郭丹丹，周靜文，劉 洋，馬曉飛，王思楠，樊 榮，柏 錫

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 哈爾濱 150030)

大豆(Glycinemax)富含蛋白質(zhì)和脂肪，是重要的糧食和油料作物。全世界約75%的大豆主要用于動(dòng)物飼料[1]，是人類和動(dòng)物主要的蛋白質(zhì)來源。大豆氨基酸組成中含硫氨基酸(蛋氨酸、半胱氨酸)相對(duì)不足，不利于單胃動(dòng)物的生長(zhǎng)和發(fā)育[2]。同時(shí)還可能降低動(dòng)物對(duì)疾病的抵抗力。有研究表明，含硫氨基酸缺乏可能阻礙兒童的身心發(fā)育[3-4]。

富含硫的異源種子貯藏蛋白在轉(zhuǎn)基因大豆中的表達(dá)可以改善大豆?fàn)I養(yǎng)品質(zhì)[5]。Kim等[6]將種子特異性菜豆β-菜豆蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的18 kD玉米醇溶蛋白基因轉(zhuǎn)入大豆中，使大豆種子中蛋氨酸和半胱氨酸含量增加12%～20%。Li等[7]將27 kD γ-玉米醇溶蛋白基因?qū)氪蠖?，使種子中的半胱氨酸含量從26.97%增加到29.33%，蛋氨酸含量從15.49%增加到18.57%。另外，將CGS基因轉(zhuǎn)入擬南芥，使得種子游離蛋氨酸含量增加8～20倍[8-9]。10 kD玉米醇溶蛋白富含含硫氨基酸，將其轉(zhuǎn)入枯草芽胞桿菌益生菌中，能使菌體蛋氨酸含量提高20.51%[10]。

培育的轉(zhuǎn)基因作物新品種在商品化之前，對(duì)目的基因的整合和表達(dá)情況的檢測(cè)是必不可少的。外源基因的旁側(cè)序列是針對(duì)不同轉(zhuǎn)化事件的唯一性標(biāo)識(shí)，對(duì)研究轉(zhuǎn)基因作物的遺傳穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)基因作物的產(chǎn)權(quán)保護(hù)、檢測(cè)和監(jiān)管均具有重要價(jià)值[11]。在已知旁側(cè)序列位置的基礎(chǔ)上建立事件特異性檢測(cè)方法是區(qū)分不同轉(zhuǎn)化事件的高效準(zhǔn)確檢測(cè)方法。Fan等建立了針對(duì)旁側(cè)序列和轉(zhuǎn)基因的事件特異性方法，用于鑒定一個(gè)特定的轉(zhuǎn)基因番木瓜株系。

韓慶梅等[12]研究了高蛋氨酸轉(zhuǎn)AtD-CGS基因大豆后代植株的遺傳穩(wěn)定性。胡英迎等[13]對(duì)轉(zhuǎn)精氨酸酶基因玉米進(jìn)行遺傳特性分析。Liu等[14]研究Bt融合蛋白Cry1Ab/Cry2Aj基因在轉(zhuǎn)基因玉米事件ZD12-6中可在不同世代下穩(wěn)定表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)室前期將10 kD玉米醇溶蛋白進(jìn)行密碼子改造，并融合大豆球蛋白2基因啟動(dòng)子，篩選標(biāo)記基因?yàn)锽ar，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入到受體品種‘東農(nóng)50’中，獲得大量轉(zhuǎn)基因材料。本研究以篩選得到的單拷貝轉(zhuǎn)基因材料GSDH5為試材，基于目的基因的旁側(cè)序列確定其插入位置，并在基因水平、轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平和性狀表現(xiàn)等方面評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因大豆材料的遺傳穩(wěn)定性和性狀表現(xiàn)，建立GSDH5的特異性檢測(cè)方法，為培育高含硫氨基酸轉(zhuǎn)基因大豆新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

轉(zhuǎn)基因大豆材料GSDH5由本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)繁保存，受體品種‘東農(nóng)50’由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

