肖 濤，吳春鋒，陳 晶，陳珊珊，阮丹燕

上海市金山區(qū)亭林醫(yī)院檢驗科，上海 201505

目前，聚合酶鏈反應(PCR)被廣泛應用于疾病診斷[1]，它可對疾病相關(guān)的DNA序列進行體外引物定向酶促擴增[2]，從而具有極高的敏感性和特異性，是基因擴增技術(shù)的一次重大革新[3]。新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)被納入《中華人民共和國傳染病防治法》[4]規(guī)定的乙類傳染病，采用甲類傳染病的預防和控制措施，要求二級以上的綜合性醫(yī)院建立新型冠狀病毒PCR檢測實驗室。上海市金山區(qū)亭林醫(yī)院檢驗科按照國家相關(guān)要求，對PCR實驗室進行了必要的升級改造，結(jié)合新型冠狀病毒檢測中發(fā)現(xiàn)的問題，制訂了相應的新型冠狀病毒PCR檢測操作管理流程，現(xiàn)將新型冠狀病毒PCR實驗室的建設(shè)經(jīng)驗總結(jié)如下。

1 實驗區(qū)域的劃分

為了確保核酸在檢測過程中不受到污染，需要加強實驗防污染的建設(shè)，首先根據(jù)現(xiàn)有的實際情況，因地制宜合理挑選出合適檢測核酸的地方進行規(guī)劃、設(shè)計PCR實驗室；按照《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設(shè)置標準》1.1條[5]，將核酸實驗室大體分為3個獨立的實驗區(qū)，即試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增及產(chǎn)物分析區(qū)；每個實驗區(qū)都是獨立的房間，不同的區(qū)與區(qū)之間有傳遞窗，共有一條長走廊，每個實驗區(qū)有緩沖區(qū)并前后各有一道自動可關(guān)閉門，緩沖區(qū)在兩扇門之間呈“Z”字樣。各實驗區(qū)門上須有一個可視窗，各實驗區(qū)進入實驗室進行操作的走向呈單一方向，并必須遵守：PCR實驗室大門→走廊→外門→緩沖區(qū)→內(nèi)門→實驗區(qū)內(nèi)；4個實驗區(qū)之間的走向應遵循單向的原則[6]：試劑準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增及產(chǎn)物分析區(qū)，不可逆向行走，避免出現(xiàn)交叉污染。實驗室安裝門禁(人臉識別)，并設(shè)有權(quán)限，只允許PCR實驗工作的人員才有資格進入，其他人員一律免入內(nèi)。實驗室的走廊上掛有試劑準備區(qū)制度、標本制備區(qū)制度、擴增及產(chǎn)物分析區(qū)制度等3塊制度牌。見圖1。

1.1實驗室標簽的制作 為了便于區(qū)分每個實驗室的不同，不同的工作區(qū)域使用不同顏色的標簽貼在各實驗區(qū)所用儀器設(shè)備上、穿不同顏色工作服[6]。分別用白、藍、綠、紅等4種顏色制成標本接收區(qū)、試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增及產(chǎn)物分析區(qū)標簽，每個實驗區(qū)都統(tǒng)一按規(guī)定的唯一顏色制作規(guī)格大小相同的標簽貼于本實驗區(qū)的所有器材上。門上應貼有“生物危害標識”，生物安全標識內(nèi)容主要包括生物安全標示、二級生物安全實驗室、實驗室名稱、實驗室負責人、聯(lián)系電話、外來人員未經(jīng)許可嚴禁入內(nèi)等。

2 設(shè)備的配置

2.1試劑準備區(qū)的功能及作用 試劑準備區(qū)主要是進行是實驗試劑的儲存及試驗時的試劑配制等。試劑準備區(qū)儀器、設(shè)備有醫(yī)用冷藏冷凍箱(2～8 ℃)、放入醫(yī)用冰箱的溫度計(-40～40 ℃)、醫(yī)用離心機、振蕩儀、移動紫外線消毒車、移液器(10、20、100、200、1 000 μL)、電子天平、燒杯、量筒、玻璃棒、溫濕度表等。

2.2標本制備區(qū)的功能及作用 標本制備區(qū)主要是進行標本的分裝、加樣離心、核酸提取、樣本的保存等。標本制備區(qū)的主要儀器設(shè)備有醫(yī)用冷藏冷凍箱(2～8 ℃)、存放標本的冰箱、放入醫(yī)用冰箱的溫度計(-40～40 ℃)、全自動核酸提取儀、干式恒溫器、醫(yī)用離心機、振蕩儀、紫外線消毒車、生物安全柜、微型計算機、移液槍、溫濕度表等。

2.3擴增及產(chǎn)物分析區(qū)的功能及作用 擴增及產(chǎn)物分析區(qū)主要是進行核酸擴增實驗，以及對擴增產(chǎn)物的分析檢測等。擴增及產(chǎn)物分析區(qū)主要儀器設(shè)備有核酸分析儀(熒光PCR分析儀)、移動紫外線消毒車、微型計算機、醫(yī)用冷藏冷凍箱、移液槍、溫濕度表、溫度計等。見圖1。

