李 鵬， 張 林， 熊 雪， 向 準(zhǔn)， 楊彝華， 趙曉朋， 廖小鋒， 萬 誠

(1.貴州省生物研究所， 貴陽 550009； 2.貴陽學(xué)院， 貴陽 550005；3.貴州省山地資源研究所， 貴陽 550001)

玉木耳(Auriculariacorneavar. Li)屬木耳目(Auriculariales)，木耳科(Auriculariaceae)，木耳屬(Auricularia)，是同屬中毛木耳(Auriculariapolytricha)的白色變種，是經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)李玉院士團隊雜交改良后的能穩(wěn)定遺傳的新品種，除了保持毛木耳抗雜能力強、生物效率高等優(yōu)良特性外，還有高產(chǎn)的特點[1-7]，在同等生產(chǎn)條件下，其產(chǎn)量是黑木耳的近兩倍，成本低，毛利高，經(jīng)濟效益可觀。玉木耳顏色鮮亮，高蛋白、低脂肪，營養(yǎng)及藥用價值豐富，有木耳中的“白富美”之美譽，同毛木耳一樣是藥食兩用的大型真菌[8]。因此，玉木耳作為木耳中的“新貴”，是極具市場潛力的珍稀品種。有研究表明，玉木耳與毛木耳的主要營養(yǎng)性狀有一定差異[9]，但同毛木耳一樣具有降血糖、血脂，提高免疫力及抗氧化能力，改善脂代謝，減輕炎癥，抗腫瘤以及保護酒精所致的肝功能損傷等功效[2-3,10]，長期食用有益于身體健康。目前我國吉林、遼寧、山東等省份已經(jīng)成功推廣[11]，近幾年貴州省安龍縣、播州區(qū)、玉屏縣等地有零星種植。

貴州省委、省政府聚焦決戰(zhàn)決勝脫貧攻堅和鄉(xiāng)村振興，縱深推進農(nóng)村產(chǎn)業(yè)革命，大力推動食用菌產(chǎn)業(yè)裂變發(fā)展；科技興農(nóng)，良種先行，菌種的優(yōu)劣直接影響著食用菌產(chǎn)業(yè)的成敗。伴隨貴州省食用菌產(chǎn)業(yè)的規(guī)模化發(fā)展，保障優(yōu)質(zhì)菌種的大量、快速供應(yīng)顯得尤為重要，進而對菌種的生產(chǎn)工藝、產(chǎn)量和質(zhì)量等提出了更高的要求。為玉木耳能在貴州更好更快的推廣，有必要在確保母種質(zhì)量安全的前提下，篩選出玉木耳菌絲的最適營養(yǎng)條件，確保種源的快速高質(zhì)量供應(yīng)。本試驗對玉木耳進行DNA對比鑒定以確定該種源的可靠，并進一步研究了不同營養(yǎng)條件對其菌絲生長的影響，力求篩選最適的碳源、氮源，為玉木耳優(yōu)質(zhì)母種的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，以期在今后生產(chǎn)實踐中為玉木耳優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化栽培奠定扎實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試玉木耳菌株由貴州省食用菌工程技術(shù)研究中心引進并提供，已于2019年在貴陽市白云區(qū)基地完成品種出菇驗證。

1.2 實驗培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7 H2O 1.5 g，維生素B110 mg，瓊脂粉20 g，去離子水1 000 mL，保持自然pH值。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g，(NH4)2SO42 g，KH2PO41 g，MgSO4·7 H2O 0.5 g，維生素B110 mg，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，保持自然pH值。

1.3 試驗方法

1.3.1菌種活化

制備玉木耳活化培養(yǎng)基平板10個，無菌環(huán)境下將試管母種接種到玉木耳活化培養(yǎng)基上平板上(接種至平板的中心位置)，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)活化8 d。

1.3.2ITS序列分析

采用購自生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取分離純化真菌基因組DNA，提取之后的DNA選用真菌通用引物(ITS 1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS 4：TCCTCCGCTTATTGATATGC)進行PCR擴增。采用25μL的PCR反應(yīng)體系：Template(基因組20～50 ng·μL-1)0.5μL；10×Buffer(和Mg2+)；dNTP(各2.5 mmol·L-1)1μL；Taq0.2μL；F(10μM)0.5μL；R(10μmol·L-1)0.5μL；加雙蒸水至25μL。反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45個循環(huán)，55 ℃退火45個循環(huán)，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸8 min，4 ℃終止反應(yīng)保存。擴增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳檢測擴增結(jié)果后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序后登陸GenBank對比，通過BLAST對測序結(jié)果進行比對分析，下載最相近菌株的ITS rDNA序列，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3不同碳源試驗

