郭壯波 張銳 李燕威

（1廣東省廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院急診科 廣州510220；2廣東省廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院中心ICU 廣州510220）

有研究表明,膿毒癥（Sepsis）是一種由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征,嚴(yán)重者可致全身多臟器衰竭,甚至死亡[1]。其中急性肺損傷（Acute Lung Injury, ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS）是膿毒癥患者的重要死因,表現(xiàn)為患者出現(xiàn)急性呼吸衰竭,急性肺實(shí)質(zhì)及肺血管損傷等[2]。有研究表明,自噬異常與多種疾病的發(fā)生相關(guān),如癌癥、免疫系統(tǒng)疾病等[3～4]。自噬與膿毒癥的相關(guān)性也有多種研究證實(shí),自噬對膿毒癥具有一定的內(nèi)源性保護(hù)作用[5]。miRNA是一種非編碼RNA,長度多在20～24個(gè)核苷酸,主要通過競爭性結(jié)合mRNA并抑制其翻譯而發(fā)揮作用,并在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[6]。有研究表明,miRNA-191-5p在腫瘤及神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要作用,在膿毒癥急性肺損傷中的作用尚無相關(guān)研究,所以本研究旨在通過檢測臨床膿毒癥急性肺損傷患者血清miRNA-191-5p表達(dá)量與自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白 1輕鏈 3（Microtubule-associated Protein 1 Light Chain 3, MAPLC3）及Beclin-1的相關(guān)性,分析其對膿毒癥急性肺損傷患者的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下:

1 資料與方法

1.1 一般資料以及血樣采集 本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者及家屬簽署知情同意書。選取2017年1月～2019年5月收治的確診為膿毒癥急性肺損傷患者80例,住院期間接受標(biāo)準(zhǔn)化治療。記錄所有患者年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、心率、呼吸及體溫,采集患者入院第2天空腹靜脈血10 ml于血清分離膠采血管,上下混勻,靜置20 min,3 000 r/min離心5 min。在4℃環(huán)境中轉(zhuǎn)移血清于凍存管中,保存于-80℃冰箱待檢。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):符合膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；符合2012年ARDS柏林診斷標(biāo)準(zhǔn)[8],確認(rèn)并發(fā)急性肺損傷。排除標(biāo)準(zhǔn):其他系統(tǒng)并發(fā)器官衰竭；長期接受免疫治療；伴有肝臟、腎臟等重要器官疾??；患者及家屬拒絕入組。

1.3 主要試劑 PCR引物購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒、SYBR Premix Ex Taq TMII試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.4 qRT-PCR檢 測miRNA-191-5p、MAPLC3、Beclin-1在血樣中的表達(dá)量 4℃環(huán)境處理血樣,加入1 ml Trizol溶液（invitrogen公司）進(jìn)行RNA裂解血樣,按照Trizol說明書提取血樣總RNA,然后使用nanodrop測定RNA的濃度以及純度,純度在1.8～2.2可用。使用TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑并按照產(chǎn)品說明書合成cDNA以備用。見表1。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系,反應(yīng)體系包括:2×SYBR Green Qpcr Master Mix 10μl,1μl上游引物,1μl下游引物,7μl的ddH2O,1μl的模板cDNA,總反應(yīng)體系20μl。

表1 引物序列表

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料采用（±s）表示,應(yīng)用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用%表示,應(yīng)用χ2檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-191-5p表達(dá)量經(jīng)檢測,患者miRNA-191-5p表達(dá)量分布如下。見圖1。根據(jù)miRNA-191-5p表達(dá)量中位數(shù),分為miRNA-191-5p高表達(dá)組和低表達(dá)組,每組40例。

圖1 miRNA-191-5p表達(dá)量分布

2.2 miRNA-191-5p高表達(dá)組和低表達(dá)組一般資料比較 經(jīng)檢測,兩組患者的基線資料如下,兩組患者在年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、心率、呼吸及體溫比較無顯著差異（P＞0.05）。見表2。

表2 miRNA-191-5p高表達(dá)組和低表達(dá)組一般資料比較(±s)

表2 miRNA-191-5p高表達(dá)組和低表達(dá)組一般資料比較(±s)