田間試驗(yàn)分別于2018-2019年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)基地進(jìn)行。對(duì)T3、T4代GSDH5及‘東農(nóng)50’采取正常密度人工點(diǎn)播，行距0.5 m，行長(zhǎng)18 m，每4壟為一個(gè)小區(qū)，轉(zhuǎn)基因田間栽培管理按照《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》的要求進(jìn)行。

1.2.1 PCR檢測(cè)提取基因組DNA參考黃宣等[16]優(yōu)化的CTAB法，根據(jù)HSSP基因序列設(shè)計(jì)正反向引物(5′-CAGGGTCTCGCTTCAC-3′和5′-GTCATAGCCATAGGGTTG-3′)，Bar基因序列設(shè)計(jì)正反向引物(5′-TGCCAGTTCCCGTGCTTGAA-3′和5′-CTGCACCATCGTCAACCACTA-3′)進(jìn)行基因組DNA分子檢測(cè)。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.2 Southern blot分析使用DIG DNA Labeling and Detection Kit (Roche)試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行，驗(yàn)證目的基因HSSP在轉(zhuǎn)基因植株基因組中的整合情況。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)采用康為世紀(jì)RNA提取試劑盒提取大豆的總RNA(方法參照說明書進(jìn)行)，反轉(zhuǎn)錄采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行，HSSP基因引物同1.2.1，GmTUA5為內(nèi)參基因，引物序列(5′- ACCACCAGGAACAACAGAAGG-3′和5′-TGCCACCATCAAGACTAAGAGG-3′)，反應(yīng)條件同1.2.1。

1.2.4 Real-time PCR檢測(cè)按照TransStart Top Green qPCR Super Mix Kit(全式金生物)試劑盒說明書進(jìn)行，HSSP基因引物同1.2.1，內(nèi)參基因引物同1.2.3，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s；60 ℃退火30 s。以2-ΔΔCT算法計(jì)算HSSP基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 基因組插入位點(diǎn)分析使用限制性內(nèi)切酶DraⅠ對(duì)基因組DNA進(jìn)行完全酶切，連接Adpator接頭，建立基因組DNA文庫(kù)。以AP1/L1405為引物(GTAATACGACTCACTATAGGGC和CTGCACCATCGTCAACCACTACAT)，進(jìn)行文庫(kù)第一輪擴(kuò)增。以第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，AP2/L997為引物(ACTATAGGGCACGCGTGGTC和CTGGCATGACGTGGGTTTCT)，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，直到得到單一條帶，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)上進(jìn)行Blast比對(duì)。反應(yīng)條件：94 ℃ 25 s，72 ℃ 3 min，7 個(gè)循環(huán)；94 ℃ 25 s，67 ℃ 3 min，32 個(gè)循環(huán)；67 ℃ 7 min。

根據(jù)測(cè)序獲得的旁側(cè)序列，在大豆基因組和外源T-DNA插入位點(diǎn)之間設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物GSDH5-F(TCGTTTCCCGCCTTCAGTTT)和GSDH5-R(GACAGCACAAAGAACGCAGC)，在插入T-DNA區(qū)前的大豆基因組序列上設(shè)計(jì)‘東農(nóng)50’對(duì)照檢測(cè)引物DN50-F(AGCACTGACCGACCAAATGT)和DN50-R(AACTGACTAACCCTTCCGCA)，對(duì)GSDH5轉(zhuǎn)化事件、其他轉(zhuǎn)化事件及非轉(zhuǎn)化事件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.6 Western blot檢測(cè)大豆籽粒研磨成粉末取0.1 g于2 mL EP管中，加入60%乙二醇，震蕩混勻5 min，水浴鍋50 ℃孵育1 h提取種子醇溶蛋白，6 000 r/min離心10 min，取上清液加入SDS上樣緩沖液，煮沸變性5 min。取上清液15 μL于15% SDS-PAGE進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，一抗為HSSP抗血清(1∶500)，二抗為山羊抗兔IgG/HRP(1∶2000)，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液，化學(xué)發(fā)光儀顯影0.1～10 s，拍照。