以玉木耳基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，分別以等量果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉及糊精代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，作為不同碳源培養(yǎng)基，每個處理5次重復(fù)，將玉木耳活化后的備用平板用5 mm的打孔器將菌落打成圓片，然后接種于不同碳源平板的中心位置，25 ℃條件下培養(yǎng)10 d，并采用劃線法每日標(biāo)記菌落直徑(十字交叉法)，每24 h測量一次，測量菌落直徑，同時記錄菌絲萌發(fā)時間。菌絲鋪滿三分之二以上平板時，觀察記錄菌落的菌絲形態(tài)、色澤、菌落形狀、菌絲長勢和邊緣特征等，用“+”、“-”表示菌絲的長勢，“+”越多表示菌絲生長得越好、越健壯、均勻，“-”表示菌絲不生長。實驗數(shù)據(jù)采用PASW Statistics 18.0統(tǒng)計軟件進行分析。

1.3.4不同氮源試驗

以等量的硝酸鉀、尿素、玉米漿、豆粕粉、酵母浸粉、谷氨酸、蛋白胨、酵母膏、麥麩皮分別代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源硫酸銨，每個處理5次重復(fù)，25 ℃條件下培養(yǎng)，后續(xù)操作同1.3.3。

1.3.5不同溫度試驗

將菌絲長至平板三分之二的活化平板用5 mm的打孔器將菌落打成圓片，然后接種于玉木耳活化培養(yǎng)基上，將接種好的平板分別放置在15 ℃、18 ℃、20 ℃、23 ℃、25 ℃、27 ℃、30 ℃、35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理5次重復(fù)，后續(xù)操作同1.3.3。

1.3.6最佳碳氮源濃度組合

選定適宜碳源可溶性淀粉、蔗糖，氮源豆粕粉、蛋白胨，采用 L9(34) 正交表進行正交試驗(即可溶性淀粉為10、20、30 g三個水平，蔗糖為5、10、15 g三個水平，豆粕粉為1.5、2.0、2.5 g三個水平，蛋白胨為1.5、2.0、2.5 g三個水平)，以不含碳源、氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，組合成供試培養(yǎng)基，見表1。其中選取的2個適宜碳源、氮源作為試驗的四因素，每因素設(shè)計3個水平，得到9個試驗組，每組5個平行，置25 ℃條件下培養(yǎng)，后續(xù)操作同1.3.3。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table 單位：g·L-1

經(jīng)碳、氮源正交試驗得到該水平最優(yōu)組合培養(yǎng)基，若組合不在試驗處理中，則進行驗證培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的提取及ITS序列分析

試驗樣品由生工生物工程(上海)股份有限公司做分子鑒定檢測，經(jīng)PCR擴增和序列測定，結(jié)果顯示，玉木耳IS 00049-1、IS 00049-2號的rDNA ITS區(qū)段長度為595 bp、606 bp，所得序列進行Blast搜索，在Blast擊中結(jié)果中下載e值達100%的序列，包含Auriculariapolytricha、Auriculariacornea兩種，均為木耳科木耳屬毛木耳[12-13]。再下載6種不同木耳屬菌株(Auriculariafuslosuccinea、Auriculariareticulata、Auriculariadeicata、Auriculariaamericana、Auricularianigricans和Auriculariavillosula)rDNA序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，本試驗供試的菌株兩次測序結(jié)果均同毛木耳相似性高達99%以上，所以，供試菌株為毛木耳下的一個分支。

2.2 不同溫度條件對玉木耳菌絲生長的影響

結(jié)合表2、圖2可知，在所選溫度培養(yǎng)下，玉木耳菌絲生長差異明顯，溫度對玉木耳菌絲萌發(fā)、生長速度及生長曲線皆有顯著影響，溫度越低，菌絲萌發(fā)耗時越長，生長速度越慢，而隨著溫度的升高，菌絲萌發(fā)時間縮短，日均生長速度呈先升后降的趨勢，其中溫度在15 ℃時，菌絲日均生長速度最慢，僅達2.65 mm·d-1，且長勢最差。溫度在30 ℃時菌絲生長最快，日均生長速度達10.18 mm·d-1，在30 ℃和25 ℃條件下，玉木耳菌落形態(tài)及長勢最佳。溫度在30～35 ℃時，菌絲日均生長速度在p<0.05水平上明顯快于其他溫度，且菌絲長勢也較好。終上所述，玉木耳菌絲在試驗所選溫度條件下均能正常萌發(fā)且生長，在25～35 ℃下生長較好，最佳溫度為30℃，說明玉木耳屬于中高溫型食用菌。

表2 不同溫度條件對玉木耳菌絲生長的影響Table 2 Effect of different temperature on the growth of Auricularia cornea var. Li mycelium

