于皮膚濕疹、淋病、瘙癢、疥瘡、腳癬、滴蟲行陰道炎等癥[6]。目前，我國對崗松利用大多處于“總提取物”形式的粗放狀態(tài)，在崗松提取過程中僅對崗松油等主要成分進(jìn)行了提取加工，資源性化學(xué)成分或其他潛在利用價值并未得到有效挖掘和利用[7]。通常中藥渣還含有藥物成分和營養(yǎng)成分，如苷類、堿類、氨基酸、微量元素還剩余20%～30%，可收集中藥渣進(jìn)行發(fā)酵，制作中藥渣發(fā)酵飼料[8]。跟普通飼料相比，其可提高動物的育肥效果、飼料利用率，降低藥物殘留、毒副作用。藥渣中殘留的活性成分還能起到防病治病，提高免疫力的效果，取代抗生素飼料添加劑，在防治動物疫病方面起重要作用[9]。本試驗旨在研究崗松藥渣資源化利用，以崗松藥渣為原料，利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化崗松藥渣發(fā)酵工藝，以葡萄糖含量作為響應(yīng)值，考察發(fā)酵時間、發(fā)酵初始pH值和發(fā)酵溫度對葡萄糖含量的影響[10]，并優(yōu)化發(fā)酵工藝，為中草藥下游產(chǎn)品開發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

崗松藥渣：由廣西源安堂藥業(yè)有限公司提供；GB/T20886-2007安琪高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；蛋白胨(生化試劑)：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖(分析純)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖含量測試盒：上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 試驗儀器

WN-200多功能粉碎機(jī)：廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；LE403E電子分析天平：瑞士梅特勒-托利多儀器(中國)有限公司；SpectraMax190酶標(biāo)儀：美國MD公司；Eppendorf 5424R小型高速冷凍離心機(jī)：上海艾研生物科技有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國宇儀器制造有限公司；PHBJ-260型酸度計：成都紐思特檢測技術(shù)有限公司；HDPN-II-256電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；DHG-1012A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：河北星建儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母菌活化增殖[11]稱量7.0 g安琪高活性干酵母置于250 mL錐形瓶，加入100 mL溫水，分別加4%蛋白胨和4%葡萄糖，混勻后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)72 h后，取出備用。

1.3.2 崗松藥渣的單因素發(fā)酵實驗

(1)發(fā)酵溫度對葡萄糖含量的影響。崗松藥渣干燥粉碎后過40目篩，稱取6份崗松藥渣，每份10.0 g，置于錐形瓶中，將崗松藥渣按質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)50 g/100 mL加入酵母增殖活化液，用1 mol/L的HCL將上述6份混合液pH值調(diào)至7.0，分別置于29 ℃、33 ℃、37 ℃、41 ℃、45 ℃ 溫度下培養(yǎng)72 h，然后測定崗松藥渣發(fā)酵物葡萄糖含量。

(2)發(fā)酵pH值對葡萄糖含量的影響。崗松藥渣干燥粉碎后過40目篩，稱取6份崗松藥渣，每份10.0 g，置于錐形瓶中，將崗松藥渣按質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)50 g/100 mL加入酵母增殖活化液，用1 mol/L的HCL分別將上述6份混合液pH調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，置于37 ℃溫度下培養(yǎng)72 h，然后測定崗松藥渣發(fā)酵物葡萄糖含量。

(3)發(fā)酵時間對葡萄糖含量的影響。崗松藥渣干燥粉碎后過40目篩，稱取6份崗松藥渣，每份10.0 g，置于錐形瓶中，將崗松藥渣按質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)50 g/100 mL加入酵母增殖活化液，用1 mol/L的HCL分別將上述6份混合液pH值調(diào)至7.0，置于37 ℃溫度下培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，然后測定崗松藥渣發(fā)酵物葡萄糖含量。

(4)響應(yīng)面設(shè)計法優(yōu)化定向生成崗松藥渣發(fā)酵條件[12]。以單因素試驗設(shè)計得到的結(jié)果為中心點，運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件針對主要因素(發(fā)酵溫度、pH 值、發(fā)酵時間)使用中值組合重新編碼，以葡萄糖含量為響應(yīng)值，采用Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計原理，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面實驗(見表1)。

