曾婭莉，李明珍，蒲 琴，蔣正方，周 云，鄧建軍，蔣 奕，張 旭，楊 潔，陳孝剛，馬 驥

四川綿陽四0四醫(yī)院檢驗(yàn)科，綿陽四川 621000

提高新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)患者的檢出率，積極檢出感染者，隔離傳染源，切斷傳播途徑是其最重要的防治措施[1-2]。 根據(jù)診療方案，采用實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)核酸水平是COVID-19的實(shí)驗(yàn)室確診方法，也用于判斷COVID-19患者是否可以出院。qRT-PCR技術(shù)被廣泛地應(yīng)用，但其結(jié)果受標(biāo)本影響大，其對COVID-19的檢出率不夠理想，給COVID-19的診治帶來很大困擾。SARS-CoV-2 IgM抗體是《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中的一般實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)檢測項(xiàng)目，它檢出率高，所測標(biāo)本為血液，容易采集，技術(shù)要求比qRT-PCR低，目前已在臨床推廣并使用。本課題組連續(xù)3 d采集本院收治的15例確診COVID-19患者的血液、晨痰、咽拭子、唾液及晨尿5種標(biāo)本；qRT-PCR檢測上述5種標(biāo)本的SARS-CoV-2核酸水平；同時連續(xù)3 d檢測患者血漿SARS-CoV-2 IgM抗體；然后對以上試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了分析，旨在提高COVID-19的檢出率，減少漏診或誤診。

1 資料與方法

1.1一般資料 將于本院治療的確診COVID-19患者15例納入研究作為患者組，診斷標(biāo)準(zhǔn)為《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第五版)》[3]?；颊?號是危重性， 2號是重型，3～15號為普通型，住院時間1～15 d。另外，將排除其他疾病的體檢健康者15例納入研究作為對照組。

1.2儀器與試劑 EXDAN/RNA核酸提取試劑購自蘇州天隆生物科技有限公司；qRT-PCR法檢測SARS-CoV-2核酸的試劑盒有兩種,分別為上海之江生物科技股份有限公司的產(chǎn)品(以下簡稱之江試劑)和圣湘生物科技股份有限公司的產(chǎn)品(以下簡稱圣湘試劑)；膠體金法檢測SARS-CoV-2 IgM抗體的試劑盒為珠海麗珠試劑股份有限公司產(chǎn)品。采用的實(shí)時熒光定量PCR儀為美國ABI公司的ABI7500Fast型和上海宏石醫(yī)療科技有限公司的SLAN-96P型。用天隆PANA9600S全自動核酸工作站(西安天隆科技有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行核酸提取操作。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本的采集 連續(xù)3 d，每天早晨7:00-8:00采集5種標(biāo)本。血液標(biāo)本：取患者空腹全血2～3 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管。 痰液標(biāo)本：患者漱口后取晨痰于滅菌杯。 咽拭子標(biāo)本：無菌拭子在患者雙咽側(cè)扁桃體及咽后壁擦拭3次，然后留取標(biāo)本于病毒保存管。 尿液標(biāo)本：取患者晨尿10 mL于一次性尿液采樣管。 唾液標(biāo)本：患者晨起漱口，翹舌，取1～2 mL唾液于滅菌杯。以上標(biāo)本均在2 h內(nèi)送檢。

