李 曄，孫仁義，呂 明，王鵬云

（淄博市中心醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，山東 淄博 255036）

人骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是組織工程領域重要的種子細胞之一。目前，BMSCs向成骨細胞誘導技術多采用三維結(jié)構(gòu)為細胞分化創(chuàng)造適宜的微環(huán)境，但存在誘導周期長、誘導后細胞性質(zhì)不均一等弊端［1］。因此，探討B(tài)MSCs成骨分化及調(diào)控機制有重要意義。BMSCs向成骨分化受多種基因調(diào)控。表觀遺傳學研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白修飾、DNA甲基化、Hedgehog信號通路激活等過程與多能干細胞向成骨分化關系密切［2］。近年來研究表明，組蛋白乙?；纱龠MBMSCs向成骨分化，組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase,HDAC）抑制劑可通過抑制HDAC2參與調(diào)控骨髓干細胞向成骨分化過程［3，4］。另研究表明，Hedgehog信號通路與骨形成關系密切，該信號通路的激活可促進BMSCs向成骨分化［5］。目前，關于調(diào)控HDAC2對BMSCs向成骨分化影響的報道尚少，為此，本研究通過體外分離大鼠BMSCs，并應用RNA干擾技術抑制HDAC2基因表達，探討其是否通過Hedgehog信號通路參與調(diào)控BMSCs向成骨細胞分化過程，為骨組織缺損體內(nèi)修復提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級雄性Wistar大鼠5只，4周齡，體質(zhì)量90～110 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2017-0014。

1.2 大鼠BMSCs分離培養(yǎng)及鑒定

脫頸處死大鼠，取股骨、脛骨，DMEM-L完全培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔獲得骨髓腔細胞，37℃、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)5 d，更換培養(yǎng)基，去除未貼壁細胞，每3 d換液1次，收集傳至第3代細胞進行流式細胞術鑒定免疫表型，取符合BMSCs生物學特征的細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 細胞分組及轉(zhuǎn)染處理

取第3代BMSCs細胞，DMEM-L培養(yǎng)基重懸，接種至96孔板，Lipofectamine 2000試劑盒（武漢黙沙克生物科技有限公司）將HDAC2-siRNA重組序列、陰性隨機對照序列（上海凱基基因激活素有限公司設計合成）轉(zhuǎn)入BMSCs細胞，瞬時轉(zhuǎn)染48 h，分別命名為HDAC2-si組、空載組，另取未干預細胞為空白組，每組5個復孔，轉(zhuǎn)染后進行RT-qPCR檢測HDAC2 mRNA表達量，確定轉(zhuǎn)染效果。

1.4 體外誘導BMSCs向成骨細胞分化

調(diào)整各組細胞密度為1×108個/L，接種于培養(yǎng)皿，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，更換成骨誘導液（10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、100 mmol/L地塞米松、50 mg/L維生素C、含15%胎牛血清的DMEM-L完全培養(yǎng)基），每3 d換液1次。

1.5 檢測指標

1.5.1 ALP活性及BPG檢測

取誘導第7 d各組細胞，終止誘導，收集細胞超聲破碎，離心收集上清液，采用ALP活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）檢測ALP活性。取誘導第14 d各組細胞上清液，將上清液制成凍干粉，應用BPG檢測試劑盒（中國人民解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心）檢測BGP分泌量。

1.5.2 茜素紅染色

取誘導前及第7 d各組細胞，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3次后，加入茜素紅染液，染色30 min后PBS洗滌3次，顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)染色情況。

1.5.3 Western blot檢測

取誘導第7 d各組細胞，終止誘導，加入細胞裂解液冰上裂解、離心取上清，用BCA試劑盒（美國Thermo公司）蛋白定量；取40 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗［HDAC2、SHH、IHH（1∶1 000），Ptch1、Glis1（1∶800），美國Abcam公司］，4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記二抗（1∶5 000，美國Abcam公司），室溫孵育2 h，洗膜后暗室中顯色，目的蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值比值表示蛋白相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，多樣本計量資料比較采用oneway ANOVA統(tǒng)計方法，兩樣本間比較采用LSD-t法。統(tǒng)計結(jié)果由GraphPad PRISM軟件形成柱狀圖表示。以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs分離培養(yǎng)鑒定結(jié)果