圖1 PCR實驗室的平面圖

3 人員的配備

人員是實驗室關(guān)鍵的一環(huán)。根據(jù)實驗的需要，配備一定數(shù)量的人員(至少兩名檢驗專業(yè)中級職稱的人員并持有PCR上崗證)，在經(jīng)驗豐富、中級或以上職稱的人員中挑選業(yè)務水平較好的，并具有PCR資格證的人擔任此實驗室的負責人，或由該實驗組組長負責實驗室和PCR工作人員的管理[7]。PCR實驗室工作人員須參加國家衛(wèi)生健康委員會或上海市臨床檢驗中心舉辦的醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗技術(shù)實驗人員上崗培訓，經(jīng)理論培訓學習，通過理論考試及實踐考核合格后，取得PCR上崗證[8]；新取得PCR上崗證人員需在老員工的指導下進行實驗，或派去已建好PCR實驗室并開展工作且技術(shù)成熟的單位進行學習。在實驗操作時，實驗操作按標準操作規(guī)程進行。

4 環(huán)境的控制

為確保外界空氣不受污染，根據(jù)傳染病的管理辦法，核酸實驗室標本制備區(qū)、擴增及產(chǎn)物分析區(qū)設(shè)定為負壓，這樣就可以防止室內(nèi)空氣外流。實驗室要保證里面工作人員的舒適性，需安裝空調(diào)，但空調(diào)不能采用中央空調(diào)，不同實驗區(qū)之間是獨立的排風通道，獨立的排風系統(tǒng)，用監(jiān)控系統(tǒng)控制室內(nèi)環(huán)境，系統(tǒng)顯示器安裝在長走廊上，可以不進入實驗區(qū)就可觀看實驗區(qū)內(nèi)的溫度、濕度、負壓等。進出實驗工作區(qū)應做到人、物分離，避免交叉感染，不同實驗區(qū)之間有專用的用品，如手套、鞋套、防護服、帽子、口罩、消毒用品、垃圾桶、拖把等，擺放有序，并貼有本區(qū)專用顏色的標簽，以便于區(qū)分不同實驗區(qū)間的用品。

5 質(zhì)量體系文件的建立與管理

根據(jù)本科室相關(guān)程序文件，核酸實驗室也相繼建立體系文件，包括預防措施管理程序、安全手冊、質(zhì)量手冊、信息系統(tǒng)程序手冊、人員培訓和考核管理程序、環(huán)境設(shè)施管理程序(溫濕度記錄、冰箱溫度記錄、臺面消毒記錄、空氣消毒記錄)、設(shè)備管理程序(儀器、設(shè)備的使用記錄、維護記錄、保養(yǎng)記錄)、標本管理程序、報告審核程序、廢棄物管理程序、消防安全管理程序、事故報告程序、隱私保護手冊、標本管理手冊(主要是標本的接收、運送、檢測、保存、處理)、保密程序(主要對患者的資料信息、原始數(shù)據(jù)及檢測結(jié)果等保密，新型冠狀病毒PCR工作人員均有保密的責任)。

6 實驗室生物安全管理

新型冠狀病毒具有傳染性，主要是通過呼吸道飛沫傳播和接觸性傳播[9]，檢測操作會與標本直接性接觸，進入PCR實驗的前后都須嚴格按照規(guī)范做好防護[10]，對儀器和物體表面、地面、標本轉(zhuǎn)運箱、空氣、防護服、手套等進行消毒處理，廢棄物統(tǒng)一放在高壓蒸汽滅菌鍋里進行有效的消毒滅菌，從而有效避免二次污染。

7 新型冠狀病毒PCR檢測的質(zhì)量控制

7.1儀器、設(shè)備 對儀器、設(shè)備定期進行校準，保證儀器、設(shè)備正常運行，登記每天儀器、設(shè)備的運行情況和保養(yǎng)、維修記錄等。

7.2試劑 檢測試劑是檢測中必備的一環(huán)。為確保檢測結(jié)果的準確性，更換新試劑時，應對新批號試劑進行驗證，并保存原始記錄及登記。

7.3環(huán)境因素 檢測時，環(huán)境也會對結(jié)果有一定的影響，如濕度、溫度、污染等。每天都須對濕度、溫度進行登記。

7.4人員操作 工作人員要嚴格按操作流程進行規(guī)范操作，加強學習、培訓[11]。

7.5室內(nèi)質(zhì)控 應每天進行室內(nèi)質(zhì)控評估。室內(nèi)質(zhì)控是保證實驗結(jié)果可靠、準確的一項工作[12]，是對該實驗室檢測前、中、后過程的評估。

7.6室間質(zhì)控 須定期參加室間質(zhì)控，使本實驗室檢測的結(jié)果與其他實驗室的結(jié)果有可比性，符合上海市臨床檢驗中心的要求。

8 結(jié) 語

本院新型冠狀病毒PCR實驗室在區(qū)域劃分、設(shè)備配置、人員配備、環(huán)境控制、質(zhì)量管理等方面都得到了合理配置或嚴格管理，可以更好地為患者服務，同時為其他新型冠狀病毒PCR實驗室的建設(shè)提供參考。