1.3.2qRT-PCR法測SARS-CoV-2核酸水平 (1)試劑準(zhǔn)備：嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。(2)標(biāo)本前處理：血漿，4 000 r/min離心10 min，分離血漿備用；痰液，56 ℃滅活40 min，加入1∶1或1∶2的病毒保存液，充分振蕩直至呈液滴狀，取上述液體500 μL， 3 500 r/min離心3 min，留取上清液備用；咽拭子，56 ℃滅活40 min，充分振蕩混勻后，吸取800 μL標(biāo)本，12 000 r/min離心5 min，去除上清液500 μL，振蕩混勻下層液體備用；尿液，取5 mL，56 ℃滅活40 min，4 000 r/min離心5 min，去除上清液，留取下層尿液300 μL，加入1 mL生理鹽水混勻，12 000 r/min離心5 min，去除上清液，留取下層液體約300 μL備用；唾液，56 ℃滅活40 min，加入1∶1的病毒保存液，充分振蕩直至呈液滴狀備用。(3)提取核酸：吸取上述處理好的標(biāo)本300 μL于1.5 mL離心管中，用天隆PANA9600S全自動核酸工作站提取核酸。(4)加樣：圣湘試劑，吸取20 μL待測核酸加入30 μL PCR-混合液的擴(kuò)增管中，蓋上管蓋，振蕩混勻，瞬時離心，準(zhǔn)備上機(jī)擴(kuò)增；之江試劑，吸取5 μL核酸加入20 μL PCR-混合液的擴(kuò)增管中，蓋上管蓋，振蕩混勻，瞬時離心，準(zhǔn)備上機(jī)擴(kuò)增。(5)PCR擴(kuò)增：按圣湘試劑說明書設(shè)置擴(kuò)增條件，選擇VIC 通道檢測內(nèi)標(biāo)物，選擇FAM通道檢測ORF-1ab閱讀框,ROX通道檢測N基因；50 ℃ 30 min，95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)數(shù)45；25 ℃ 10 s；運(yùn)行反應(yīng)。按之江試劑說明書設(shè)置擴(kuò)增條件,選擇CY5通道檢測內(nèi)標(biāo)物，選擇FAM通道檢測ORF-1ab閱讀框，VIC通道檢測N基因，TEXAS RED通道檢測E基因；45 ℃ 10 min，95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，循環(huán)數(shù)45；40 ℃，10 s；運(yùn)行反應(yīng)。(6)結(jié)果判斷：圣湘試劑，F(xiàn)AM 和ROX通道檢測到典型的S型擴(kuò)增曲線且Ct≤40的標(biāo)本為SARS-CoV-2陽性， Ct>40的標(biāo)本為SARS-CoV-2陰性；上海之江試劑，F(xiàn)AM、VIC、TEXAS RED通道檢測到典型的S型擴(kuò)增曲線且Ct≤43的標(biāo)本為SARS-CoV-2陽性，Ct>43或無數(shù)值的標(biāo)本為SARS-CoV-2陰性。若患者某一種標(biāo)本的核酸檢測陽性次數(shù)≥1，則判定該患者可被這種標(biāo)本的SARS-CoV-2核酸檢測檢出。某一種標(biāo)本的核酸陽性檢出率=該標(biāo)本的核酸陽性例數(shù)/確診COVID-19患者例數(shù)×100%。

1.3.3膠體金法檢測血漿SARS-CoV-2 IgM抗體 平衡試劑盒至室溫，采集2～3 mL全血于EDTA抗凝試管，4 000 r/min，離心10 min，分離血漿。生物安全柜內(nèi)取血漿10 μL滴于加樣孔，滴加2～3滴標(biāo)本稀釋液，室溫放置15 min，肉眼觀察結(jié)果。質(zhì)控線和檢測線同時出現(xiàn)即可判為結(jié)果陽性；僅出現(xiàn)一條質(zhì)控線，不出現(xiàn)檢測線，則結(jié)果為陰性?；颊哐錓gM抗體檢測結(jié)果≥1次陽性，判定該患者SARS-CoV-2 IgM抗體陽性。IgM抗體陽性檢出率=IgM抗體陽性例數(shù)/確診COVID-19患者例數(shù)×100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用Excel和SPSS23.0軟件進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1患者1次檢測5種標(biāo)本的SARS-CoV-2核酸陽性檢出率 1次檢測5種標(biāo)本對患者SARS-CoV-2核酸的陽性檢出率：痰46.66%，咽拭子40.00%，血液13.33%，唾液33.33%，晨尿0，除晨尿外COVID-19患者的痰、咽拭子、唾液和血液標(biāo)本均可檢出SARS-CoV-2核酸，痰標(biāo)本的陽性檢出率最高，血液標(biāo)本最低。1次采集1號重型和2號危重型患者的5種標(biāo)本的SARS-CoV-2核酸陽性檢出率均為80.00%，普通型患者為20.00%或0，見表1。危重型或重型患者標(biāo)本的SARS-CoV-2核酸陽性檢出率高于普通型患者(P<0.05)。

表1 1次采集15例COVID-19患者的5種標(biāo)本的SARS-CoV-2核酸檢測情況

2.2患者1次檢測SARS-CoV-2 IgM抗體的陽性率 對照組血漿SARS-CoV-2 IgM抗體的陽性率為0，患者組陽性率為93.33%，兩組間陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 兩組人群1次檢測血漿SARS-CoV-2 IgM抗體的結(jié)果[n(%),n=15]

2.3連續(xù)3次檢測的陽性檢出率 連續(xù)3次(每天1次)采集5種標(biāo)本進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測，各標(biāo)本的SARS-CoV-2核酸陽性檢出率：痰80.00%，咽拭子66.66%，血液13.33%，唾液60.00%，晨尿0。痰、咽拭子和唾液的SARS-CoV-2核酸陽性檢出率均較1次檢測提高。連續(xù)3次與1次檢測確診患者的血漿SARS-CoV-2 IgM抗體陽性率相同，除9號患者外，其余患者均檢測出IgM抗體，陽性率93.33%(14/15)，見表3。SARS-CoV-2 IgM抗體陽性檢出率高于SARS-CoV-2核酸陽性檢出率(P<0.05)。9號患者SARS-CoV-2 IgM抗體呈陰性，但該患者痰標(biāo)本SARS-CoV-2核酸陽性。若SARS-CoV-2核酸與IgM檢測聯(lián)合，多次多部分采集SARS-CoV-2核酸標(biāo)本，15例COVID-19患者的檢出率為100.00%，高于兩種方法單獨(dú)使用(P<0.05)。