2.3 不同碳源培養(yǎng)基對玉木耳菌絲生長的影響

綜合表3、圖3可知，玉木耳對所選7種不同碳源均能有效吸收，萌發(fā)時間均為48 h，但菌絲日均生長速度差異顯著，菌絲長勢也不同，雖均為白色絨毛狀圓形菌落，但在整齊度、健壯及濃密程度上差異明顯(p<0.05)。以可溶性淀粉、蔗糖為碳源時，玉木耳菌絲生長速度明顯快于其他幾種碳源，其中可溶性淀粉培養(yǎng)下日均生長速度最高(8.04 mm·d-1)，同蔗糖培養(yǎng)下差異顯著(p<0.05)，整體呈現(xiàn)出可溶性淀粉>蔗糖(7.39 mm·d-1)>糊精(6.12 mm·d-1)>麥芽糖(6.03 mm·d-1)>乳糖(4.19 mm·d-1)>葡萄糖(4.18 mm·d-1)>果糖(3.42 mm·d-1)的趨勢，且在糊精和麥芽糖培養(yǎng)下，日均生長速度差異不大(p<0.05)。但從玉木耳菌落長勢上看，可溶性淀粉、蔗糖和麥芽糖為碳源時長勢最好，葡萄糖、果糖、糊精為碳源培養(yǎng)下長勢一般，乳糖培養(yǎng)下菌落長勢最差。且從玉木耳菌絲生長曲線來看(圖3)，可溶性淀粉、蔗糖、糊精、麥芽糖4種碳源培養(yǎng)下玉木耳菌絲生長勢快，葡萄糖、乳糖、果糖3種碳源培養(yǎng)下長勢較緩。故綜合各種指標(biāo)，玉木耳菌絲生長的最佳碳源為可溶性淀粉，其次為蔗糖和麥芽糖。

表3 不同碳源培養(yǎng)基對玉木耳菌絲生長的影響Table 3 Effects of different carbon source media on the growth of Auricularia cornea var. Li mycelium

2.4 不同氮源培養(yǎng)基對玉木耳菌絲生長的影響

選擇11種不同氮源進行試驗，得到玉木耳菌絲生長情況(詳見表4和圖4)。結(jié)合玉木耳生長速度、長勢及生長曲線可知，除氮源為尿素時萌發(fā)需用時72 h外，其他氮源培養(yǎng)下，玉木耳萌發(fā)均只需48 h。且氮源為豆粕粉時，菌絲日均生長速度顯著高于其他氮源(8.42 mm·d-1)，其次為谷氨酸(7.89 mm·d-1)、蛋白胨(7.09 mm·d-1)和酵母膏(7.02 mm·d-1)，硫酸銨培養(yǎng)下玉木耳菌絲日均生長速度最低(5.13 mm·d-1)，且顯著低于其他氮源培養(yǎng)(p<0.05)。而其中以豆粕粉、蛋白胨、酵母膏、酵母浸粉為氮源時，玉木耳菌落形態(tài)、菌絲長勢較好，尿素和硝酸鉀為氮源時菌絲生長最差。且從菌絲生長曲線上看，在氮源為豆粕粉培養(yǎng)下，玉木耳菌絲生長勢最高，氮源為尿素時最低。故綜合玉木耳菌絲日均生長速度、菌落長勢與形態(tài)、菌絲生長曲線可知，玉木耳最適氮源為豆粕粉，其次為蛋白胨、谷氨酸和酵母膏。

表4 不同氮源培養(yǎng)基對玉木耳菌絲生長的影響Table 4 Effects of different nitrogen source media on the growth ofAuricularia cornea var. Li mycelium

2.5 最佳碳氮源濃度組合

選取適宜碳源可溶性淀粉、蔗糖，適宜氮源豆粕粉、蛋白胨建立L9(34)正交表，進行4因素3水平正交試驗，得到該玉木耳菌株萌發(fā)時間仍均需48 h，且菌落均為絨毛狀整齊潔白圓形菌落，菌絲極為健壯且濃密度高(詳見表5)。在正交試驗所有培養(yǎng)基中，玉木耳菌絲生長速度與時間呈正相關(guān)，Y 1、Y 2、Y 3、Y 5處理下菌絲日均生長速度在(p<0.05)水平上顯著高于其他處理，其中Y 3處理下最快(10.73 mm·d-1)，其次為Y 1(10.72 mm·d-1)、Y 2(10.50 mm·d-1)。綜上可得在各實驗處理中，玉木耳生長最佳的組合為Y 3(A1B3C3D3)。

表5 不同濃度碳氮源對玉木耳菌絲體生長的影響Table 5 Effects of different concentrations of carbon andnitrogen sources on the growth of Auricularia cornea var. Li Mycelium