表1 響應(yīng)面因素與水平

表 2 Box-Behnken實驗設(shè)計方案及結(jié)果

1.3.3 葡萄糖含量測定 稱取崗松藥渣發(fā)酵物2.0 g置于試管中，加入蒸餾水10 mL，70 ℃水浴加熱溶解，過濾去除不溶物，離心后取上清液作為待測液，按葡萄糖測定試劑盒說明書(氧化酶法)測定，進(jìn)行葡萄糖含量測定，計算每克發(fā)酵樣品中糖含量。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析 數(shù)據(jù)采用數(shù)據(jù)用軟件Graphpad prism 7進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析并繪圖，用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(ANOVA)，采用Design-Expert8.0.6軟件分析數(shù)據(jù)及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適發(fā)酵溫度的確定

由圖1可知，在控制發(fā)酵時間72 h和發(fā)酵pH=7.0條件下，隨著發(fā)酵溫度的升高，崗松藥渣發(fā)酵效果越來越好；當(dāng)溫度升至37 ℃ 時發(fā)酵效果最好，葡萄糖含量達(dá)到最大值1.418 mg·g-1；溫度大于37 ℃ 后，葡萄糖含量隨著發(fā)酵溫度的升高而減少，總體來看，發(fā)酵溫度對葡萄糖含量影響不明顯(P>0.05)。在葡萄糖響應(yīng)面試驗中，以發(fā)酵溫度37 ℃作為中心值。

注：圖中字母不同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)；下圖同。

2.2 最適發(fā)酵pH值的確定

由圖2可知，在控制發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵時間為72 h條件下，當(dāng)pH值小于7時，隨著pH值的增大，葡萄糖含量顯著增加(P<0.05)。這是因為酵母菌產(chǎn)生酵母多糖，在稀酸性條件下水解為葡萄糖；或是崗松藥渣經(jīng)酵母菌產(chǎn)生各種分解酶作用，使殘留在崗松藥渣中的多糖溶出，多糖進(jìn)一步水解為葡萄糖[13]。pH=7時，發(fā)酵液中葡萄糖含量最多，當(dāng)pH值大于7后，隨著pH值的升高，葡萄糖含量顯著下降(P<0.05)，其原因可能是葡萄糖在堿性條件下加熱易分解。因此，在葡萄糖響應(yīng)面試驗中，以發(fā)酵pH=7.0作為中心值。

圖2 pH值對葡萄糖含量的影響

2.3 最適發(fā)酵時間的確定

由圖3可知，在控制發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵pH=7.0的條件下，當(dāng)提取時間<72 h時，葡萄糖含量隨著提取時間的增加而增加(P<0.05)；當(dāng)提取時間為72 h時，葡萄糖含量達(dá)到最大值1.546 mg·g-1；當(dāng)提取時間>72 h，葡萄糖含量出現(xiàn)大幅度的降低(P<0.05)。這是因為時間過長，酵母菌株含量增多，對營養(yǎng)物質(zhì)的需求也多，但發(fā)酵物中營養(yǎng)物質(zhì)有限，生長到一定程度就不能滿足微生物的生長了，使菌株生長受到抑制。因此，在葡萄糖響應(yīng)面試驗中，以發(fā)酵時間72 h作為中心值。

圖3 發(fā)酵時間對葡萄糖含量的影響

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果

本試驗采用Design-Expert 8.0.6對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵初始pH值、發(fā)酵時間為響應(yīng)變量，以葡萄糖含量為響應(yīng)值，通過對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，得到關(guān)于葡萄糖含量的二次多項回歸模型方程：

Y=1.79-0.012A+0.057B-0.024C-0.002AB+0.008AC-0.037BC-0.34A2-0.15B2-0.21C2

用 Expert Design 8.0.6 軟件，應(yīng)用回歸分析對方程和各因子進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3方差分析結(jié)果可知，模型F值為49.93，模型的決定系數(shù)R2=0.987 4，P<0.000 1，表明響應(yīng)回歸模型達(dá)到了極顯著水平；失擬項P=0.538 1>0.05，失擬不顯著；表明該二次方程模型極顯著，回歸方程模型與實際試驗擬合性較好，模型校正決定系數(shù)RAdj2=0.913 0，表明91.3%的試驗數(shù)據(jù)的變異性可以用此回歸模型解釋，實驗誤差小，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化定向生成崗松藥渣中葡萄糖的發(fā)酵工藝是可行的，具有參考性。

