阿尼古力·沙比爾?甄雅惠?付玉霞?盛娟?阿依努爾·斯迪克?李瑞岐

【摘要】目的 研究白蘆藜醇（RSV）對(duì)小鼠超排卵效果及胚胎發(fā)育的影響。方法 以2～3月齡的CD-1小鼠為研究對(duì)象，在超排卵同時(shí)腹腔注射RSV（RSV組）或二甲基亞砜（DMSO組），觀察RSV對(duì)小鼠超排卵子質(zhì)量的影響。選取了小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）、卵巢和睪丸組織的模板DNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分別檢測(cè)沉默信息調(diào)節(jié)因子（SIRT1） mRNA在這三者中的表達(dá)情況。另外獲取小鼠P1卵丘細(xì)胞，設(shè)置DMSO組、RSV（1 μmol/L）組和EX-527（SIRT1的抑制劑，10 μmol/L）組，使用熒光免疫染色檢測(cè)各組SIRT的相對(duì)熒光強(qiáng)度、qRT-PCR檢測(cè)各組的mtDNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果 RSV組的卵裂率和囊胚率均高于DMSO組（P均< 0.05）。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SIRT1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在卵巢是MEF的15～25倍（P < 0.001）。小鼠P1卵丘細(xì)胞在經(jīng)RSV處理后SIRT1熒光相對(duì)強(qiáng)度升高（P < 0.001）。在用RSV和EX-527分別處理小鼠卵丘細(xì)胞48 h后，RSV組mtDNA相對(duì)表達(dá)量高于DMSO組（P < 0.001），而EX-527組mtDNA相對(duì)表達(dá)量低于DMSO組（P < 0.01）。結(jié)論 小鼠超排卵時(shí)補(bǔ)充RSV能夠顯著改善卵子的發(fā)育潛能。

【關(guān)鍵詞】白藜蘆醇;線粒體;線粒體DNA;卵子質(zhì)量;輔助生殖技術(shù)

Effect of resveratrol on the quality of oocytes after superovulation in mouse models Aniguli·Shabier， Zhen Yahui， Fu Yuxia， Sheng Juan， Ayinuer·Sidike， Li Ruiqi. Reproductive Medicine Center， the First Peoples Hospital of Kashgar， Kashgar 844000， China

Corresponding author， Li Ruiqi， E-mail： wxszzx@ 163. com

【Abstract】Objective To evaluate the effect of resveratrol （RSV） on the superovulation and embryonic development in mouse models. Methods In this study， CD-1 mice （2-3 months old） were selected. RSV （RSV group） or dimethyl sulfoxide （DMSO group） was injected intraperitoneally during superovulation to observe the effect of RSV on the quality of superovulated oocytes in mice. Template DNA of mouse embryonic fibroblasts （MEF）， ovary and testis tissues was extracted. The expression level of SIRT1 mRNA in these three tissues was detected by quantitative PCR. In addition， mouse P1 cumulus cells were obtained and divided into the DMSO， RSV （1μmol/L） and EX-527 （10 μmol/L inhibitor of SIRT1） groups. The relative fluorescence intensity of SIRT in each group was detected by immunofluorescence staining. The relative expression of mtDNA in each group was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. Results The cleavage rate and blastocyst rate in the RSV group were significantly higher than those in the control group （both P < 0.05）. The results of in vitro experiments showed that the relative expression of SIRT1 mRNA in the ovary was 15-25 times of that in the MEF （P < 0.001）. The relative fluorescence intensity of SIRT1 in the P1 mouse cumulus cells was significantly increased after RSV treatment （P < 0.001）. After the mouse cumulus cells were treated with RSV and SIRT1 inhibitor （EX-527） for 48 h， the relative expression level of mtDNA in the RSV group was significantly higher than that in the DMSO group （P < 0.001）， whereas the relative expression level of mtDNA in the EX-527 group was significantly lower compared with that in the DMSO group （P < 0.01）. Conclusion RSV supplementation during superovulation can significantly improve the developmental potential of oocytes in mouse models.