由表6可知，4種因素R值大小為RA>RC>RD>RB，表明各因素對玉木耳菌絲生長速度的影響為A>C>D>B。由表7可知， 4種因素對菌絲生長速度的影響極顯著(p<0.01)，表明4種因素對玉木耳菌絲生長速度均能起到關(guān)鍵作用。即玉木耳菌絲培養(yǎng)過程中，碳源中可溶性淀粉(A因素)為最重要的因素，其次氮源為豆粕粉(B因素)，接著是氮源蛋白胨(B因素)，碳源蔗糖(C因素)影響相對較小。按照各因素的最優(yōu)水平，得到A1B2C3D1水平組合為本試驗的最優(yōu)水平組合，結(jié)合表1可知，該組合為可溶性淀粉10.0 g，蔗糖10 g，豆粕粉2.5 g，蛋白胨1.5 g。但該組合并不在試驗處理中，將通過后續(xù)試驗，驗證A1B2C3D1為玉木耳菌絲培養(yǎng)最佳碳氮組合，該組合驗證得到玉木耳日均生長速度為11.03 mm·d-1，比上述正交試驗處理所得最佳組合Y 3(A1B3C3D3)平均每天高0.30 mm。

表6 碳氮源對玉木耳菌絲體生長的正交分析表Table 6 Orthogonal analysis table of carbon and nitrogen sources on the growth of Auricularia cornea var. Li mycelium

表7 玉木耳正交試驗方差分析Table 7 Auricularia cornea var. Li orthogonal test variance analysis

3 討論與結(jié)論

國內(nèi)市場上的銀白木耳、白木耳、雪耳、玉木耳、白毛木耳等均屬于木耳屬的白色變異菌株，為更好管理市場，李玉院士建議將毛木耳白色變異菌株統(tǒng)一稱為“玉木耳”[7,11]。通過本研究可知，供試菌株與毛木耳相似性高達99%以上，可確定該菌株為毛木耳下的一個分支，說明此菌株來源可靠。進一步研究發(fā)現(xiàn)，玉木耳菌絲生長條件并不苛刻，屬于中高溫型食用菌，適溫范圍較廣，在15～35 ℃均能生長，且在25～35 ℃下較為適宜，其中最適溫度為30 ℃。王月等[5]，林汝楷等[6]，余姚[14]在對玉木耳的栽培要點梳理中得到玉木耳菌絲在8～36 ℃均能生長，且在22～32 ℃下較為適宜，與本研究結(jié)果相近。此外，玉木耳在營養(yǎng)生長過程中對所選7種碳源、11種氮源均能較好的吸收，其中適宜碳源有可溶性淀粉、蔗糖和麥芽糖，最佳為可溶性淀粉。總體而言，多糖及雙糖更易被該菌株分解吸收，葡萄糖、乳糖及果糖等單糖碳源培養(yǎng)時反而生長較慢。適宜氮源有豆粕粉、蛋白胨、酵母膏，最佳為豆粕粉，該菌株對硫酸銨、硝酸鉀、硝酸銨等銨態(tài)氮吸收較差。白背毛木耳也是毛木耳的一個品種，黃藝寧等[15]研究表明，白背毛木耳最佳氮源為蛋白胨、碳源為葡萄糖時長勢較好，為蔗糖時生長較快，該品種在碳、氮源選擇上同本研究有所不同，這說明雖同為木耳屬毛木耳，但不同的品種在對碳氮源的選擇上也是有差異的。張闊譚[16]對第三代雜交白色毛木耳變種的研究中得到其最佳碳氮源分別為葡萄糖和酵母膏。本研究中酵母膏同樣為玉木耳的適宜碳源之一，但最佳碳源的差異很有可能是供試菌株品種不同所致，并且菌絲生長情況受培養(yǎng)基多種因子共同影響，兩研究中最適碳源上的差異也有可能源于供試培養(yǎng)基其他成分。而培養(yǎng)基內(nèi)不同成分影響因子的影響力大小也可通過正交試驗所得[16-17]，但本試驗尚未開展這類研究。本研究主要針對玉木耳適宜的碳源和氮源的選擇進行了正交試驗，分析得到玉木耳最優(yōu)碳氮源組合為A1B2C3D1，即最佳碳氮混合培養(yǎng)基配方為可溶性淀粉10.0 g，蔗糖10 g，豆粕粉2.5 g，蛋白胨1.5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7 H2O 0.5 g，維生素B110 mg，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，為玉木耳優(yōu)質(zhì)母種生產(chǎn)提供理論依據(jù)，以期為玉木耳在貴州的引種示范和規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化推廣奠定基礎(chǔ)。