BMSCs分離培養(yǎng)鑒定結(jié)果如圖1所示。BMSCs原代培養(yǎng)1 d后（圖1a），細胞完全貼壁生長，呈多角形或梭形生長；原代培養(yǎng)3 d后呈集落樣生長（圖1b），之后開始快速增殖，至第6 d時細胞融合達90%以上，呈螺旋狀或旋渦狀生長，傳代培養(yǎng)至第3代時細胞形態(tài)無明顯變化（圖1c）。流氏細胞儀檢測BMSCs第3代細胞表面標記物顯示，CD90、CD29陽性率分別為99.30%、95.62%，符合BMSCs生物學特征。

2.2 BMSCs細胞轉(zhuǎn)染后HDAC2 mRNA相對表達量

BMSCs細胞轉(zhuǎn)染后48 h HDAC2 mRNA相對表達量如圖2所示。空白組、空載組、HDAC2-si組HDAC2 mRNA相對表達量組間比較，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.001）；HDAC2-si組 HDAC2 mRNA 相對表達量低于空白組和空載組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；空白組與空載組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.577）。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察大鼠BMSCs原代及傳代細胞 1a:原代培養(yǎng)1 d后細胞呈角形或梭形生長 1b:原代培養(yǎng)3 d后呈集落樣生長 1c:傳代培養(yǎng)第3代呈螺旋狀或旋渦狀生長

圖2 大鼠BMSCs細胞轉(zhuǎn)染后48 h HDAC2 mRNA相對表達量 空白組BMSCs細胞未作處理；HDAC2-si組BMSCs細胞轉(zhuǎn)染HDAC2-siRNA重組序列；空載組BM?SCs細胞轉(zhuǎn)染陰性隨機對照序列；與空白組比較，*P＜0.05；與空載組比較，#P＜0.05

2.3 BMSCs誘導培養(yǎng)后ALP活性及BGP分泌量

ALP活性及BGP分泌量檢測結(jié)果見表1。HDAC2-si組誘導7 d ALP活性及誘導14 d BGP分泌量均高于空白組和空載組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；空白組與空載組ALP活性及BGP分泌量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 BMSCs誘導培養(yǎng)后ALP活性及BGP分泌量 （n=5，±s） 與比較

表1 BMSCs誘導培養(yǎng)后ALP活性及BGP分泌量 （n=5，±s） 與比較

images/BZ_71_1290_1534_1506_1683.pngimages/BZ_71_1290_1756_1506_1829.pngimages/BZ_71_1506_1534_1856_1683.pngimages/BZ_71_1506_1756_1856_1829.pngimages/BZ_71_1856_1534_2276_1683.pngimages/BZ_71_1856_1756_2276_1829.png空白組21.38±4.140.17±0.03 HDAC2-si組images/BZ_71_1290_1903_1506_1976.pngimages/BZ_71_1506_1903_1856_1976.png68.74±5.90images/BZ_71_1856_1903_2276_1976.png0.80±0.06

2.4 BMSCs誘導培養(yǎng)前后茜素紅染色觀察

BMSCs向成骨分化前、誘導7 d后進行茜素紅染色，結(jié)果如圖3所示。誘導前空白組、空載組、HDAC2-si組細胞均呈螺旋狀或旋渦狀，無紅色礦化結(jié)節(jié)；誘導后空白組和空載組出現(xiàn)紅色礦化結(jié)節(jié)，HDAC2-si組染色更深、紅色礦化結(jié)節(jié)更多。

圖3 光學顯微鏡觀察大鼠BMSCs誘導前后茜素紅染色情況 3a:誘導前BMSCs無著色 3b:空白組BMSCs誘導7 d后出現(xiàn)紅色礦化結(jié)節(jié) 3c:空載組BMSCs誘導7 d后出現(xiàn)紅色礦化結(jié)節(jié) 3d:HDAC2-si組誘導7 d后出現(xiàn)更多、染色更深的紅色礦化結(jié)節(jié)