表3 COVID-19患者連續(xù)3次檢測IgM抗體和5種標(biāo)本SARS-CoV-2核酸的情況

3 討 論

COVID-19的實(shí)驗(yàn)室特異性檢測方法主要有兩種，一種是SARS-CoV-2核酸檢測，另一種是SARS-CoV-2 IgM抗體檢測[5]。核酸檢測具有特異性強(qiáng)、靈敏度高，感染早期即可檢出，無窗口期等優(yōu)點(diǎn)[6]， 因此核酸結(jié)果對COVID-19的診斷和療效判斷至關(guān)重要[4-5]。但SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果受標(biāo)本采集影響大，容易出現(xiàn)假陰性，而且目前實(shí)驗(yàn)室對檢測標(biāo)本的類型要求不統(tǒng)一，有痰、咽拭子、鼻咽拭子、糞便或血液等標(biāo)本類型，標(biāo)本類型對核酸檢測結(jié)果的影響尚不清楚。SARS-CoV-2 IgM抗體是SARS-CoV-2感染的早期指標(biāo)，當(dāng)患者感染SARS-CoV-2的 3～5 d后可出現(xiàn)IgM抗體[7]。SARS-CoV-2 IgM抗體檢測的優(yōu)點(diǎn)是方便、快捷，標(biāo)本容易采集，結(jié)果相對穩(wěn)定，陽性率高，但I(xiàn)gM抗體產(chǎn)生有窗口期，易受其他免疫性疾病的干擾。本研究選取了15例確診COVID-19患者，同時采集了患者的5種標(biāo)本，1次和連續(xù)3次檢測患者的SARS-CoV-2核酸、SARS-CoV-2 IgM抗體，分析了不同標(biāo)本、檢測次數(shù)對核酸檢測結(jié)果的影響，比較了兩種方法對COVID-19患者的檢出效果，探討了提高COVID-19實(shí)驗(yàn)室檢出率的方法。

本研究中，1次檢測患者5種標(biāo)本SARS-CoV-2核酸的檢出率均小于50%。患者5種標(biāo)本的SARS-CoV-2核酸檢測陽性檢出率由高到低依次為痰、咽拭子、唾液、血漿、晨尿，其中痰標(biāo)本的陽性檢出率最高。因此，如果沒有肺泡灌洗液，COVID-19患者核酸檢測標(biāo)本應(yīng)優(yōu)先選用深部痰液，這與COVID-19相關(guān)診療方案推薦的核酸檢測標(biāo)本一致[7-8]。15例COVID-19患者中，僅危重型與重型患者的血漿標(biāo)本檢出SARS-CoV-2核酸，普通型患者的血液標(biāo)本未檢出，可見血液標(biāo)本用于核酸檢測僅適用于重型或危重型患者。另外，本研究檢測到患者唾液標(biāo)本SARS-CoV-2核酸陽性，說明SARS-CoV-2可通過飛沫進(jìn)行傳播。

SARS-CoV-2IgM抗體檢測的陽性率高，特異性強(qiáng)，但I(xiàn)gM抗體是疾病感染的早期指標(biāo)，有窗口期，在體內(nèi)時間短，容易消失，容易被其他免疫性疾病干擾[9-11]。本研究僅1例患者未檢出SARS-CoV-2IgM抗體，經(jīng)調(diào)查該患者為發(fā)病時間2d的老年患者。本研究的15例COVID-19患者的SARS-CoV-2IgM抗體陽性檢出率高達(dá)93.33%，明顯高于SARS-CoV-2核酸的陽性檢出率。連續(xù)3次檢測患者SARS-CoV-2IgM抗體陽性率無變化，結(jié)果穩(wěn)定。若只以SARS-CoV-2IgM抗體作為COVID-19的篩查指標(biāo)，會發(fā)生漏檢的風(fēng)險(xiǎn)，或因其他免疫疾病的干擾而出現(xiàn)假陽性。連續(xù)3次取患者5種標(biāo)本檢測SARS-CoV-2核酸，痰、咽拭子和唾液標(biāo)本的陽性檢出率明顯提高，但仍有漏檢的情況。本研究中，連續(xù)3次采集5種標(biāo)本檢測SARS-CoV-2核酸的同時檢測患者血漿SARS-CoV-2IgM抗體，對COVID-19患者的檢出率能達(dá)到100.00%。因此，多次多部位采集標(biāo)本，兩種方法聯(lián)合檢測用于COVID-19診斷的效果最佳。

綜上所述，如無法采集肺部灌洗液，檢測SARS-CoV-2核酸的最佳標(biāo)本為患者深部的痰液，咽拭子和唾液標(biāo)本作為補(bǔ)充，血液標(biāo)本僅適用于重型或危重型患者。多次多部位采樣患者標(biāo)本進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測，聯(lián)合SARS-CoV-2 IgM抗體檢測，可大大降低COVID-19患者漏檢率。