1.2.7 粗蛋白含量測(cè)定大豆籽粒粉碎后，委托中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所測(cè)定粗蛋白含量。

1.2.8 含硫氨基酸含量測(cè)定大豆籽粒粉碎后，委托中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所測(cè)定含硫氨基酸含量，根據(jù)公式計(jì)算占種子干樣及蛋白的比例。蛋氨酸/胱氨酸占種子干樣/蛋白計(jì)算公式：

粗蛋白在干樣中含量(Z)：Z=Y/(1-X/100)

蛋氨酸/胱氨酸占干樣比例(B)：B=A/(1-X/100)

蛋氨酸/胱氨酸占蛋白比例(C)：C=B/(Z/100)

其中，A為蛋氨酸/胱氨酸占鮮樣比例， Y為粗蛋白含量， X為含水量。

1.2.9 農(nóng)藝性狀調(diào)查大豆成熟、收獲后對(duì)轉(zhuǎn)基因株系GSDH5和受體品種‘東農(nóng)50’進(jìn)行考種，調(diào)查主要的農(nóng)藝性狀。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用 Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因大豆GSDH5的分子檢測(cè)

2.1.1 PCR檢測(cè)對(duì)T1代的GSDH5株系及受體品種‘東農(nóng)50’涂抹靶標(biāo)除草劑草銨膦進(jìn)行初步抗性篩選，對(duì)篩選后呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因大豆株系及受體品種‘東農(nóng)50’提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，陽(yáng)性對(duì)照及轉(zhuǎn)基因大豆均可擴(kuò)增出263 bp的目的基因部分片段(圖1，A)和414 bp的標(biāo)記基因部分片段(圖1，B)，受體品種‘東農(nóng)50’未能擴(kuò)增出任何條帶。結(jié)果表明，外源基因HSSP和篩選標(biāo)記基因Bar成功整合到大豆基因組中。

A、B.T1代植株DNA檢測(cè)(M.DL2000)：+.陽(yáng)性質(zhì)粒；—.東農(nóng)50；A.HSSP基因檢測(cè)(1-8.轉(zhuǎn)基因植株)； B.Bar基因檢測(cè)(1-10.轉(zhuǎn)基因植株)；C、D.T1代植株Southern blot檢測(cè)(M′.DL15000)；C：1-2.東農(nóng)50；3.Xba Ⅰ酶切產(chǎn)物； 4.Hind Ⅲ 酶切產(chǎn)物；D：1.Xba Ⅰ酶切產(chǎn)物；2.Hind Ⅲ 酶切產(chǎn)物；3.東農(nóng)50；E.轉(zhuǎn)基因大豆GSDH5的T-DNA區(qū)圖譜圖1 轉(zhuǎn)HSSP基因材料的分子檢測(cè)A and B. DNA detection of T1 generation plants (M. DL2000): +. Positive plasmid; —. Dongnong 50; A. HSSP gene detection: (1-8. Transgenic plants); B. Bar gene detection (1-10 transgenic plants); C and D. Southern blot detection of T1 generation plants (M′. DL15000). C: 1-2. Dongnong 50; 3. Xba Ⅰ digestion product; 4. Hind Ⅲ digestion product. D: 1.Xba Ⅰ digestion product; 2. Hind Ⅲ digestion product; 3. Dongnong 50. E. T-DNA map of transgenic soybean GSDH5Fig.1 Molecular detection of transgenic HSSP materials

RT.根；SM.莖；LF.葉；FR.花；SD.種子。不同小寫字母表示 基因表達(dá)量在不同組織中有顯著差異(P<0.05)圖2 HSSP基因在轉(zhuǎn)基因大豆不同組織中的表達(dá)量RT. Root; SM. Stem; LF. Leaf; FR. Flower; SD. Seed. Different normal letters indicate that there are significant differences of gene expression levels among different tissues (P< 0.05)Fig.2 Expression of HSSP gene in different tissues of transgenic soybean