2.5 BMSCs成骨誘導培養(yǎng)后HDAC2、SHH、IHH、Ptch1、Glis1蛋白相對表達量

BMSCs成骨誘導培養(yǎng)后各蛋白表達情況如圖4所示。HDAC2-si組HDAC2蛋白相對表達量低于空白組和空載組，SHH、Ptch1、Glis1蛋白相對表達量高于空白組和空載組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），空白組與空載組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。IHH蛋白相對表達量組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖4 大鼠BMSCs成骨誘導培養(yǎng)后HDAC2、SHH、IHH、Ptch1、Glis1蛋白表達情況 4a:采用Western blot法檢測BMSCs成骨誘導培養(yǎng)后細胞中各蛋白表達的條帶圖，HDAC2、SHH、IHH、Ptch1、Glis1蛋白條帶與內(nèi)參β-actin的蛋白條帶灰度值比值 4b:蛋白條帶灰度值相對表達強度的柱狀圖，與空白組比較，*P＜0.05；與空載組比較，#P＜0.05

3 討論

BMSCs來自骨髓，具有良好的向成骨和軟骨等組織分化的能力，且具有移植排斥反應小、組織含量豐富等特點，故BMSCs在組織工程再生領域中有重要的應用價值［6］。刺激BMSCs種子細胞向成骨細胞分化是骨組織修復的關鍵步驟，但目前的成骨細胞誘導技術存在不足之處［7］。研究發(fā)現(xiàn)，HDAC2在BM?SCs成骨方向分化過程中低表達，分化前加入HDAC2抑制劑可促進成骨分化，加速和優(yōu)化分化結(jié)果，但具體研究機制不明［8］。

本研究中，BMSCs細胞轉(zhuǎn)染HDAC2-siRNA重組序列后，HDAC2 mRNA表達量顯著降低，提示轉(zhuǎn)染成功；誘導分化后，3組均出現(xiàn)紅色礦化結(jié)節(jié)，且HDAC2-si組紅色礦化結(jié)節(jié)更多，ALP活性及BGP分泌量更多，提示下調(diào)HDAC2表達可促進BMSCs向成骨細胞分化。ALP是BMSCs向成骨細胞分化后細胞分泌的成骨特異性細胞基質(zhì)蛋白酶，屬于細胞膜上的鈣結(jié)合轉(zhuǎn)運糖蛋白，在骨基質(zhì)合成期開始分泌，可促進無機磷釋放、基質(zhì)礦化等過程［9］。BGP是維持骨礦化速率、促進礦物質(zhì)沉積，同時抑制異常羥基磷灰石結(jié)晶形成的重要指標，可反映成骨細胞活性，故ALP活性增強及BGP分泌增多提示成骨分化鈣化期達到高峰。礦化結(jié)節(jié)是成骨分化晚期出現(xiàn)的羥基磷灰石沉積后形成的結(jié)晶物質(zhì)［10］，成骨分化過程中紅色礦化結(jié)節(jié)增多，提示BMSCs的成骨礦化能力增強。

Hedgehog信號通路在成骨細胞分化過程中起重要作用，該通路包括Hedgehog配體（SHH、IHH）、受體（Ptch1）及核轉(zhuǎn)錄因子Glis。SHH在肢體、神經(jīng)細胞等組織中廣泛表達，參與多種細胞分化過程，IHH特異性參與軟骨細胞分化過程［11］。于海悅［12］研究顯示，SHH可啟動下游信號分子參與人牙髓干細胞向成骨細胞分化，而IHH此過程中表達水平無明顯變化，與本研究結(jié)果一致。Hedgehog信號通路激活機制是SHH或IHH與膜受體Ptch1結(jié)合，從而活化下游Gli1轉(zhuǎn)錄因子參與成骨或軟骨分化過程［13］。Wu等［14］研究表明，長鏈非編碼 RNA HDAC2（lncHDAC2）可通過激活Hedgehog信號通路驅(qū)動肝癌干細胞自我更新，下調(diào)lncHDAC2可抑制HDAC2表達水平，參與調(diào)控肝癌干細胞自我更新，說明HDAC2水平抑制可激活Hedgehog信號通路。本研究通過RNAi技術抑制BMSCs細胞HDAC2基因表達，成骨誘導后HDAC2蛋白相對表達量較降低，SHH、Ptch1、Glis1蛋白相對表達量升高，提示下調(diào)HDAC2表達后Hedgehog信號通路激活，從而促進BMSCs成骨細胞分化。

綜上所述，下調(diào)HDAC2表達可能通過激活Hedgehog信號通路相關分子發(fā)揮促進BMSCs向成骨分化的作用，為骨組織缺損體內(nèi)修復工程提供研究方向和理論參考。