【Key words】Resveratrol;Midtochondria;mtDNA;Oocyte quality;Assisted reproductive technique

改善卵子質(zhì)量，提高胚胎發(fā)育潛能一直是輔助生殖技術(shù)（ART） 所追求的目標(biāo)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究顯示，線粒體功能下降是造成卵子質(zhì)量下降的重要原因。白藜蘆醇 （RSV）又稱(chēng)為芪三酚，是一類(lèi)增強(qiáng)線粒體功能的藥物。有研究顯示，在卵母細(xì)胞體外成熟 （IVM） 時(shí)補(bǔ)充 RSV能夠提高胚胎的囊胚率[1]。超排卵過(guò)程是卵泡快速生長(zhǎng)的時(shí)期，也是卵母細(xì)胞內(nèi)的線粒體和線粒體DNA（mtDNA）快速增殖的時(shí)期[2]。在此時(shí)補(bǔ)充 RSV會(huì)對(duì)超排卵產(chǎn)生什么樣作用，筆者尚未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道。為此，本研究在小鼠超排卵同時(shí)補(bǔ)充RSV，觀察其對(duì)超排效果的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)所用小鼠為CD-1品系，超排卵實(shí)驗(yàn)為12只2 ～ 3月齡的雌性小鼠，體質(zhì)量約30 g。獲取顆粒細(xì)胞所用小鼠為1月齡小鼠，體質(zhì)量約20 g。用于交配的雄鼠為4 ～ 5月齡，體質(zhì)量約50 g。本研究所用小鼠均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)及操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理相關(guān)要求。

二、主要試劑和儀器

主要試劑孕馬血清促性腺激素（PMSG）、人絨毛膜促性腺激素（HCG）購(gòu)自寧波三生藥業(yè)，二甲基亞砜（DMSO）、RSV、EX-527購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，KSOM坯胎培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Millopore公司，熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技股份有限公司，沉默信息調(diào)節(jié)因子（SIRT1）一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，Alexa Fluor 555標(biāo)記驢抗小鼠IgG、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、OCT4一抗購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。主要儀器包括羅氏LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀、奧林巴斯CKX41倒置熒光顯微鏡。本研究中的引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

三、小鼠超排方案及2-細(xì)胞期胚胎的獲取

12只雌性小鼠按隨機(jī)數(shù)表法分配到對(duì)照組（DMSO組）和實(shí)驗(yàn)組（RSV組），每組6只小鼠，每只小鼠均予腹腔注射5 IU的PMSG。在此基礎(chǔ)上，對(duì)照組注射稀釋過(guò)的DMSO，實(shí)驗(yàn)組注射RSV 20 mg/kg，該計(jì)量參考Park等[3]的研究。48 h后，2組小鼠均注射5 IU的HCG，同時(shí)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別再次注射相同劑量的DMSO和RSV。小鼠在注射后與成年雄鼠1∶1合籠。合籠的次日上午8∶00檢查是否交配成功，陰道口有精栓者（見(jiàn)栓）視為交配成功，交配成功的雌性小鼠和未交配成功的雌性小鼠分籠放置。交配成功30 h后取雌性小鼠的輸卵管進(jìn)行沖胚。收集從輸卵管沖出的2-細(xì)胞期胚胎和未受精的卵母細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，將2-細(xì)胞期的胚胎放入預(yù)平衡好的KSOM胚胎培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至囊胚階段（D4）。囊胚評(píng)分參考文獻(xiàn)[4]的標(biāo)準(zhǔn)，滋養(yǎng)層細(xì)胞完整、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)明顯的囊胚為優(yōu)質(zhì)囊胚。

四、SIRT1在小鼠睪丸和卵巢組織中的表達(dá)檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)室前期制備了CD1小鼠多個(gè)器官組織的模板DNA（cDNA），本研究選取了小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）、卵巢和睪丸組織的cDNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分別檢測(cè)SIRT1在這三者中的表達(dá)情況。

五、原代小鼠卵丘細(xì)胞的獲取及培養(yǎng)

1月齡CD1雌性小鼠注射PMSG 48 h后獲取卵巢組織，用1 ml注射器針頭在體視顯微鏡下刺破卵泡，獲取未成熟的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COC），之后用剝卵針將卵丘細(xì)胞剝掉，收集操作液并離心洗滌，最后將卵丘細(xì)胞接種到6孔板內(nèi)培養(yǎng)，此時(shí)卵丘細(xì)胞為P0代，培養(yǎng)基為DMEM/F12+10%胎牛血清。卵丘細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)板后，按1∶3傳代（P1） [5]。小鼠P1卵丘細(xì)胞傳代12 h

后，各組加入相應(yīng)的處理藥物培養(yǎng)48 h。

六、mtDNA mRNA相對(duì)定量

為了驗(yàn)證SIRT1在卵丘細(xì)胞中對(duì)線粒體增殖的作用，本研究設(shè)置3組，分別為DMSO組、RSV（1 μmol/L）組和EX-527（SIRT1的抑制劑，10 μmol/L）組，每組設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，小鼠P1卵丘細(xì)胞處理48 h后通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)各組mtDNA相對(duì)表達(dá)量。β-Globin引物：正向5-CGAACATACTGAACTGCTA-3，反向5-GACATATCTGACATCT CTACTT-3，產(chǎn)物長(zhǎng)度為106 bp。mtDNA