2.1.2 Southern blot檢測(cè)為了進(jìn)一步證明外源基因在大豆中的整合情況，確定外源基因的拷貝數(shù)，根據(jù)轉(zhuǎn)基因大豆GSDH5的T-DNA區(qū)圖譜(圖1，E)，選取HindⅢ和XbaⅠ兩種限制性內(nèi)切酶，Bar基因和HSSP基因兩種探針，進(jìn)行Southern blot檢測(cè)。結(jié)果顯示，經(jīng)過酶切的轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA和陽(yáng)性對(duì)照與Bar基因探針/HSSP基因探針雜交后均出現(xiàn)了單一條帶，而受體品種‘東農(nóng)50’無(wú)雜交條帶形成(圖1，C、D)。證明外源基因HSSP以單拷貝的形式整合到大豆基因組中。

2.1.3HSSP基因種子特異性表達(dá)分析提取轉(zhuǎn)基因大豆不同組織部位根、莖、葉、花、種子的RNA，利用Real-time PCR檢測(cè)外源基因HSSP的表達(dá)量，結(jié)果(圖2)表明，在種子中HSSP基因表達(dá)量顯著高于根、莖、葉、花，證明外源基因HSSP在轉(zhuǎn)基因大豆種子中特異性表達(dá)。

2.1.4HSSP基因插入位點(diǎn)分析提取GSDH5的基因組DNA，用DraⅠ進(jìn)行完全酶切，連接Adpator構(gòu)建GSDH5基因組DNA文庫(kù)。以AP1/L1405 為引物，進(jìn)行文庫(kù)第一輪擴(kuò)增(圖3，A)。以第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，AP2/L997為引物，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，得到大約963 bp單一條帶(圖3，B)。第二輪PCR產(chǎn)物回收進(jìn)行測(cè)序。將載體序列去掉后，結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，在GlycinemaxWm82.a2.v1 基因組數(shù)據(jù)中進(jìn)行BLASTN搜索(圖3，C)。結(jié)果表明，該序列與1號(hào)染色體52 873 248～52 873 883 bp匹配，并且落到了非編碼區(qū)域，確定了T-DNA區(qū)插入到大豆1號(hào)染色體基因組的52 873 883 bp處。

2.2 轉(zhuǎn)基因大豆GSDH5遺傳穩(wěn)定性分析

2.2.1 特異性PCR檢測(cè)特異性引物設(shè)計(jì)在轉(zhuǎn)基因大豆GSDH5的外源T-DNA序列和大豆基因組之間，其他轉(zhuǎn)基因材料和受體‘東農(nóng)50’不會(huì)擴(kuò)增出特異性條帶，只有GSDH5能擴(kuò)增出預(yù)期大小約395 bp的片段。而對(duì)照引物設(shè)計(jì)在插入T-DNA區(qū)前的大豆基因組序列上，僅有受體‘東農(nóng)50’能擴(kuò)增出728 bp的片段，轉(zhuǎn)基因材料無(wú)法擴(kuò)增出產(chǎn)物。證明引物對(duì)GSDH5-F/GSDH5-R可以特異性識(shí)別轉(zhuǎn)基因大豆GSDH5(圖4，A)。

2.2.2 RT-PCR檢測(cè)采用RT-PCR檢測(cè)T2、T3和T4代轉(zhuǎn)基因大豆中外源基因HSSP和內(nèi)參基因TUA5的表達(dá)量。結(jié)果(圖4，B)顯示，在大豆籽粒中，外源基因HSSP在轉(zhuǎn)錄水平上穩(wěn)定表達(dá)，且在T2、T3和T4穩(wěn)定遺傳。

2.2.3 Western blot檢測(cè)為檢測(cè)外源基因在翻譯水平上的表達(dá)情況，從T3、T4代轉(zhuǎn)基因大豆GSDH5的成熟籽粒中提取蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)(圖4，C)，GSDH5在10 kD左右出現(xiàn)雜交條帶，而非轉(zhuǎn)基因大豆沒有出現(xiàn)雜交條帶，表明外源基因HSSP在翻譯水平上穩(wěn)定表達(dá)。