指標(biāo) miRNA-191-5p高表達(dá)組（n＝40）miRNA-191-5p低表達(dá)組（n＝40） t/χ2 P年齡（歲）性別（例） 男女體質(zhì)指數(shù)（kg/m2）心率（次/min）呼吸（次/min）體溫（℃）40.56±19.87 21 19 20.34±2.87 90.45±3.45 30.87±4.56 38.38±4.16 41.08±18.45 18 22 20.38±3.08 91.03±2.87 31.05±5.02 38.65±3.85 0.121 3 0.450 0 0.060 1 0.817 4 0.167 9 0.301 3 0.903 8 0.502 0 0.952 2 0.416 2 0.867 1 0.764 0

2.3 miRNA-191-5p高表達(dá)組和低表達(dá)組的MAPLC3、Beclin-1表達(dá)量 分別檢測miRNA-191-5p高表達(dá)組和低表達(dá)組MAPLC3及Beclin-1及表達(dá)量。見圖2。miRNA-191-5p高表達(dá)組的MAPLC3、Beclin-1表達(dá)量均高于miRNA-191-5p低表達(dá)組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖2 MAPLC3表達(dá)量

圖3 Beclin-1表達(dá)量

3 討論

膿毒癥多因感染引起,導(dǎo)致機(jī)體功能紊亂,多器官發(fā)生衰竭風(fēng)險(xiǎn),其中肺臟最易受損,所以膿毒癥急性肺損傷或者進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征是臨床較常見的癥狀,加大了臨床治療膿毒癥的難度,患者死亡率也有所增加[9]。miRNA是一種長度20～24個(gè)核苷酸的非編碼RNA,可以通過與mRNA競爭性結(jié)合,調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯,從而參與多種生物進(jìn)程,在多種信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用,與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。自噬廣泛分布于機(jī)體,參與維持機(jī)體代謝平衡、物質(zhì)代謝與更新等,并且會(huì)隨著機(jī)體變化有相應(yīng)的適應(yīng)[10]。自噬可以促進(jìn)物質(zhì)的循環(huán)利用,對破損細(xì)胞器進(jìn)行清除,有效促進(jìn)細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。Beclin-1是酵母自噬相關(guān)蛋白基因（Autophagy-related Gene, ATG）6同系物,MAPLC3是ATG8基因同源物,在哺乳動(dòng)物體內(nèi)調(diào)節(jié)自噬,Beclin-1調(diào)節(jié)自噬體的定位,MAPLC3調(diào)節(jié)自噬體的形成,可與自噬泡膜表面結(jié)合,二者可以作為自噬體的特異性標(biāo)志蛋白。miRNA作為一種在真核生物中的發(fā)揮結(jié)合抑制作用的單鏈非編碼RNA,在人體內(nèi)廣泛存在[11]。已有多種研究發(fā)現(xiàn)早期膿毒癥患者中的miRNA與自噬相關(guān),但miRNA-191-5p的相關(guān)研究還沒有。本研究通過應(yīng)用RNA提取、RNA逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR檢測膿毒癥急性肺損傷患者miRNA-191-5p與MAPLC及Beclin-1表達(dá)水平,并進(jìn)一步分析其表達(dá)量之間的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn),miRNA-191-5p的表達(dá)量與MAPLC及Beclin-1 mRNA表達(dá)水平相關(guān)。說明miRNA-191-5p可能與自噬相關(guān),高表達(dá)量可以促進(jìn)自噬發(fā)生。MAPLC及Beclin-1是用于監(jiān)測自噬水平的重要標(biāo)志物。自噬可以調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng),當(dāng)膿毒癥發(fā)生時(shí),機(jī)體受到重創(chuàng),更高的自噬水平可以保護(hù)機(jī)體,協(xié)助機(jī)體調(diào)節(jié)自身狀態(tài),促進(jìn)機(jī)體穩(wěn)態(tài)的恢復(fù),保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。除此之外,自噬的發(fā)生發(fā)展與很多信號(hào)通路相關(guān),之前有研究表明mTOR信號(hào)通路可能與自噬的調(diào)節(jié)有關(guān)[12]。本研究結(jié)果提示miRNA-191-5p與MAPLC及Beclin-1在膿毒癥急性肺損傷相關(guān),為后續(xù)研究提供了一定的基礎(chǔ),miRNA-191-5p有希望成為膿毒癥急性肺損傷進(jìn)一步治療的靶標(biāo)。

綜上所述,miRNA-191-5p在膿毒癥急性肺損傷中與微管相關(guān)蛋白1輕鏈3及Beclin-1相關(guān)。