引物：正向5- TACCTCACCATCTCTTGCTA-3，反向5-GCTACACCTTGACCTAACG-3，產(chǎn)物長(zhǎng)度為114 bp。以總DNA為模板，β-Globin為內(nèi)參，按照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作[5]。根據(jù)公式2-△△Ct進(jìn)行mtDNA相對(duì)量的計(jì)算，目的基因相對(duì)表達(dá)量用目的基因與β-Globin 之比表示。

七、熒光免疫染色

具體過(guò)程參考既往文獻(xiàn)報(bào)道：使用SIRT1一抗與小鼠P1卵丘細(xì)胞進(jìn)行共孵育，然后使用Alexa Fluor 555驢抗小鼠IgG進(jìn)行標(biāo)記、OCT4抗體特異性識(shí)別囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，再用Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG進(jìn)行標(biāo)記，最后用DPAI對(duì)所有囊胚細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行染色，在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù)[5]。SIRT1的熒光強(qiáng)度定量采用ImageJ軟件分析灰度值，結(jié)果以實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的相對(duì)值（對(duì)照組設(shè)為1）表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組間比較采用單因素方差分析，多重比較行Dunnet-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用Pearson χ2檢驗(yàn)分析組間差異。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、RSV對(duì)小鼠自然受精胚胎發(fā)育的影響

小鼠的超排卵結(jié)果顯示，DMSO組和RSV組各有4只和6只小鼠見(jiàn)栓，取得RSV組2-細(xì)胞期胚胎和未受精（未卵裂）的卵母細(xì)胞共140枚，對(duì)照組2-細(xì)胞期胚胎和未受精（未卵裂）的卵母細(xì)胞共82枚，RSV組的卵裂率和囊胚率均高于DMSO組（P均< 0.05）。2組優(yōu)質(zhì)胚胎率和囊胚細(xì)胞數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），見(jiàn)表1、圖1。

二、SIRT1 mRNA在生殖細(xì)胞組織內(nèi)的表達(dá)情況

RSV的作用基因?yàn)镾IRT1，為了檢測(cè)該基因?qū)ι臣?xì)胞的作用，本研究以SIRT1在MEF中的表達(dá)量為對(duì)照，檢測(cè)SIRT1在卵巢和睪丸組織內(nèi)相對(duì)于MEF的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，SIRT1 mRNA在MEF、卵巢和睪丸組織中的相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 1303.958，P < 0.001）。其中，SIRT1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在卵巢是MEF的15 ～ 25倍（P < 0.001），提示SIRT1在卵巢中可能有重要的生物學(xué)作用，見(jiàn)圖2。

三、添加RSV對(duì)體外培養(yǎng)小鼠卵丘細(xì)胞SIRT1表達(dá)及mtDNA相對(duì)表達(dá)量的影響

為了觀察RSV對(duì)卵丘細(xì)胞SIRT1表達(dá)的影響，本實(shí)驗(yàn)使用RSV處理P1代小鼠卵丘細(xì)胞48 h，

通過(guò)免疫染色對(duì)比SIRT1在RSV組和DMSO組中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，添加RSV后可提高SIRT1在卵丘細(xì)胞中的表達(dá)（t = -16.913， P < 0.001），見(jiàn)圖3A、B。進(jìn)一步使用RSV和SIRT1抑制劑EX-527分別處理P1代小鼠卵丘細(xì)胞48 h，

然后檢測(cè)各組的mtDNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示3組mtDNA相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 114.416，P < 0.001），其中EX-527 組的mtDNA相對(duì)表達(dá)量低于DMSO組（Dunnet-t = 5.899，P = 0.002），而RSV 組的mtDNA相對(duì)表達(dá)量高于DMSO組（Dunnet-t = 9.113，P < 0.001），見(jiàn)圖3C。