表3 回歸方程方差分析

各因素對葡萄糖產(chǎn)率影響次序：發(fā)酵pH值>發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度。根據(jù)回歸模型的方差分析來看，一次項的發(fā)酵pH值達(dá)極顯著水平，發(fā)酵時間達(dá)顯著水平；因素間的交互作用只有BC顯著影響發(fā)酵物葡萄糖的含量。AB、AC間的交互作用對崗松藥渣發(fā)酵物葡萄糖含量影響不明顯；二次項的發(fā)酵溫度達(dá)顯著水平，發(fā)酵pH值、發(fā)酵時間達(dá)極顯著水平。

2.5 響應(yīng)面分析圖

根據(jù)各因素之間的交互作用及回歸方程，作出響應(yīng)面分析圖，見圖4-圖6。圖中等高線可以直觀反映兩因素之間關(guān)系。圖形坡度大、顏色變化快表示試驗結(jié)果顯著，反之則不顯著；等高線形狀表示兩因素之間交互作用情況，橢圓形表示兩因素之間影響顯著，圓形則表示不顯著[14-15]。分析發(fā)酵溫度、pH值、發(fā)酵時間這3個因素的交互作用影響，結(jié)果顯示3個因素交互作用顯著。

圖4 pH值和溫度對葡萄糖含量影響的等高線和響應(yīng)面

圖5 時間和溫度對葡萄糖含量影響的等高線和響應(yīng)面

圖6 時間和pH值對葡萄糖含量影響的等高線和響應(yīng)面

2.6 驗證試驗

通過響應(yīng)面優(yōu)化實驗，回歸模型預(yù)測的定向生成葡萄糖的最佳發(fā)酵工藝條件：發(fā)酵溫度為36.21 ℃，發(fā)酵pH=7.2，發(fā)酵時間為70.12 h?？紤]到實際操作可行性，實際工藝為發(fā)酵溫度為36 ℃，發(fā)酵pH=7.2，發(fā)酵時間為70 h。在此條件下，重復(fù)進(jìn)行3次平行驗證實驗，葡萄糖的平均含量為1.712 mg·g-1(RSD=1.73%，n=3)，與模型預(yù)測值1.728 mg·g-1無明顯差異。對比優(yōu)化前的初始發(fā)酵液葡萄糖產(chǎn)量1.546 mg·g-1，提高了10.7%。

3 討論

中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布《獸用抗菌藥使用減量化行動試點工作方案(2018獸用抗菌年)》規(guī)劃2020年底前禁止藥物飼料添加劑濫用，養(yǎng)殖端濫用抗生素和違法使用藥物飼料添加劑的危害已獲得人們共識[16]，開發(fā)與推廣無抗生素綠色飼料添加劑逐漸受到重視和關(guān)注。目前崗松被廣泛應(yīng)用，含有崗松有效成分的藥渣卻多被廢棄，造成巨大的資源浪費(fèi)[17-18]，如將其作為牲畜飼料的添加劑，具有無殘留、無抗藥性、經(jīng)濟(jì)環(huán)保等優(yōu)點，是一種新興的飼料添加劑[19-20]。

飼料中添加糖分能夠為乳酸菌提供發(fā)酵底物，使其迅速繁殖迅速產(chǎn)生乳酸，降低飼料pH值，進(jìn)而抑制有害微生物增殖，達(dá)到飼料長期保存的目的[21-22]。本研究以葡萄糖含量作為飼料發(fā)酵品質(zhì)的評價指標(biāo)，量化工藝參數(shù)，通過 Box-Behnken 中心組合設(shè)計多因子響應(yīng)面試驗研究分別建立定向生成葡萄糖工藝路線，通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗綜合分析，可知影響葡萄糖得率的因素為發(fā)酵pH值>發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度。發(fā)酵工藝采用非線性模型擬合，可信度較好，具有良好預(yù)測性。本試驗所采用的設(shè)備及原料成本低廉、操作安全、方法簡便易行、效果好。禁抗時代到來，崗松藥渣中葡萄糖新發(fā)酵工藝為崗松藥渣資源化利用提供了理論依據(jù)與技術(shù)參考。