綜合上述結(jié)果表明，外源基因HSSP在轉(zhuǎn)基因大豆中穩(wěn)定表達(dá)，并且在T2、T3和T4中穩(wěn)定遺傳。

2.3 轉(zhuǎn)基因大豆GSDH5性狀表現(xiàn)

2.3.1 轉(zhuǎn)基因株系GSDH5的粗蛋白含量測(cè)定T3、T4代轉(zhuǎn)基因大豆GSDH5和受體品種‘東農(nóng)50’的粗蛋白含量。結(jié)果(表1)顯示。在T3代中，測(cè)得‘東農(nóng)50’粗蛋白含量為43.32%，GSDH5粗蛋白含量為43.03%，變幅0.6%。T4代中，‘東農(nóng)50’粗蛋白含量為41.53%，GSDH5粗蛋白含量為40.18%，變幅3%。由于不同植株間粗蛋白含量不同，而蛋白積累也和當(dāng)年的栽培條件、環(huán)境條件直接相關(guān)。本研究中粗蛋白含量并沒有極大改變，沒有達(dá)到影響其品質(zhì)的結(jié)果，而對(duì)于這一性狀的微量改變?cè)?，也需要?duì)其后代進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證。

A、B.GSDH5基因組文庫(kù)巢式PCR結(jié)果。M. DL2000；A.一輪PCR，引物對(duì)AP1/L1405；B. 二輪PCR， 引物對(duì)AP2/L997；C. 測(cè)序結(jié)果Blast 分析圖3 HSSP基因插入大豆基因組旁側(cè)序列分析A and B. Nested PCR results of GSDH5 genome library. M.DL2000; A. The first round of PCR, primer pair AP1/L1405; B. The second round of PCR, primer pair AP2/L997; C. Blast analysis of sequencing resultsFig.3 Analysis of the flanking sequence of HSSP gene inserted into soybean genome

2.3.2 轉(zhuǎn)基因株系GSDH5的含硫氨基酸含量測(cè)定T4代轉(zhuǎn)基因大豆GSDH5和受體品種‘東農(nóng)50’的含硫氨基酸(蛋氨酸、胱氨酸)占種子干樣/蛋白的比例。結(jié)果(表2)顯示，轉(zhuǎn)基因大豆GSDH5中胱氨酸占種子干樣的比例為0.65%，甲硫氨酸占種子干樣的比例為0.70%，與受體品種‘東農(nóng)50’相比占比顯著升高，其中胱氨酸增長(zhǎng)了5%，甲硫氨酸增長(zhǎng)了9%。胱氨酸占種子蛋白的比例為1.52%，甲硫氨酸占種子蛋白的比例為1.62%，與受體品種‘東農(nóng)50’相比顯著升高，其中胱氨酸增長(zhǎng)了10%，蛋氨酸增長(zhǎng)了25%。證明HSSP基因的導(dǎo)入增加了大豆中含硫氨基酸的含量。

2.3.3 主要農(nóng)藝性狀分析為了分析外源基因HSSP的導(dǎo)入是否會(huì)影響轉(zhuǎn)基因大豆的株高、產(chǎn)量等性狀，調(diào)查了T3、T4代轉(zhuǎn)基因大豆GSDH5及受體品種‘東農(nóng)50’的主要農(nóng)藝性狀。結(jié)果(表3)顯示，轉(zhuǎn)基因大豆的結(jié)莢習(xí)性為亞有限性，花色為白色，葉形為長(zhǎng)葉，與受體品種‘東農(nóng)50’表現(xiàn)一致。轉(zhuǎn)基因大豆的生育期在121～125 d，株高略低于受體品種，而單株莢數(shù)高于受體品種，分枝數(shù)和百粒重均與受體品種相近。雖然在株高、單株莢數(shù)方面與受體品種略有差異，但都不存在顯著性。說明外源基因的導(dǎo)入對(duì)大豆植株的生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)不良影響。