討論

卵母細(xì)胞質(zhì)量是輔助生殖技術(shù)助孕成敗的關(guān)鍵因素，不僅影響胚胎的早期發(fā)育，甚至對(duì)后代的健康也會(huì)產(chǎn)生重大影響。高齡女性和卵巢儲(chǔ)備下降（DOR）患者的卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)顯著低于年輕和非DOR患者卵母細(xì)胞的拷貝數(shù)。此外，胚胎的代謝情況也會(huì)有所改變[7]。低mtDNA量的卵母細(xì)胞產(chǎn)生的胚胎可能會(huì)在胚胎種植前激活mtDNA的復(fù)制，以補(bǔ)償卵母細(xì)胞mtDNA的不足，而這部分胚胎多數(shù)表現(xiàn)為染色體異?；蛘叻N植失敗[8]。近來(lái)越來(lái)越多的研究顯示，改善線粒體功能能夠提高卵子質(zhì)量，甚至可以逆轉(zhuǎn)年齡對(duì)卵子質(zhì)量的影響[10-11]。因此，提高卵母細(xì)胞線粒體的功能將成為改善卵子質(zhì)量的有力措施。

近來(lái)有研究顯示，RSV能夠提高人及小鼠IVM卵母細(xì)胞紡錘體的完整性，降低染色體的異常率，并能夠抵抗卵子體外的老化過(guò)程[12-14]。Liu等[15]研究顯示，對(duì)小鼠長(zhǎng)期喂食RSV能夠降低卵母細(xì)胞的非整倍體率，并延長(zhǎng)小鼠的繁殖期限。卵泡快速生長(zhǎng)的時(shí)期也是卵母細(xì)胞內(nèi)的線粒體和mtDNA 快速增殖的時(shí)期，在補(bǔ)充RSV是否會(huì)改善超排卵子的發(fā)育潛能尚未有文獻(xiàn)對(duì)此進(jìn)行報(bào)道。本研究在小鼠卵泡啟動(dòng)和扳機(jī)時(shí)分別給予1次RSV刺激，結(jié)果顯示在此時(shí)補(bǔ)充RSV能提高小鼠胚胎體外培養(yǎng)的囊胚形成率。優(yōu)質(zhì)囊胚率和平均囊胚細(xì)胞數(shù)組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，原因可能是RSV組卵裂的胚胎顯著增多，這些卵裂的胚胎中含有發(fā)育為優(yōu)質(zhì)囊胚的比例可能會(huì)被拉低;而DMSO組質(zhì)量不好的卵子可能不發(fā)生卵裂提前被淘汰了，從而含有高質(zhì)量卵裂胚胎的比例會(huì)相應(yīng)增加，最終導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)囊胚率在組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然2組的優(yōu)質(zhì)囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)相近，但是RSV處理后明顯改善了胚胎發(fā)育到囊胚的能力，因此我們認(rèn)為超排卵時(shí)補(bǔ)充RSV能夠提高胚胎的發(fā)育潛能。另外，超排卵過(guò)程是卵泡快速生長(zhǎng)的過(guò)程，卵母細(xì)胞內(nèi)的線粒體數(shù)量和mtDNA也在此時(shí)期快速增殖，因此我們選擇在此時(shí)補(bǔ)充RSV。但是在超排卵之前提前使用，延長(zhǎng)使用時(shí)間以及改變劑量是否會(huì)產(chǎn)生不同的影響，還需要進(jìn)一步研究。

RSV能夠通過(guò)SIRT1激活PGC-1α的活性，PGC-1α進(jìn)一步激活線粒體增殖相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)線粒體的功能，并促進(jìn)mtDNA拷貝數(shù)的增加[3]。本研究顯示，SIRT1在小鼠卵巢和睪丸細(xì)胞中高表達(dá)（與小鼠成纖維細(xì)胞相比），說(shuō)明SIRT1在生殖細(xì)胞中有重要的作用。通過(guò)在體外培養(yǎng)小鼠卵丘細(xì)胞過(guò)程中添加RSV，我們發(fā)現(xiàn)RSV能夠顯著提高卵丘細(xì)胞中SIRT1和mtDNA的表達(dá)量，而卵丘細(xì)胞mtDNA表達(dá)量與卵母細(xì)胞mtDNA表達(dá)量和卵母細(xì)胞的質(zhì)量密切相關(guān)[16-18]。由此推測(cè)，在體內(nèi)補(bǔ)充RSV能夠通過(guò)激活SIRT1基因的表達(dá)，并可能通過(guò)PGC-1α進(jìn)而誘導(dǎo)線粒體的增殖，改善卵母細(xì)胞的質(zhì)量。

綜上所述，本研究初步證實(shí)在超排卵時(shí)補(bǔ)充RSV能夠改善小鼠超排卵子的質(zhì)量，提高胚胎發(fā)育潛能，但是能否在人ART中產(chǎn)生相似的效果還需要進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-02-08）

（本文編輯：林燕薇）