表1 GSDH5株系粗蛋白含量

A.T2、T3、T4代植株特異性PCR檢測(cè)：M. DL2000；WT.東農(nóng)50/其他轉(zhuǎn)基因事件；1.轉(zhuǎn)基因植株；2.東農(nóng)50； B.T2、T3、T4代植株RT-PCR檢測(cè)：WT.東農(nóng)50；C. T3、T4代植株Western blot檢測(cè)圖4 轉(zhuǎn)HSSP基因材料遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)A. Detection of plant specific PCR in T2, T3 and T4 generations: M. DL2000; WT. Dongnong 50/other transgenic events; 1. Transgenic plants; 2. Dongnong50; B. Detection of RT-PCR in T2, T3 and T4 generations: WT. Dongnong 50; C. Western blot detection of T3 and T4 generation plantsFig.4 Genetic stability test of HSSP transgenic materials

表2 GSDH5株系含硫氨基酸含量

表3 不同世代轉(zhuǎn)基因株系GSDH5農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果

3 討 論

商業(yè)化的植物轉(zhuǎn)化體均具有良好的遺傳穩(wěn)定性的生物學(xué)特征。目前，已商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因植物一般具有抗蟲、抗病的特性[17-18]。而對(duì)于提高含硫氨基酸的這種營(yíng)養(yǎng)型轉(zhuǎn)基因大豆多數(shù)研究?jī)H停留在得到轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用價(jià)值未見報(bào)道。本研究以轉(zhuǎn)HSSP基因大豆GSDH5為材料，測(cè)得轉(zhuǎn)基因株系中含硫氨基酸占種子干樣/蛋白的比例均顯著升高，證明了通過異源表達(dá)高含硫氨基酸貯藏蛋白基因來提高大豆中含硫氨基酸含量是可行的。

外源基因整合在受體基因組中的位置、拷貝數(shù)是影響外源基因穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的重要因素，在不同世代中，外源基因的遺傳和表達(dá)的變化將影響轉(zhuǎn)基因植株的使用價(jià)值[19]。韓慶梅等[12]對(duì)兩個(gè)世代的高蛋氨酸轉(zhuǎn)基因大豆的目的基因整合情況進(jìn)行分析，證明AtD-CGS基因可在不同的遺傳背景下穩(wěn)定遺傳與表達(dá)。張立堅(jiān)等[20]研究了TaNAC14轉(zhuǎn)基因小麥的遺傳穩(wěn)定性。本研究對(duì)轉(zhuǎn)基因株系GSDH5進(jìn)行PCR、Southern blot檢測(cè)，證明外源基因是以單拷貝的形式成功整合到受體品種大豆基因組中。通過旁側(cè)序列的分析，建立了轉(zhuǎn)基因大豆GSDH5特異性檢測(cè)方法。轉(zhuǎn)化體特異性PCR不僅簡(jiǎn)單快捷，而且具有針對(duì)性，常用于鑒定外源基因在轉(zhuǎn)基因株系后代中的遺傳穩(wěn)定性。RT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，外源基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。在育種方面改變自然規(guī)律而產(chǎn)生毒害作用的報(bào)道出現(xiàn)很多，例如在提高含硫氨基酸含量后導(dǎo)致大豆品系產(chǎn)量低、品質(zhì)性狀下降的現(xiàn)象[21-22]。本研究中轉(zhuǎn)基因大豆在含硫氨基酸提高的基礎(chǔ)上，蛋白含量與受體品種相比有所下降，但是變化極小，沒有達(dá)到影響其品質(zhì)的結(jié)果。Hari B. Krishnan等[23]研究表明，使OASS過表達(dá)能夠增加含硫氨基酸含量，但是會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響。本研究對(duì)植物的農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查分析，在單株莢數(shù)、百粒重、株高、結(jié)莢習(xí)性、花色、葉形等方面均未發(fā)生較大改變，證明HSSP基因的插入沒有導(dǎo)致不良性狀出現(xiàn)。本研究對(duì)生產(chǎn)具有高甲硫氨酸含量并對(duì)其種子活力，植物生長(zhǎng)和生產(chǎn)力造成最小干擾的轉(zhuǎn)基因種子提供理論依據(jù)，為營(yíng)養(yǎng)型轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了基礎(chǔ)材料。